林业科学  2016, Vol. 52 Issue (7): 87-95   PDF    
DOI: 10.11707/j.1001-7488.20160711
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文章信息

宋利沙, 韦继光, 云朝光, 杨秀好, 罗基同, 黄松殿
Song Lisha, Wei Jiguang, Yun Chaoguang, Yang Xiuhao, Luo Jitong, Huang Songdian
广西良凤江国家森林公园植物内生拟盘多毛孢属真菌种类多样性调查
Survey of Species Diversity in the Endophytic Fungal Genus Pestalotiopsis in Liangfengjiang National Forest Park, Guangxi, China
林业科学, 2016, 52(7): 87-95
Scientia Silvae Sinicae, 2016, 52(7): 87-95.
DOI: 10.11707/j.1001-7488.20160711

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收稿日期：2014-09-02
修回日期：2015-03-04

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宋利沙
韦继光
云朝光
杨秀好
罗基同
黄松殿

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宋利沙, 韦继光, 云朝光, 杨秀好, 罗基同, 黄松殿. 2016. 广西良凤江国家森林公园植物内生拟盘多毛孢属真菌种类多样性调查[J]. 林业科学, 52(7): 87-95.
Song Lisha, Wei Jiguang, Yun Chaoguang, Yang Xiuhao, Luo Jitong, Huang Songdian. 2016. Survey of Species Diversity in the Endophytic Fungal Genus Pestalotiopsis in Liangfengjiang National Forest Park, Guangxi, China. Scientia Silvae Sinicae, 52(7): 87-95.  DOI: 10.11707/j.1001-7488.20160711
广西良凤江国家森林公园植物内生拟盘多毛孢属真菌种类多样性调查
宋利沙1, 韦继光1 , 云朝光2, 杨秀好3, 罗基同3, 黄松殿2    
1. 广西大学农学院 南宁 530005;
2. 广西南宁良凤江国家森林公园 南宁 530031;
3. 广西林业有害生物防治检疫站 南宁 530028
收稿日期：2014-09-02; 修回日期：2015-03-04
基金项目：国家自然科学基金项目（30970022, 31270076）；广西科学研究与技术开发计划项目（桂科重14121002-4-3）；浙江省科技计划项目（2012C12009-5）
通讯作者：韦继光
摘要： 【目的】 对广西良凤江国家森林公园苏木科、木兰科和桃金娘科共16种植物的内生拟盘多毛孢属真菌种类多样性进行调查，为进一步了解植物内生拟盘多毛孢的组成及开展内生拟盘多毛孢代谢产物提供物质基础。 【方法】 采用常规组织块分离法和分子技术分析内生拟盘多毛孢与植物种类、分离部位和分离季节的相关性。 【结果】 从苏木科、木兰科和桃金娘科16种植物中共分离得到89株拟盘多毛孢属真菌，经形态学鉴定为11个种。桃金娘科中的白千层、假多瓣蒲桃，苏木科的银珠、中国无忧花分离得到的拟盘多毛孢种数分别为8，6和8，6种，是拟盘多毛孢定殖种类最多的植物；银珠内生拟盘多毛孢定殖率最高，为2.86%。内生拟盘多毛孢在植物枝条的定殖率高于叶片，秋季高于其他季节。3科植物内生拟盘多毛孢属真菌种类多样性指数以苏木科最高（2.235 3），桃金娘科次之（2.163 5），木兰科最低（1.8637）。 【结论】 广西良凤江国家森林公园多种植物内拟盘多毛孢属真菌喜好定殖在银珠、中国无忧花、格木和白千层等植物；对植物器官有明显的选择性，定殖率以枝条较高；与季节有一定的关系，以秋季最高。
关键词: 拟盘多毛孢属     定殖率     多样性     苏木科     木兰科     桃金娘科    
Survey of Species Diversity in the Endophytic Fungal Genus Pestalotiopsis in Liangfengjiang National Forest Park, Guangxi, China
Song Lisha1, Wei Jiguang1 , Yun Chaoguang2, Yang Xiuhao3, Luo Jitong3, Huang Songdian2    
1. College of Agriculture, Guangxi University Nanning 530005 ;
 2. Nanning Liangfengjiang National Forest Park of Guangxi Nanning 530031 ;
 3. Department of Guangxi Forestry Pest Management Nanning 530028
Abstract: 【Obiective】 In order to understand composition of endophytic Pestalotiopsis and provide the solid foundation for research on metabolites of endophytic Pestalotiopsis. A survey on diversity of endophytic Pestalotiopsis of 16 plant species of Caesalpiniaceae, Magnoliaceae and Myrtaceae were carried out in Nanning Liangfengjiang Forest Park of Guangxi. 【Method】 The tissue isolation and molecular techniques were used to preliminarily analyze the correlations between endophytic Pestalotiopsis and plant species, plant parts and seasons from or in which the fungus was isolated. 【Result】 Results showed that 89 isolates of endophytic Pestalotiopsis were isolated from 16 plant species of Caesalpiniaceae, Magnoliaceae and Myrtaceae, and among the isolates 11 species were identified based on morphological characters. Eight, six, eight and six endophytic Pestalotiopsis species were respectively collected from Melaleuca leucadendra (Myrtaceae), Syzygium polypetaloideum (Myrtaceae), Peltophorum tonkinense (Caesalpiniaceae), and Saraca chinensis (Caesalpiniaceae), in which the most endophytic Pestalotiopsis species colonized, of which the highest isolation frequency was 2.86% from Peltophorum tonkinense. It was also found that colonization frequencies of endophytic Pestalotiopsis were higher on twigs than leaves for most of plant species, and higher in autumn than in other seasons. In comparison, Shannon-Wiener's diversity index of endophytic Pestalotiopsis was the highest in Caesalpiniaceae (2.235 3), the second in Myrtaceae (2.163 5) and the lowest in Magnoliaceae (1.863 7). 【Conclusion】 It indicated that endophytic Pestalotiopsis had preference colonizing in Peltophorum tonkinense, Saraca chinensis, Erythrophleum fordii, and Melaleuca leucadendra and the colonization frequencies were higher in twigs and its colonization frequencies varied in different seasons, among which the highest frequencies were in autumn.
Key words: Pestalotiopsis     colonization     diversity     Caesalpiniaceae     Magnoliaceae     Myrtaceae    

