随着纺织工业的迅速发展，印染行业己经成为我国自然水体污染的主要来源之一(王文静等，2011)。染料废水组成复杂、浓度高、色度深、碱度高且难以自然降解(司静，2014)，传统上有物理和化学2种处理方法，传统方法处理印染废水的去除率较高，但存在处理费用高、容易引起二次污染等问题(王慧等，2008)。生物脱色法是近年来新兴的一种环保且适于大规模废水处理的方法，在环境治理日益被人们重视的当今时代，利用生物法进行染料废水脱色逐渐被人们所重视。能够降解染料的微生物类群主要有真菌、细菌和藻类3种生物，其中，白腐菌作为一类腐朽木材能力很强的真菌，在染料废水处理方面体现出了较强的应用前景，已成为生物法处理染料废水的主要研究对象。白腐菌降解染料主要通过菌丝吸附和生物降解完成(Si et al., 2013a)，其中菌丝吸附作用主要通过菌丝体自身结构与染料等大分子等物质相契合从而净化水质；生物降解主要由菌丝分泌的木质素过氧化物酶(lignin peroxidase，LiP)、锰过氧化物酶(manganese peroxidase，MnP)和漆酶(laccase)等木质素降解酶系完成(池玉杰等，2007)，其独特的降解能力不但可以降解木质素，而且对大量异生芳香化合物及其衍生物也具备较强的分解能力(Si et al., 2013b)。

乳白耙齿菌(Irpex lacteus)是能够引起木材白腐的担子菌，目前对其的研究主要集中在培养条件、多糖、酶及降解秸秆等方面(袁文彬等，2012)，而在染料脱色方面的相关报道较少。本文从自然界分离得到1株乳白耙齿菌菌株(I.lacteus CB1，简称Il-CB1)，通过对其进行系统发育分析与鉴定，并对刚果红染料脱色条件进行了研究，以期为乳白耙齿菌在染料废水脱色中的应用提供依据。

1 材料与方法 1.1 菌种来源和培养基

Il-CB1采于吉林省长白山，形态学经东北林业大学森林保护学科鉴定，在试管斜面上的菌种保存于森林病虫病理实验室4 ℃冰箱，试验前菌种接种在PDA平皿上活化。

PDA培养基(L^-1)：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉15 g。

PDB培养基(L^-1)：马铃薯200 g，葡萄糖20 g。

基础脱色培养基(L^-1)(别春雨，2014)：葡萄糖20 g、蛋白胨4 g、MgSO₄·7H₂O 0.5 g、KH₂PO₄0.2 g、CaCl₂ 0.1 g、NaCl 0.6 g、MnSO₄·H₂O 0.035 g、CuSO₄·5H₂O 0.007 g、终浓度为100 mg·L^-1的刚果红染料，pH 5.0。250 mL三角瓶加入100 mL培养基，121 ℃高压灭菌20 min。接菌前加入过滤除菌的VB1溶液，终浓度为1 mg·L^-1。

1.2 Il-CB1 ITS序列的克隆

将Il-CB1接种于PDA平板培养基上，于29 ℃下避光静止培养5天后，刮取平板边缘新鲜菌丝，使用DNAquick快捷型植物基因组非离心柱型试剂盒(TIANGEN)提取其基因组DNA。所得DNA用1.0%琼脂糖凝胶电泳和核酸测定仪(Eppendorf)检测DNA大小、纯度及浓度。采用真菌通用引物ITS1(5′-T C C G T A G G T G A A C C T G C GG-3′)和ITS4(5′-T C C T C C G C T T A T T G A T A T GC-3′)，以基因组DNA为模板扩增其ITS序列。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测、目的条带回收后，送上海生工公司进行测序。得到ITS序列确定无误后，将该序列提交到NCBI的GenBank中，并进行序列的比对及系统发育分析。

1.3 刚果红浓度及脱色率的计算

以去离子水为对照，用紫外分光光度计在300～800 nm区间扫描50 mg·L^-1刚果红溶液对应的最大吸收峰处的波长，得到λ_max=497 nm。然后在497 nm波长下测定不同浓度的刚果红溶液吸光值A₄₉₇，根据对应的染料浓度C(mg·L^-1)绘制标准曲线，拟合刚果红浓度与吸光值A₄₉₇的标准方程(张玉龙，2012)。

