柳杉属(Cryptomeria)共有柳杉(C. fortunei)和日本柳杉(C. japonica)2个种。柳杉属是常绿乔木，适应性强，栽培面积广，其树姿高大雄伟，树形优美，能净化空气，改善环境，是我国南方主要用材树种。柳杉属植物的天然林主要分布在中国东南的天目山、武夷山、日本本州岛及九州岛等地。柳杉为我国特有树种，在江苏、浙江、福建、安徽、河南以及云贵川等地均有栽培，生长良好(中国科学院中国植物志编辑委员会，1978)。

柳杉属大多采用常规繁育方法。以种子繁育为主，也通过一些扦插的方式进行育苗，但存在着种子萌发率低(大多5%～30%)、出苗不整齐、合格苗率较低等问题(蔡燕康等，2003；刘洪谔，1982；陈岳武等，1982)，且对柳杉的优良性状不能很好地保持。因此利用生物技术方法，开展柳杉的组培快繁技术研究，对柳杉优良无性系的增殖扩繁及资源保护具有重要意义。张翠萍等(2008)以柳杉种胚为外植体，开展了柳杉种苗的快繁技术研究，但无法实现对优良无性系的优良品质的保存和利用。本文以柳杉优良无性系的茎段为组织培养材料，通过正交设计进行多因素的筛选，分析柳杉不同无性系再生能力的差异及其遗传基础，为柳杉无性系增殖扩繁及优良品种的推广提供理论和试验技术的支持。

试验选取6个优良无性系，4个柳杉无性系为3^#(福建溪口)、59^#(浙江石垟)、68^#(福建霞浦)、70^#(福建霞浦)，2个日本柳杉无性系为011^#(日本)、精1^#(日本)，均采自福建省霞浦县杨梅岭林场柳杉资源圃。

取柳杉当年生幼嫩枝条，用去离子水稀释的洗涤剂浸泡30 min后，再用流水冲洗1 h。在无菌条件下，用70%酒精浸泡90 s，再经0.1%HgCl₂分别处理4，6，8，10，12 min，然后用无菌水冲洗3～4次，每次1～2 min (祝晨辰等，2015)。

基本培养基为DCR培养基，并添加了30～40 g·L^-1蔗糖、6.8 g·L^-1琼脂，pH5.6～5.7。选用6-BA(0.1，0.5，1.0 mg·L^-1)、NAA(0.05，0.10，0.20 mg·L^-1)2种生长激素，采用L₉(3⁴)的正交试验设计进行试验(表 1)。每瓶接种2～3个幼芽，每个处理10瓶，重复3次，并计算增殖系数(祝晨辰等，2015)。

表 1 因素与水平 Tab.1 Factors and levels

表 1 因素与水平 Tab.1 Factors and levels 水平 Level 因素Factors 6-BA/(mg·L-1) NAA/(mg·L-1) 1 0.1 0.05 2 0.5 0.10 3 1.0 0.20

生根培养以增殖壮苗为材料，在基本培养基(DCR，1/2DCR，1/4DCR)上添加适宜浓度IBA和NAA进行生根诱导。每个处理接种10个芽，重复3次。30天后观察统计数据。

增殖系数=诱导出的不定芽总数/外植体总数；不定根的诱导频率(%)=生根的芽苗数/不定芽苗总数×100%；平均不定根数=不定根的总数/诱导出不定根的不定芽数；不定根的形成能力(RFC)=平均不定根数×不定根的诱导频率(祝晨辰等，2015)。