拟盘多毛孢属真菌是木本植物内生真菌的重要类群之一，自Strobel等(1996)从植物内生拟盘多毛孢(Pestalotiopsis microspora)次生代谢产物中分离到抗癌物质——紫杉醇(Paclitaxel)后，这类真菌资源的研究成为了热点。目前，国内外关于内生拟盘多毛孢研究主要集中在植物内生拟盘多毛孢的物种多样性分析、内生拟盘多毛孢分布规律及次生代谢产物分析等方面。已报道拟盘多毛孢属真菌240多种(韦继光等，2006)，其中71种被记载为内生拟盘多毛孢属真菌(韦继光等，2006; Watanabe et al.，2010; Liu et al.，2010)。内生拟盘多毛孢宿主植物广泛，如裸子植物中罗汉松科(Podocarpaceae)、红豆杉科(Taxaceae)和被子植物中棕榈科(Palmae)、壳斗科(Fagaceae)、红树科(Rhizophoraceae)、山茶科(Theaceae)和樟科(Lauraceae)等(Liu et al.，2010; Wei et al.，2007; 李曼等，2012)；且内生拟盘多毛孢可产生有益的次生代谢产物，如抗癌物质、抗菌物质、毒素和抗虫物质等(刘爱荣等，2007；Chen et al.，2013; Liu et al.，2013; Wang et al.，2012)。此外，研究还指出，不同采样地、采样时间、宿主以及植物的不同年龄和部位与植物内生拟盘多毛孢定殖率有关(Liu et al.，2010; Wei et al.，2007; 李曼等，2012; Toofanee et al.，Dulymamode，2002)。广西良凤江国家森林公园地处北回归线以南，属南亚热带南缘季风气候，冬短夏长，植被结构以亚热带常绿阔叶林为主，因温度适宜、雨水充沛，植物体内蕴含有丰富的营养，为内生真菌繁衍创造了良好的条件。本研究对广西良凤江国家森林公园苏木科(Caesalpiniaceae)、木兰科(Magnoliaceae)和桃金娘科(Myrtaceae)共16种植物的内生拟盘多毛孢属真菌种类多样性进行调查，以期为进一步了解植物内生拟盘多毛孢属真菌的组成及开展内生拟盘多毛孢代谢产物提供物质基础。