在染料脱色过程中取2 mL不同时间(天)的发酵培养液，经12 000 r·min^-1离心2 min后，吸取上层溶液测定该溶液在λ_max=497 nm下的吸光值，结合刚果红染料的标准曲线计算刚果红浓度。具体脱色率计算公式为：脱色率(%)=100%×(C₀-C_n)/C₀，其中C₀为脱色0 h时溶液的刚果红浓度，C_n为脱色n天后溶液的刚果红浓度。

1.4 Il-CB1对刚果红染料脱色条件 1.4.1 Il-CB1对4种染料固体脱色效果的初筛

李超等(2009)报道乳白耙齿菌对刚果红具有较好的脱色效果，为进一步检测菌株Il-CB1的染料脱色能力，利用固体平板法对该菌株对刚果红(573-58-0)、臧红(477-73-6)、碱性臧红(477-73-6)、中性红(553-24-2)4种染料的固体脱色效果进行初筛。将菌株Il-CB1的菌块接种至分别含有终浓度为100 mg·L^-1的4种染料的PDA平皿中间，以未接菌但含有相同浓度染料的PDA平板培养基为对照，观察该菌株对这4种染料的脱色情况。

1.4.2 pH值对脱色效果影响的单因素试验

用直径为10 mm的打孔器截取在PDA培养基上生长5天的Il-CB1菌丝片5片，接种至含有100 mL PDB及2 g青杨(Populus cathayana)木屑的250 mL三角瓶中，在29 ℃、150 r·min^-1条件下培养5天后的发酵液作为菌丝母液进行后续的染料脱色研究。

改变基础脱色培养基的pH值，使其分别为3，4，5，6，7，8，250 mL三角瓶中装液量100 mL，121 ℃高压灭菌后，分别接种5 mL菌丝母液，于35 ℃、130 r·min^-1条件下培养7天，分别吸取1～7天的培养液2 mL检测其吸光值，绘制不同pH值下的脱色图。每个处理3次重复(下同)。

1.4.3 染料浓度对脱色效果影响的单因素试验

改变基础脱色培养基中的刚果红浓度，使其分别为20，50，100，150，250，500 mg·L^-1。各接菌5 mL菌丝母液，于35 ℃、130 r·min^-1条件下培养7天，分别吸取1～7天的培养液2 mL检测其吸光值，绘制不同染料浓度下的脱色图。

1.4.4 5个因素对脱色效果影响的正交试验

白腐菌对不同染料的脱色能力受多种因素和条件的影响，除了pH值和染料浓度外，还有不同碳源、氮源、金属离子等的作用。本试验在参考别春雨(2014)研究结果的基础上，选择葡萄糖浓度(A)、蛋白胨浓度(B)、Cu²⁺浓度(C)、Mn²⁺浓度(D)、接种量(E)作为正交试验因素，以进一步研究这5个因素对Il-CB1脱色效果的影响。为把参数的水平区间拉开，设计各因素水平为4个等级(表 1)。在最佳pH值和刚果红浓度条件下，基础脱色培养基其他成分不变。利用SPASS18.0软件设计出5因素4水平L₁₆(4⁵)的正交表，进行16组不同配方的正交试验，于35 ℃、130 r·min^-1条件下培养7天，分别在1～5天吸取培养液测定其脱色率，并对正交试验的最优组合进行验证。

1.4.5 染料加入时间对脱色效果的影响

在上述2项单因素试验和正交试验的基础上，以优化条件制作培养基，在菌丝培养0，1，3，5天后分别加入无菌的终浓度为100 mg·L^-1的刚果红溶液，以相同条件下培养3，5天后的菌丝液于121 ℃灭菌后再加相同浓度刚果红染料作为对照，以检测染料加入时间对Il-CB1脱色效果的影响。

2 结果与分析 2.1 菌株Il-CB1 ITS序列的克隆与分析

扩增和测序后获得637 bp的Il-CB1 ITS序列，将该序列提交到GenBank(登录号：KF318788.1)。Blast比对结果显示，KF318788.1与GenBank中JX290578.1，FJ462768.1，AB369467.1等24个乳白耙齿菌菌株的ITS序列覆盖度在100%范围内相似性都高达99%，与其他60个不同乳白耙齿菌菌株的ITS序列覆盖率达94%～99%，相似性也高达99%～100%。以稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)的ITS序列作为外源序列，对包含菌株Il-CB1在内的25条不同来源的乳白耙齿菌ITS序列进行系统进化树分析，结果KF318788.1与24条不同菌株来源的乳白耙齿菌的ITS序列归为一类，表明菌株Il-CB1为乳白耙齿菌，从而在分子层面上对菌株Il-CB1进行了鉴定。