将柳杉011^#、精1^#、3^#、59^#、70^#以及68^#无性系组培芽接于DCR基本培养基及不同激素的组合中，培养30天，观察和统计芽的增殖效果(表 2)。结果显示，柳杉不同无性系在9种不同培养基中芽的增殖和生长存在一定差异，组合不一，效果也不一。其中011^#、精1^#、3^#无性系均在DCR+1.0 mg·L^-1 6-BA+0.05 mg·L^-1 NAA(7号培养基)中芽增殖效果最好，芽增殖系数分别达到4.05，5.00和3.93；而70^#、68^#无性系在DCR+1.0 mg·L^-1 6-BA+0.10 mg·L^-1 NAA(8号培养基)中芽增殖效果最佳，其芽增殖系数分别为3.71和3.28；59^#无性系在DCR+1.0 mg·L^-1 6-BA+0.20 mg·L^-1 NAA(9号培养基)中芽增殖效果最佳，其芽增殖系数为3.10。从柳杉不同无性系芽的诱导的生长状况来看，70^#无性系在8号培养基中不定芽叶色翠绿，长势良好(图 1a)；011^#无性系在7号培养基中不定芽生长健壮，叶色翠绿(图 1b)；68^#无性系在8号培养基中芽苗弱小，易黄化，生长状况较差(图 1c)；精1^#无性系在7号培养基中不定芽多为簇生，生长旺盛(图 1d)。

图 1 柳杉不同无性系不定芽诱导 Fig.1 The multiplication of adventitious buds of different clones

表 2 不同无性系在不同激素组合中芽增殖结果 Tab.2 The results of the buds proliferation in different hormone media for different clones

表 2 不同无性系在不同激素组合中芽增殖结果 Tab.2 The results of the buds proliferation in different hormone media for different clones 培养基编号 No. of medium 因子种类Factors 增殖系数Proliferation coefficient 6-BA/(mg·L-1) NAA/(mg·L-1) 3# 59# 68# 70# 011# 精1# 1 0.10 0.05 2.14 2.56 2.25 2.40 2.72 2.58 2 0.10 0.10 1.23 2.70 2.73 2.36 2.87 3.39 3 0.10 0.20 1.92 2.61 2.50 1.78 2.96 2.17 4 0.50 0.05 1.58 2.35 2.31 1.61 3.00 2.66 5 0.50 0.10 2.18 2.88 2.95 2.23 3.12 2.35 6 0.50 0.20 2.38 2.85 2.62 2.87 3.25 4.53 7 1.00 0.05 3.93 2.67 2.57 3.24 4.05 5.00 8 1.00 0.10 3.27 2.45 3.28 3.71 3.36 4.43 9 1.00 0.20 2.36 3.10 3.07 2.64 2.99 3.41

对6个无性系的最佳芽增殖系数的方差分析(表 3)表明，不同无性系间的芽增殖存在着极显著的差异。这说明柳杉不同无性系在茎芽分化和生长上存在着明显的遗传差异。

表 3 不同无性系芽增殖的方差分析 Tab.3 ANOVA of bud propagation for different clones

表 3 不同无性系芽增殖的方差分析 Tab.3 ANOVA of bud propagation for different clones 变异来源 Source of variation 平方和 Squares 自由度 Degree of freedom 均方 Mean squares F 显著度 Significant level(P) 无性系间Among clones 6.827 5 1.365 242.388 0.000 无性系内Within clone 0.068 12 0.006 总变异Total 6.895 17

对6个无性系在适宜的培养基中所得的芽增殖系数进行方差分析(表 4)可知，6-BA以及2种激素的交互作用均对柳杉精1^#无性系芽增殖有极显著的影响，而NAA对其影响不显著，即NAA在一定浓度范围内，精1^#无性系芽增殖的差异性不大；而在011^#，3^#，59^#，70^#，68^#这5个无性系中，6-BA、NAA以及2种激素的交互效应均对各自的芽增殖系数有极显著的影响。