1 材料与方法 1.1 材料采集 1.1.1 自然概况

广西良凤江国家森林公园(南宁树木园)位于南宁市南部，距市区约7 km，22°34′31″—22°46′51″N，108°15′14″—108°22′22″E。园内林业用地面积4 410.7 km2，森林面积3 346.6 hm2，森林覆盖率83%。年平均气温21.6℃，年降雨量1 280 mm，相对湿度79%。

1.1.2 植物种类

供试植物有3科16种植物，其中桃金娘科植物5种，分别为白千层(Melaleuca leucadendra)、红千层(Callistemon rigidu)、洋蒲桃(Syzygium samarangense)、蒲桃(S. jambos)和假多瓣蒲桃(S. polypetaloideum)；木兰科植物6种，分别为紫玉兰(Magnolia liliflora)、观光木(Tsoongiodendron odorum)、醉香含笑(Michelia macclurei)、香子含笑(M. hedyosperma)、红花木莲(Manglietia insignis)和灰木莲(Manglietia glauca)；苏木科植物5种，分别为羊蹄甲(Bauhinia variegata)、中国无忧花(Saraca chinensis)、银珠(Peltophorum tonkinense)、油楠(Sindora glabra)和格木(Erythrophleum fordii)。每季进行植物样本的采集，每种植物随机选取3株，分别从东、西、南、北4个方位采集健康枝条和叶片各5个，共120个，放入保鲜袋中，密封，编号。本研究采集了16种植物的健康枝条和叶片共7 680个样品。

1.2 菌株的分离和鉴定 1.2.1 菌株分离与形态学鉴定

采用常规组织块分离法，每种植物每次采样的枝条和叶片各随机选取35块用于内生拟盘多毛孢的分离。将选取的样品用自来水冲洗干净后晾干，依次用75%酒精、次氯酸钠(1.3%的有效氯)和75%酒精浸泡1，3和0.5 min，最后用无菌水清洗3次。将植物组织裁剪成小块(5 mm×5 mm)置于PDA培养基上，将最后一次清洗组织块的无菌水涂布至PDA培养基上作对照，同时还打开一个新的空白平皿，放置于超净工作台上10 min作对照，以保证分离到内生菌。在同等条件下培养，若涂布无菌水的培养基平皿和空白平皿上无任何菌落长出，从分离的植物组织长出真菌，则证明分离到的真菌是植物内生的，而不是植物组织表面或空气中的附生菌(柴新义等，2011)。植物组织在25℃下恒温培养3~20天，从内生真菌中选择拟盘多毛孢产孢，利用单胞分离方法(Lacap et al.，2003)对菌株进行纯化、归类、编号和保存。

拟盘多毛孢属真菌参考Steyeart(1953)、Guba(1961)、Sutton(1980)、Nag Raj(1993)等文献进行形态学鉴定。

1.2.2 菌株DNA提取、扩增、测序和分子比对

将纯化好的菌株移植于PDA平板培养基上，置黑暗条件25℃培养5~7天，待菌落长到直径为5~6 cm时，停止培养，置于4℃冰箱中备用。

DNA提取按照Doyle等(1987)方法并做适当改进。从PDA培养基平板上刮取约50 mg新鲜菌丝放入1.5 mL离心管中，加入50 mg石英砂，加入300μL预热(60℃)的CTAB提取缓冲液(2% CTAB，1.4 mol·L-1 NaCl，20 mmol·L-1 EDTA，0.1 mol·L-1 Tris-HCl，pH 8.0)，快速研磨成糊状，加入2% CTAB使其可以流动，放入60℃水浴恒温60 min，中间适当轻摇，取出冷却至40℃左右，加入等体积的Tris饱和酚、氯仿、异戊醇(25∶24∶1)，倒置翻转1~2 min后，静置2~3 min，常温下离心15 min(13 000 r·min-1)；移上层水相到1.5 mL离心管中，加入等体积的氯仿异戊醇(24∶1)，颠倒摇匀，静置1~2 min，在4℃下离心15 min(13 000 r·min-1)，再重复2次，每次取上清液时注意勿动中间白色层；抽提3次后将上清液移至1.5 mL离心管中，加入50μL 5 mol·L-1 KOAc和400μL异丙醇(4℃)，轻轻地颠倒摇匀，白色沉淀出现，静置1~2 min，4℃下离心(2 000 r·min-1)2 min；取出离心管，倒干上清液，加入400μL酒精(75%)，轻轻摇匀，4℃下离心2 min，再重复1次；DNA干燥仪干燥15 min，加入50μL TE缓冲液将DNA溶解，置-20℃保存，取5μL进行电泳检测。