2.2 Il-CB1对4种染料固体脱色效果的初筛

固体平板法对4种染料脱色10天的结果见图 1。由图 1可知菌株Il-CB1对刚果红的脱色较为彻底，染料颜色变淡，对臧红也有一定的脱色能力，对碱性臧红有微弱的脱色，但对中性红基本无脱色。

2.3 pH值对Il-CB1脱色效果的影响

Il-CB1对刚果红在不同pH值条件下7天内的脱色效果见图 2。由图 2可知，pH=6时对刚果红的脱色效果最好，在第5天脱色率达到最高为90.53%；其次是pH为4和5时，对刚果红的脱色效果较好，二者很接近；然后是pH=7时脱色率也较高；最后是pH为3和8时，脱色率均较低。这表明中性偏酸的条件有利于Il-CB1对刚果红的脱色，过低或过高的pH值均不利于脱色。

2.4 染料浓度对Il-CB1脱色效果的影响

Il-CB1对不同浓度刚果红的脱色效果见图 3。由图 3可知，接种后Il-CB1对不同浓度的刚果红溶液都具脱色作用。刚果红浓度在20～100 mg·L^-1范围内，Il-CB1对其脱色率随浓度的升高而上升，当浓度为100 mg·L^-1时脱色率在7天内都为最高，在第5天时的脱色率已经高达95.58%；但当刚果红浓度高于100 mg·L^-1时，脱色率则随浓度的升高而降低，特别是在500 mg·L^-1的浓度条件下，最高脱色率仅为23.83%。

2.5 正交试验结果与分析

16组不同组合的正交试验在染料脱色第5天时的脱色率结果见表 2。由表 2可知，染料脱色率最高的组合为第2个组合，即A₁B₂C₂D₂E₂，脱色率高达96.86%。选取各因素不同水平对应的最大脱色率的均值得到最佳脱色组合为A₁B₁C₂D₂E₃。极差分析显示，5个因素对菌株Il-CB1脱色刚果红的影响主次顺序依次为C＞D＞B＞E＞A，即Cu²⁺浓度对脱色率影响最大，其次是Mn²⁺浓度，而葡萄糖含量、蛋白胨含量以及接种量对脱色率的影响较小，并且差别不大。方差分析结果(表 3)表明，5个因素对Il-CB1脱色刚果红的影响主次顺序与极差分析结果基本一致，且5个因素对Il-CB1脱色刚果红的影响均显著。

正交试验中各因素不同水平在1～5天时对Il-CB1脱色刚果红的影响见图 4。由图 4可知，B因素在前3天时，水平4对应的脱色率较高，但自4天时均为水平1对应的脱色率最高，所以最佳水平为B₁；A，C，D，E 4个因素的最优水平分别为A₁，C₂，D₂，E₃，这与最大脱色率均值分析得到最佳脱色组合的结果一致。综上所述，确定正交试验的组合A₁B₁C₂D₂E₃为最佳脱色条件，即在250 mL三角瓶中装液量为100 mL的情况下，培养基含有葡萄糖10 g·L^-1、蛋白胨3 g·L^-1、Cu²⁺ 0.2 mmol·L^-1、Mn²⁺ 0.2 mmol·L^-1、接种7 mL的菌丝母液。

对正交试验的最优组合进行3组重复验证试验，结果表明，在该组合条件下，Il-CB1在第5天时对刚果红的脱色率达到99.60%。

2.6 染料加入时间对Il-CB1脱色效果的影响

在Il-CB1培养的不同时间加入染料后的脱色率结果见图 5。由图 5可知，菌丝培养1天后加入染料与开始培养时加入染料的脱色能力及其随时间的变化趋势基本相同，表明短时间的菌丝培养并未对染料脱色造成影响。观察第3天时加入染料后的脱色趋势，发现第3天加入染料时的初始脱色率就处于较高水平，培养1天后染料脱色率即为92.71%，以后随培养时间的推移染料脱色率仍逐渐上升，第3天、第5天时的脱色率分别为99.06%和99.99%。推测原因是由于菌丝培养3天时生长旺盛，菌丝边生长边吸附，又开始分泌降解酶增加脱色效果，所以脱色率最高。第5天加入染料的脱色率略低于第3天，说明过早或过晚加入染料都不利于Il-CB1对刚果红的脱色。综上所述，确定第3天为加入染料的最佳时间。