表 4 正交设计方差分析 Tab.4 ANOVA of the orthogonal design

表 4 正交设计方差分析 Tab.4 ANOVA of the orthogonal design 无性系 Clone 变异来源 Source of variation 平方和 Squares 自由度 Degree of freedom 均方 Mean squares F Sig. 3# 6-BA 10.217 2 5.109 281.381 0.000 NAA 0.640 2 0.320 17.638 0.000 6-BA×NAA 5.481 4 1.370 75.469 0.000 误差Error 0.327 18 0.018 59# 6-BA 0.062 2 0.031 6.965 0.006 NAA 0.481 2 0.241 54.007 0.000 6-BA×NAA 0.737 4 0.184 41.327 0.000 误差Error 0.080 18 0.004 68# 6-BA 1.105 2 0.553 86.483 0.000 NAA 1.688 2 0.844 132.141 0.000 6-BA×NAA 0.070 4 0.018 2.744 0.000 误差Error 0.115 18 0.006 70# 6-BA 5.875 2 2.938 504.555 0.000 NAA 0.708 2 0.354 60.807 0.000 6-BA×NAA 4.122 4 1.030 176.983 0.000 误差Error 0.105 18 0.006 011# 6-BA 1.719 2 0.859 82.012 0.000 NAA 0.175 2 0.087 8.332 0.003 6-BA×NAA 1.744 4 0.436 41.612 0.000 误差Error 0.189 18 0.010 精1# 6-BA 11.647 2 5.823 319.378 0.000 NAA 0.008 2 0.004 0.232 0.795 6-BA×NAA 14.543 4 3.636 199.400 0.000 误差Error 0.328 18 0.018

对柳杉各无性系的芽增殖系数进行极差分析(表 5)可知，随着激素浓度的变化，不同无性系的芽增殖系数呈现出不同的变化趋势： 1) 011^#无性系芽增殖能力随着6-BA浓度的升高，增殖系数由2.85增加到3.47；随着NAA浓度升高，增殖系数由3.26下降到3.07；6-BA的极差较大，为0.62，说明6-BA在011^#无性系芽增殖中起主导作用。2)在精1^#无性系芽增殖过程中，6-BA的极差为1.57，NAA的极差为0.04，NAA所起作用比6-BA小，因此，6-BA在精1^#无性系芽增殖中起主导作用。3) 3^#无性系芽增殖过程中，6-BA的极差较大，为1.43，说明6-BA起主导作用，随着6-BA浓度的升高，增殖系数也由1.76增加到3.19；而NAA的极差为0.33，在芽增殖过程中，所起作用较小。4) 59^#无性系芽增殖过程中，6-BA的极差为0.12，NAA的极差为0.32，说明起主导作用的激素是NAA。5) 70^#无性系芽增殖过程中，6-BA的极差为1.02，NAA的极差为0.35，因此，6-BA在芽增殖中起主导作用。6) 68^#无性系芽增殖中，6-BA的极差为0.48，NAA的极差为0.61，说明起主导作用的激素是NAA。

表 5 不同无性系在6-BA和NAA作用下不定芽增殖系数的极差分析^① Tab.5 Range analysis of adventitious buds proliferation of different clones on 6-BA and NAA

表 5 不同无性系在6-BA和NAA作用下不定芽增殖系数的极差分析① Tab.5 Range analysis of adventitious buds proliferation of different clones on 6-BA and NAA 因子 Factors 3# 59# 68# 70# 011# 精1# 6-BA NAA 6-BA NAA 6-BA NAA 6-BA NAA 6-BA NAA 6-BA NAA K1 5.29 7.65 7.87 7.58 7.48 7.13 6.54 7.25 8.55 9.77 8.14 10.24 K2 6.14 6.68 8.08 8.03 7.88 8.96 6.71 8.30 9.37 9.35 9.54 10.17 K3 9.56 6.66 8.22 8.56 8.92 8.19 9.59 7.29 10.40 9.20 12.84 10.11 X1 1.76 2.55 2.62 2.53 2.49 2.38 2.18 2.42 2.85 3.26 2.71 3.41 X2 2.05 2.23 2.69 2.68 2.63 2.99 2.24 2.77 3.12 3.12 3.18 3.39 X3 3.19 2.22 2.74 2.85 2.97 2.73 3.20 2.43 3.47 3.07 4.28 3.37 R 1.43 0.33 0.12 0.32 0.48 0.61 1.02 0.35 0.62 0.19 1.57 0.04 主导因子 Major factor 6-BA NAA NAA 6-BA 6-BA 6-BA   ①Kn为激素在水平n上对应的增殖系数之和；Xn=Kn/3，激素在水平n上对应的增殖系数的平均值；R=Xmax-Xmin。Kn refers to the sum up of proliferation coefficients of the hormone at level n; Xn=Kn/3, which refers to the average value of proliferation coefficients of the hormone at level n; R=Xmax-Xmin.