ITS扩增引物序列为通用引物ITS4(5′-TCC TCC GCT TATTGA TAT GC-3′)和ITS5(5′-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3′)(White et al.，1990)。扩增反应在50μL反应体系中进行，PCR体系成分如下: PCR缓冲液[20 mmol·L-1 KCl，10 mmol·L-1(NH4)2SO4，2 mmol·L-1 MgCl2，20 mmol·L-1 Tris-HCl，pH 8.4]、三磷酸脱氧核糖核酸各200μmol、引物各15 pmol、DNA模板约100 ng、Taq DNA聚合酶2.5 U(上海生工生物工程技术服务有限公司)。热循环反应程序设置如下：98℃初始变性2 min；94℃变性40 s，54℃引物退火50 s，68℃下延伸60 s，35个循环结束后72℃延伸10 min。扩增中利用水代替DNA模板为空白对照。用凝胶电泳法检测PCR反应结果，吸取4μL PCR产物加入1%(W/V)琼脂糖凝胶，凝胶置于1×TBE缓冲液(0.9 mol·L-1 Tris-Borate，0.01 mol·L-1 EDTA，pH8.3)中，在110 V下电泳40 min。检测出明显亮条带的样品送到上海立菲生物技术有限公司广州分公司用相同的引物进行双向测序，将所获得的合格序列在GenBank中用Basic Blast进行搜索，以获得相关的分类学信息。

1.3 数据处理

定殖率(colonization frequency，CF)(%)=(出现内生拟盘多毛孢的组织块数/总分离组织块数)×100%(Suryanarayanan et al.，2001; Liu et al.，2010)。

相对多度(relative abundance，RA)(%)=(某个种的菌株个数/所有种的菌株个数)×100%(李曼等，2012)。

Shannon-Wiener多样性指数(H′)=-Σ(PilnPi)(罗天宏等，2002)。

Margalef丰富度指数(R)=(S-1)/log2N(罗天宏等，2002)。

均匀度指数(E)=H′/lnS(罗天宏等，2002；马克平等，1994)。

上述式中：Pi为第i种的比例多度，Pi=Ni/N；Ni为第i种物种个体数，i=1，2，3，4，…, S；S为物种数；N为个体总数(Liu et al.，2010)。

所得数据采SPSS 17.0软件进行统计分析。

2 结果与分析 2.1 拟盘多毛孢属种类鉴定结果

1) 青锁龙(厚壁)拟盘多毛孢(Pestalotiopsis crassiuscula)

Pestalotiopsis crassiuscula Stey.，Bull. Jard. Bot. État Brux. 14:338，1949.

Pestalotia crassiuscula(Stey.)Guba，Monograph of Monochaetia and Pestalotia:188，1961.

菌落在PDA培养基上呈白色棉絮状，有白色颗粒，背面呈黄色。分生孢子5细胞，棍棒状或椭圆形，直立或稍弯曲，(20~26)μm×(7~9)μm；中间3色胞，上2色孢颜色为茶黄褐色，分隔处颜色特深，稍缢缩，第3色胞橄榄色；顶端无色胞锥形，具顶端附属丝2~3根，长15~32μm；基部无色胞三角形，具中生式柄1根。

此菌株的ITS序列与GenBank上Blast的Pestalotiopsis sp. ATT035相似率为99%。

2) 疏毛拟盘多毛孢(Pestalotiopsis pauciseta)

Pestalotiopsis pauciseta (Sacc.)Y. X. Chen，Jour. Gungxi，Agric. Univ.12(1):24，1993.