对培养3, 5天后的Il-CB1发酵液进行高压灭菌，杀死菌丝并使菌株分泌的酶失活，其脱色率随时间的变化曲线与未灭活菌丝培养液的趋势一致，虽然也具有很强的脱色能力，但整体上低于未失活状态。由此推测，灭活的菌丝培养液的脱色能力一方面来源于死亡菌丝的吸附作用，另一方面还有可能来源于菌体分泌的生物大分子(如失活后的酶等)的吸附作用，表明生物吸附作用是造成染料初期脱色的主要原因。

3 结论与讨论

系统发育分析结果表明，菌株Il-CB1的ITS序列与不同来源的多个乳白耙齿菌菌株的ITS序列聚类在一起，因此，将其在分子层面上鉴定为乳白耙齿菌。对偶氮类染料刚果红脱色条件的研究结果表明，Il-CB1脱色刚果红的最佳条件为：培养液中含有10 g·L^-1葡萄糖、3 g·L^-1蛋白胨、0.2 mmol·L^-1Cu²⁺与Mn²⁺、pH值为6.0、250 mL三角瓶装液量为100 mL的条件下接种7 mL菌丝母液、对Il-CB1培养3天后加入终浓度为100 mg·L^-1的刚果红染料，在这样的条件下处理1天后的脱色率达92.71%，可以有效缩短脱色时间，第3天、5天时的脱色率分别为99.06%和99.99%。表明该菌株对刚果红有很强的降解能力，因此在染料废水的降解中具有重要的应用潜能。

pH值是白腐菌生长环境的一个重要因素，其影响细胞膜所带电荷，改变培养基中化合物的离子化程度，进而影响菌丝细胞对营养物质的吸收与胞外酶和代谢产物的分泌。多数白腐菌生长与产木质素降解酶的最适pH值都为4.5～7，于存等(2014)研究表明，pH=7时最有利于乳白耙齿菌的菌丝生长和干质量积累，本研究表明，在pH=3和8的条件下均不利于Il-CB1对刚果红的脱色，而在pH=4～7的范围内脱色效果接近，在pH=6时效果最好，表明中性偏酸的环境更适合Il-CB1对刚果红的脱色。

白腐菌对不同染料的脱色能力不一(张玉龙，2012)，即使对同一种染料的不同浓度溶液脱色效果也存在差异(于存等，2014)。Il-CB1对刚果红的脱色率随其浓度的增加先升高后下降，刚果红浓度为100 mg·L^-1时脱色率最高，分析原因是一定浓度的刚果红可提高菌体的脱色能力，既可形成酸性环境，刺激菌体的代谢性能或作为碳氮源被加以利用(Mansur et al., 2003；Arora et al., 2004)，还可作为底物诱导木质素降解酶的产生。但浓度过高时脱色率急剧下降，推测高浓度的染料会对菌体产生一定的毒性，抑制菌丝生长并削弱胞外酶的分泌能力。这与以往对白腐菌染料脱色的研究结果相同(史玉玲等，2012)。

碳、氮源的浓度及比例会影响白腐菌菌丝的生长势及胞外酶的合成和活性，从而影响对染料的脱色效果(谭国民等，2003)，很多白腐菌在低氮条件下更有利于木质素降解酶的产生(郭艳艳等，2014)。本文正交试验研究表明，碳、氮浓度对脱色率影响显著，碳、氮源在低浓度下更有利于Il-CB1脱色刚果红，最高浓度时脱色率次之，推测较低的碳、氮源浓度可能更利于胞外酶的产生，且较低的碳、氮源溶液含氧量会更高一些，所以菌丝生长较好，脱色率最高；而最高浓度的碳、氮源含量则可以提供最充足的营养，这也有利于菌丝的大量繁殖，所以脱色率也较高。添加微量的Cu²⁺与Mn²⁺(0.2 mmol·L^-1)可以促进Il-CB1对刚果红的脱色。以往的研究表明，Cu²⁺是漆酶的活性中心，可以显著增加漆酶活性，从而促进对染料的脱色(赵世光等，2012)，但Cu²⁺本身对菌丝有一定的毒害作用，所以过量的Cu²⁺会抑制菌丝的生长，从而影响对染料的吸附脱色和木质素降解酶系的产生。而Mn²⁺对依赖Mn²⁺的MnP是必需的，所以微量Mn²⁺的加入也可以促进对有机物及染料的降解；同样，过量的Mn²⁺也不利于菌丝的健康生长。