综上所述，柳杉不同无性系在芽增殖中起主导作用的激素类型存在一定的差异。在柳杉011^#、精1^#、3^#以及70^#无性系芽增殖过程中，起主导作用的因子是6-BA，而在柳杉59^#和68^#无性系芽增殖过程中，起主导作用的因子是NAA。

柳杉不定芽增殖阶段所需时间较长，但增殖系数的幅度有一定差异。连续使用添加激素的培养基继代，发现材料随着继代次数的增加而发生再生繁殖能力降低的现象，主要表现为分化及生长速度减慢，常有叶片变色，且培养基易出现褐化现象。采用添加激素的培养基与基本培养基交替继代的方法，材料生长状况有明显好转，不定芽增殖系数变化的结果如图 2。表现在第1～2次添加激素继代培养，芽生长较慢，增殖系数在3～3.5之间；从第3次添加激素继代开始，芽生长较快且生长健壮，增殖系数也明显提高到4.0以上；继续添加激素继代，增殖系数不再提高甚至出现小幅下降，材料主要表现为新芽的伸长生长。因此，本试验中，以添加激素继代3次为适宜的继代次数。

图 2 继代次数对增殖系数的影响 Fig.2 The effects of subculture times on coefficients of proliferation

将011^#、3^#以及70^#无性系在生根培养基中培养，其生根效果均达到较优水平，但不同无性系之间的最佳生根状况存在一定的差异性(表 6，图 3)。由表 6可知，在生根培养基中诱导生根时，011^#无性系的生根率、平均根数以及不定根形成能力在3个无性系中均处于最高水平，根长多处于2～3 cm范围内(图 3a)；70^#无性系的生根率次之，但平均根数和不定根的形成能力2项指标不及3^#无性系，70^#无性系的根长以2.5～3.5 cm居多(图 3c)；3^#无性系的平均根长达到4 cm以上，但生根率较低，为75.6%(图 3b)。

图 3 柳杉不同无性系根诱导 Fig.3 The rooting inducing of different clones of Cryptomeria

表 6 柳杉不同无性系在培养基中的生根状况 Tab.6 The rooting for different clones of Cryptomeria on media

表 6 柳杉不同无性系在培养基中的生根状况 Tab.6 The rooting for different clones of Cryptomeria on media 无性系号 No. of clones 生根率 Rooting rate(%) 平均根数 Number of roots per shoot 平均根长 Length of roots per shoot/cm 不定根形成能力 Adventitious root forming capacity 011# 84.6 5.7 2.74 4.82 3# 75.6 4.6 4.28 3.48 70# 77.3 3.7 3.17 2.86

6个柳杉无性系经过各自不同激素组合诱导后，不定芽的增殖和生长状况均存在着较大的差异。精1^#无性系的芽增殖在研究的6个无性系中诱导效果最好，芽多为簇生，但随着继代次数的增加，易褐化，其芽增殖系数达到5.00；其次为011^#无性系，其芽茎粗壮，颜色翠绿，生长健壮，其芽增殖系数为4.05；3^#和70^#无性系芽增殖效果也达到了较高水平，芽生长状况也表现较好的状态；而59^#和68^#无性系的芽增殖效果较差，这2个无性系对激素的变化反应不大，但也说明，其固有的生长和增殖性状稳定，有着广泛的适应性(Han et al., 2011)。

通过数据分析可知，不同无性系之间的芽增殖系数存在极显著的差异。引起这些差异的原因，可能是由于不同无性系各自的基因型不同。欧阳磊等(2007)在对杉木(Cunninghamia lanceolata)36个优良无性系组培快繁研究中发现，杉木不同无性系之间的增殖倍数达到极显著水平，得出无性系增殖倍数受本身基因型影响的结论。此结论与本研究中柳杉不同无性系间增殖差异的结果相一致。