Pestalotia pauciseta Sacc.，Ann. Mycol.12:311，1914; Sacc.，Syll. Fung.25:608，1931; Guba，Monograph of Monochaetia and Pestalotia:180，1961.

菌落在PDA培养基上呈白色轮纹棉絮状，背面呈浅黄色，具轮纹。分生孢子5细胞，椭圆形，直立或稍弯曲，(19~24)μm×(6~8)μm；中间3色胞，上2色孢颜色为深褐色，2色胞之间的分隔处呈煤烟色，第3色胞橄榄色；顶端无色胞锥形，具顶端附属丝2~3根，长21~32μm；基部无色胞三角形，具中生式柄1根。

此菌株的ITS序列与GenBank上Blast的Pestalotiopsis sp. MA129相似率为99%。

3) 雕刻拟盘多毛孢(Pestalotiopsis carveri)

Pestalotiopsis carveri (Guba)P. L. Zhu，Q. X. Ge & T. Xu，Acta Mycology Sinica 10(4): 273，1991.

Pestalotia carveri Guba，Monograph of Monochaetia and Pestalotia:127，1961.

菌落在PDA培养基上呈白色棉絮状，背面呈淡黄色。分生孢子5细胞，(17.5~30)μm×(6~8)μm；中间3色胞同为橄榄色；顶端无色胞锥形，具顶端附属丝2~3根，2根为主，长12.5~25μm；基部无色胞宽柱形，具中生式柄1根。

此菌株的ITS序列与GenBank上Blast的Pestalotiopsis visimae相似率为99%。

4) 广布拟盘多毛孢(Pestalotiopsis dissmeninta)

Pestalotiopsis dissmeninta(Thuem.)Stey.，Bull. Jard. Bot. État Brux. 19:319，1949，pl.13，Fig.A.

Guba，Monograph of Monochaetia and Pestalotia:125，1961.

Pestalotia dissmeninta Thuem.，Contrib. Flor. Mycol. Lusitan.: no. 578，1879; Sacc.，Syll. Fung.3: 784，1884.

菌落在PDA培养基上呈白色棉絮状，背面呈淡黄色。分生孢子5细胞，(15~27.5)μm×(5~7.5)μm；中间3色胞同为琥珀橄榄色；顶端无色胞锥形，具顶端附属丝2~3根，2根为主，长8.75~23.75μm；基部无色胞宽柱形，具中生式柄1根。

此菌株的ITS序列与GenBank上Blast的Pestalotiopsis sp. MA165相似率为99%。

5) 颊锥孢拟盘多毛孢(Pestalotiopsis conigena)

Pestalotiopsis conigena (Lév.)G. C. Zhao et Li，J. Northeast Forest. Univ. 23(4): 22，1995.

Pestalotia conigena Lév.，Annls Sci. Nat.，Bot., sér. 3 5: 285，1846; Sacc.，Syll. Fung.3: 792，1884.

菌落在PDA培养基上呈白色棉絮状，背面呈米白色。分生孢子5细胞，(21~26)μm×(6~7.5)μm；中间3色胞，上2色孢颜色为煤烟色，第3色胞橄榄色；顶端无色胞锥形，具顶端附属丝2~3根，2根为主，长27.5~44μm；基部无色胞三角形，具中生式柄1根。

此菌株的ITS序列与GenBank上Blast的Pestalotiopsis sp. P035相似率为100%。

6) 芍药拟盘多毛孢(Pestalotiopsis paeoniae)

Pestalotiopsis paeoniae (Servazzi)Stey.，Bull. Jard. Bot. État Brux. 14: 312，1949.

Pestalotia paeoniae Servazzi，Boll. Lab. Sper. R. Osserval. Fitopat. Torino，XVI:3，1938.

菌落在PDA培养基上呈白色絮状，背面呈浅橘黄色。分生孢子5细胞，(22.0~28.75)μm×(5~7.5)μm；中间3色胞，上2色孢颜色为焦茶色近煤烟色，第3色胞橄榄色，分隔处缢缩；顶端无色胞锥形，具顶端附属丝2~3根，2根为主，长13.75~30μm；基部无色胞三角形，具中生式柄1根。

此菌株的ITS序列与GenBank上Blast的Pestalotiopsis sp. P089相似率为99%。

7) 细丽拟盘多毛孢(Pestalotiopsis gracilis)

Pestalotiopsis gracilis(Kleb.)Stey.，Bull. Jard. État Brux. 14:310-312，1949.

Pestalotia gracilis Kleb.，Mykol. Zentbl. 4:10-11，1914; Sacc.，Syll. Fung. 25:609，1931; Guba，Monograph of Monochaetia and Pestalotia:179，1961.

菌落在PDA培养基上呈白色轮纹絮状，背面呈黄色，具有轮纹。分生孢子5细胞，(17.5~28.75)μm×(5~6.25)μm；中间3色胞，上2色孢颜色为焦茶黄色，第3色胞橄榄色，分隔处缢缩；顶端无色胞锥形，具顶端附属丝2~3根，2根为主，长12.5~26.25μm；基部无色胞三角形，具中生式柄1根。

此菌株的ITS序列与GenBank上Blast的Pestalotiopsis sp. P035相似率为100%。

8) 小孢拟盘多毛孢(Pestalotiopsis microspora)

Pestalotiopsis microspora (Speg.)Batista & Peres，Atas. Inst，Micol. Univ. Recife 3:100，1966.

Pestalotia microspora Speg.，Anal Soc. Cient. Argent，9:31-32，1880; Sacc.，Syll. Fung. 3:789，1884; Guba，Monograph of Monochaetia and Pestalotia:129，1961.

菌落在PDA培养基上呈白色絮状，背面呈白色。分生孢子5细胞，(16.25~30)μm×(5~6.25)μm；中间3色胞同为橄榄色；顶端无色胞圆锥形，具顶端附属丝2~3根，2根为主，长7.5~16.25μm；基部无色胞锥形，具中生式柄1根。

此菌株的ITS序列与GenBank上Blast的Pestalotiopsis microspora相似率为99%。

9) 橄榄色拟盘多毛孢(Pestalotiopsis olivacea)

Pestalotiopsis olivacea (Guba.)，G. C. Zhao et J. He，J. Northeast Forest.Univ. 23(4): 25，1995.

Pestalotia olivacea Guba，Monograph of Monochaetia and Pestalotia: 142，1961.

菌落在PDA培养基上呈白色絮状，背面呈白色。分生孢子5细胞，(18.75~26.25)μm×(6.25~7.5)μm；中间3色胞同为橄榄色，上2色胞颜色比第3色胞略深，有些第1色胞和第3色胞颜色最相近；顶端无色胞圆锥形，具顶端附属丝2~3根，2根为主，长11.25~28.75μm；基部无色胞三角形，具中生式柄1根。

此菌株的ITS序列与GenBank上Blast的Pestalotiopsis disseminata相似率为99%。

10) 欧克安拟盘多毛孢(Pestalotiopsis oxyanthi)

Pestalotiopsis oxyanthi (Thuem.)Stey.，Bull. Jard. Bot. État Brux. 14:329，1949.

Pestalotia oxyanthi Thüm.，Contrib. Flor. Mycol. Lusitan.: no. 574，1879.

菌落在PDA培养基上呈白色轮纹絮状，背面呈浅黄色，具有轮纹。分生孢子5细胞，(20~28.25)μm×(5~7.5)μm；中间3色胞，上2色孢颜色为茶黄褐色，第3色胞橄榄色，分隔处缢缩；顶端无色胞锥形，具顶端附属丝2~3根，2根为主，长11.25~37.5μm；基部无色胞三角形，具中生式柄1根。

此菌株的ITS序列与GenBank上Blast的Pestalotiopsis sp. P035相似率为99%。

11) 弥泽那拟盘多毛孢(Pestalotiopsis menezesiana)

Pestalotiopsis menezesiana (Bres. & Torr.)Bissett，Can. J. B. 60:2570，1982.