研究2种植物激素6-BA和NAA的不同浓度配比在柳杉不同无性系芽诱导过程中的作用发现，激素种类及其组合对柳杉不同无性系的芽诱导有不同的影响，不同无性系的芽增殖及生长均存在较大差异。有研究表明不同品种的外植体其内源激素水平有较大差异(潘瑞炽，2006；马均等，2007)，因此，培养基配方需要根据不同无性系的特性进行优化。

细胞分裂素与生长素在适当的比例将有利于愈伤组织的诱导和组织器官的分化(Han et al., 2011；Murashige et al., 1962)。研究表明，在所试验的6个无性系中，增殖系数均随着6-BA浓度的升高而升高，但随着NAA浓度的升高，不同无性系的芽增殖系数呈现出不同的变化趋势。其中，柳杉011^#、精1^#、3^#无性系的芽增殖系数随着NAA浓度的升高而下降；59^#无性系的芽增殖系数随着NAA浓度的升高也随之升高；而70^#、68^#无性系的芽增殖系数随着NAA浓度的升高呈现出先上升后下降的趋势。

很多报道都提到，一些植物材料的再生繁殖能力会随继代次数的增加而降低，主要表现为分化及生长速度减慢，增殖系数降低，并伴有叶片变色乃至落叶，且培养基褐化现象严重(谢从华等，2004；潘瑞炽，2006)。因此，选择适宜的继代次数既可以提高其增殖率，又可以避免因继代次数过多毒害组培苗。本研究发现，连续使用添加激素的培养基继代，组培苗继代3次后，随着继代次数的增加而发生再生繁殖能力降低的现象。杉木无性系组织培养中，继代培养宜在8～9代为宜(苏秀城，2000)。本试验采用添加激素的培养基与基本培养基交替继代的方法，材料生长状况良好，并且从第3次添加激素继代开始，芽生长较快且生长健壮，增殖系数也明显提高到4.0以上，出现一个短暂峰值。因此，添加激素继代3次为柳杉适宜的继代次数。分析其原因，可能与柳杉芽体中植物生长调节剂的积累水平和对激素的敏感程度有关，适当使用DCR基本培养基进行复壮培养有利于植物的生长。

无性系生根能力受到较强的遗传控制，这在很多的针叶和阔叶树种的研究中得到证实(王明庥等, 1988；张存旭等，2004；Coleman et al., 1989；施季森等，1993；胡勐鸿等，2014；Radosta et al., 1994)。对黑杨派(Sect. Aigeiros)无性系生根性状的遗传变异研究认为，无性系最终的生根强度是重要的性状, 其生根的早晚和快慢在很大程度上亦会影响到成活和早期生长，各基因型生根动态的遗传变异在生根时间和强度上有着一定的差异(王明庥等, 1988)。对毛白杨(Populus tomentosa)组培苗的根诱导研究认为, 不同无性系的生根能力不仅取决于基因型, 而且受环境的影响，不同无性系在植株再生能力上有很大差异(张存旭等，2004)。对杉木扦插生根研究发现，杉木无性系的扦插生根能力受到较强的遗传控制, 认为在杉木无性系的选育中必须充分重视无性系生根能力遗传变异的研究(施季森等，1993)。对欧洲云杉(Picea abies)的扦插生根研究发现，不同单株间生根率变化幅度为0～100.0%(胡勐鸿等，2014)。本研究柳杉3个无性系在生根培养基中培养，其生根效果均达到较优水平，但不同无性系之间的最佳生根状况存在一定的差异性。其中011^#无性系的生根率、平均根数以及不定根形成能力在3个无性系中均处于最高水平。因此，在开展柳杉优良无性系的选育工作中要重视生根性状的选择。

以柳杉不同无性系无菌苗的嫩茎为外植体, 采用激素种类及其浓度的L₉(3⁴)正交设计的方法，研究各因素及其交互作用，对6个柳杉无性系植株的芽增殖能力和3个无性系植株的生根能力进行了比较，结果表明，柳杉不同无性系的芽增殖能力上有很大差异, 不同无性系在芽增殖中起主导作用的激素种类存在一定的差异，不同激素的交互效应对芽增殖效果均有极显著的影响。柳杉无性系植株的芽增殖能力和生根能力均受到遗传基因的控制。