Pestalotia menezesiana Bres. & Torr.，Brotéria，sér. Bot. 8:142，1909; Sacc.，Syll. Fung. 22:1222，1913; Guba，Monograph of Monochartia and Pestalotia:217，1961

菌落在PDA培养基上呈白色轮纹絮状，背面呈浅黄色，具有轮纹。分生孢子5细胞，(18.75~28.75)μm×(5~8.75)μm；中间3色胞，上2色孢颜色为煤烟色，第3色胞橄榄色，分隔处缢缩；顶端无色胞锥形，具顶端附属丝2~3根，2根为主，长10~31.75μm；基部无色胞三角形，具中生式柄1根。

此菌株的ITS序列与GenBank上Blast的Pestalotiopsis sp. HGUP4077相似率为99%。

2.2 拟盘多毛孢种类组成和多样性与宿主植物的关系

从苏木科、木兰科和桃金娘科16种植物中共分离得到89株拟盘多毛孢，经形态学鉴定为11个种。苏木科分离得到的拟盘多毛孢最多，为42个菌株，且包含鉴定的所有种；其次是桃金娘科，为35个菌株；木兰科最少，为12个菌株。橄榄色拟盘多毛孢、芍药拟盘多毛孢和弥泽那拟盘多毛孢是供试16种植物中的优势种，其中芍药拟盘多毛孢定殖率和相对多度最高，分别为0.26％和16.85%。此外，广布拟盘多毛孢、小孢拟盘多毛孢、芍药拟盘多毛孢、橄榄色拟盘多毛孢、细丽拟盘多毛孢和欧克安拟盘多毛孢6种拟盘多毛孢在供试的3科植物中均可分离得到，而青锁龙(厚壁)拟盘多毛孢、雕刻拟盘多毛孢、疏毛拟盘多毛孢、弥泽那拟盘多毛孢和颊锥孢拟盘多毛孢仅可在其中2科植物中分离到(表 1)。

表 1 苏木科、木兰科和桃金娘科植物中内生拟盘多毛孢的种类及其定殖率① Tab.1 Species and colonization frequency of endophytic Pestalotiopsis on the plants of Caesalpiniaceae, Magnoliaceae and Myrtaceae

供试16种植物分离得到的拟盘多毛孢种数有所不同，其中苏木科植物分离得到的拟盘多毛孢种数最多，平均每种植物为5.5种；桃金娘科次之，平均每种植物为4.5种；木兰科植物较少，平均每种植物为2.25种。3科16种植物中，10种植物存在2种或2种以上内生拟盘多毛孢，且同一种拟盘多毛孢也可分布于多种植物中。白千层、银珠、中国无忧花和假多瓣蒲桃分离得到的拟盘多毛孢种数最多，分别为8，8，6和6种，蒲桃和灰木莲仅分离到1种，其余的树种为2~5种不等。

由表 2看出，3科植物之间拟盘多毛孢的多样性指数有所差异。苏木科植物中内生拟盘多毛孢种类的多样性指数最高，为2.235 3；桃金娘科次之，为2.163 5；木兰科较低，为1.863 7。此外，3科植物中植物丰富度指数为苏木科(5.748 9)>桃金娘科(4.874 0)>木兰科(1.394 7)；均匀度指数为桃金娘科(1.776 9)>苏木科(1.760 2)>木兰科(1.608 0)。

表 2 不同种类内生拟盘多毛孢在苏木科、木兰科和桃金娘科植物中的定殖率和相对多度① Tab.2 The conlonization frequency and relative abundance of endophytic Pestalotiopsis species on the plants of Caesalpiniaceae, Magnoliaceae and Myrtaceae
2.3 拟盘多毛孢的组成和多样性与植物组织的关系

内生拟盘多毛孢的定殖率与植物组织存在一定相关性。由表 3可知，拟盘多毛孢在供试植物枝条中的平均定殖率显著高于叶片，且枝条内分离到的拟盘多毛孢种类也多于叶片。供试的16种植物中，枝条内生拟盘多毛孢的平均定殖率为0.21%，明显高于叶片内生拟盘多毛孢的平均定殖率(0.06%)，可见，植物内生拟盘多毛孢偏向于在枝条中定殖。同时，枝条内生拟盘多毛孢的多样性指数、丰富度指数均高于叶片。枝条均匀度指数(1.347 6)与叶片均匀度指数(1.357 2)相近。

表 3 内生拟盘多毛孢在苏木科、木兰科和桃金娘科植物不同组织、不同季节的组成及多样性指数、定殖率① Tab.3 The composition, colonization frequency and species diversity index of endophytic Pestalotiopsis on different tissues of the host plants of Caesalpiniaceae, Magnoliaceae and Myrtaceae in the different seasons
2.4 拟盘多毛孢属种的组成和多样性与季节的关系

由表 3可知，植物内生拟盘多毛孢属种的组成及多样性与采样季节存在一定的相关性。供试植物内生拟盘多毛孢的平均定殖率以秋季最高，达0.28%，其次为冬季0.24%，夏季0.08%，春季最低，为0.04%。在分离得到的拟盘多毛孢种数上，冬季>夏季>秋季>春季，且冬季的内生拟盘多毛孢多样性指数和丰富度指数均高于春季、夏季和秋季，表明植物内生拟盘多毛孢的定殖在1年内有一定的累积性。

3 讨论

随着分子生物技术的发展，研究者依据分子系统进化关系对植物内生拟盘多毛孢属种的多样性分析发现，内生拟盘多毛孢属种类不具有显著的宿主专化性(Hu et al.，2007；韦继光等，2008)，同一植物体内可以分离获得多种内生拟盘多毛孢，同种内生拟盘多毛孢可以定殖在不同的植物体内，本研究再次印证了这个结论。供试的16种植物中有10种植物存在2种以上的内生拟盘多毛孢，种类最多的白千层和银珠内各含有8种，同时优势种橄榄拟盘多毛孢、芍药拟盘多毛孢和弥泽那拟盘多毛孢存在于灰木莲、醉香含笑、水蒲桃、假多瓣蒲、白千层、格木、中国无忧花和银珠8种植物中。研究结果表明，内生拟盘多毛孢属真菌是从植物相对幼嫩的叶片组织向内扩展到枝条，由于成长过程中的营养条件、竞争等影响，使枝条内积累的内生拟盘多毛孢种类和数量与叶片存在一定的差异(杜少康等，2009; Tejesvi et al.，2006; Santamaría et al.，2005)。

内生真菌在植物体内普遍存在，本研究发现其内生拟盘多毛孢在3科、16种植物体内也普遍存在，其种类和数量受很多因素影响(白红霞等，2006; 赵春安等，2009)。本文通过分离、鉴定和分析发现，内生拟盘多毛孢与植物所处环境和分离部位以及季节等有一定的关系。此外，也可能和树木的年龄有关，随着树木年龄的变化其内生拟盘多毛孢也发生着一个动态变化的过程(白红霞等，2006)。此次研究采样数量和采样的地点有限，且受当地实际情况的限制，随着采样数量的增大和采样范围的扩大，内生拟盘多毛孢属的种类和数量还会相应增多，规律会更加明显。

此外，供试植物所处的季节变化，可能导致内生拟盘多毛孢与寄主长期协同进化形成一定的适应关系以及竞争优势，使植物内生拟盘多毛孢在不同季节的分布有所不同。植物内生拟盘多毛孢在不同地域的分布可能也有所不同，Fröhlich等(2000)在研究澳大利亚和文莱的蒲葵(Livistona chinensis)叶部内生真菌时发现，掌状拟盘多毛孢(P. palmarum)在文莱2个地点的定殖率分别为0.3%和1.3%，而在澳大利亚则没有内生掌状拟盘多毛孢定殖。内生拟盘多毛孢在不同科植物的季节定殖规律有所不同，李曼等(2012)对广西林业科学研究院树木标本园的棕榈科、壳斗科和樟科3科植物内生拟盘多毛孢种类多样性调查研究的结果表明，春季定殖率高于其他季节，其多样性指数也以春季最高。由此可见，影响植物内生拟盘多毛孢分布和组成的因素较多而且是多方面的，这可能是宿主植物、内生真菌和季节之间相互作用的结果(Albrectsen et al.，2010; Banerjee，2010; Kim et al.，2013; de Souza Sebastianes et al.，2013)。

4 结论

本研究对广西良凤江国家森林公园3科植物中内生拟盘多毛孢多样性进行调查，共分离鉴定得到11种内生拟盘多毛孢真菌，这些真菌喜好定殖于银珠、中国无忧花、格木和白千层等植物。内生拟盘多毛孢在植物枝条的定殖率高于叶片，秋季高于其他季节，与前人研究存在一定的差异，形成差异的具体原因将有待进一步研究。

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