文章信息
- 陈盼飞, 任亚超, 张军, 王进茂, 杨敏生
- Chen Panfei, Ren Yachao, Zhang Jun, Wang Jinmao, Yang Minsheng
- 8年生嫁接转基因杨树Bt毒蛋白的表达与运输
- Expression and Transportation of Bt Toxic Protein in 8-Year-Old Grafted Transgenic Poplar
- 林业科学, 2016, 52(7): 46-52
- Scientia Silvae Sinicae, 2016, 52(7): 46-52.
- DOI: 10.11707/j.1001-7488.20160706
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文章历史
- 收稿日期:2015-11-20
- 修回日期:2016-01-14
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作者相关文章
随着植物遗传转化技术的发展,通过转基因技术对林木性状进行遗传改良已经成为林木育种的一条重要途径(王桂英等,2012;崔旭东等,2013;廖维华等,2013)。将外源基因导入受体植物的目的是使外源基因得到高效表达并使受体植物获得优良性状(Klocko et al.,2013;Hjältén et al.,2012)。人们对外源基因表达的稳定性和时空规律性的研究主要集中在1年生植物材料,而以多年生林木为试验材料进行的研究较少。外源基因能否在多年生转基因林木中稳定表达,是影响转基因林木应用推广和发展前景的重要因素。有研究发现,将外源基因导入受体植物后,其表达稳定性与外源基因的失活和沉默有关;植物的生长发育以及外界复杂环境条件可以通过影响外源基因的失活和沉默来影响外源基因的表达与稳定性(夏兰芹等,2000;Stem et al.,1997)。Meyer等(1994)研究表明,将转基因植株移栽至大田后,由于温度升高、光照加强,外源基因失活的程度显著增加,同时发生基因失活的植株数量也随之增加。Taylor(1997)认为外源基因的表达水平在后代延续中也会发生变化。
嫁接是繁殖林业苗木的重要方式之一,一些难生根的树种如毛白杨(Populus tomentosa)等,主要通过嫁接方式在生产中繁殖应用。此外,嫁接试验还是一种研究根系与地上部分物质信息交流的重要手段(Golecki et al.,1998; Crete et al.,2001)。王连荣等(2010)对1年生转基因嫁接杨苗木中Bt(Bacillus thuringiensis)毒蛋白的运输进行了研究,结果表明,外源Bt毒蛋白可以通过嫁接的方式在砧木和接穗间进行运输。杨树是多年生木本植物,生命周期较长,在多年的自然生长中极易经历干旱、病虫等多种逆境条件的影响,外源基因在成年树木中的稳定性及表达特性与苗期可能会有很大不同。因此,1年生转基因杨树外源基因表达特性及运输的研究结果难以作为多年生转基因树木的依据。在成年的转基因大树中,Bt毒蛋白是否表达和运输,及其运输是否存在规律性尚无报道。本试验通过嫁接途径,检测了8年生嫁接杨树成年树木不同位置不同组织中Bt毒蛋白含量,探究外源Bt毒蛋白在嫁接转基因成年杨树中运输情况,明确Bt毒蛋白运输的部位、运输量、运输的方向性和积累等规律,以期为转基因植物在林业生产中的嫁接应用和提高转基因林木的生态安全性提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料741杨是1974年开始经过2次有性杂交选育的优良白杨派杂种无性系,其母本是银白杨(Populus alba)×[山杨(Populus davidiana)+小叶杨(Populus simonii)],父本为毛白杨,适应范围广,材质优良。Pb29是河北农业大学和中国科学院微生物研究所共同培育的转BtCry1Ac基因741杨株系,经多年试验证明其对杨扇舟蛾(Clostera anachoreta)、美国白蛾(Hyphantria cunea)等鳞翅目(Lepidoptera)害虫具抗虫性(杨敏生等,2005;Yang et al.,2003)。
1.2 试验方法 1.2.1 试验材料的准备2007年3月底在河北农业大学苗圃利用转基因741杨和普通741杨进行嫁接育苗。其中,Pb29/741为以1年生741杨苗木作砧木嫁接Pb29当年生枝条;741/Pb29为以1年生Pb29苗木作砧木嫁接741杨当年生枝条。嫁接后的苗木在苗圃中正常管理,2009年定植于校园内,自然生长至2015年,8年生嫁接杨树生长状况良好:Pb29/741树高12 m,胸径13.6 cm;741/Pb29树高10.5 m,胸径14.5 cm。
2015年8月使用生长锥分别在每株树的树干基部开始,沿树干向上至树冠中部,以1 m间距依次打孔,采集树干的韧皮部、木质部和髓组织。取样分布如图 1所示,由于树高不同,2株杨树树干打孔点个数不同。Pb29/741打孔点6个:G1为基部砧木部分,接穗部分沿基部向上依次为G2-G6,G5为树冠基部取样点,G6为树冠中部取样点。741/Pb29打孔点5个:G1为基部砧木部分,接穗部分沿基部向上依次为G2-G5,G4为树冠基部取样点,G5为树冠中部取样点。
同时,分别在各嫁接杨树树冠中部(Z1)、树冠基部(Z2)取枝条,枝条上选取近干端(P1)、远干端(P2)2点,分别采集各枝条长枝叶以及枝条近干端和远干端的韧皮部、木质部、髓、叶片,重复3次。将各部分材料分装保存在-80℃冰箱,用于Bt毒蛋白的测定。
1.2.2 外源Bt基因的PCR检测分别采集2种不同嫁接方式杨树砧木部分和接穗部分的树皮,以非转基因741杨树皮为阴性对照,用刀片刮取韧皮部,加液氮研磨,采用CTAB法提取样品DNA,根据BtCry1Ac基因序列设计引物,由上海生工生物工程公司合成,正向引物序列为:5′-A T G G A T A A C A A T C C G A A C A T CA-3′;反向引物序列为:
5′-C C A C C T T T G T C C A A A C A C T G AA-3′。PCR反应总体积为20μL,水6μL,2×Taq Master Mix 10μL正向引物(10 mmol·L-1)1μL,反向引物(10 mmol·L-1)1μL,模板DNA 1μL。PCR扩增程序为:95℃预变性3 min;95℃30 s,50℃30 s,72℃30 s,共30个循环;最后72℃延伸4 min。PCR反应在Biormetra T1 Thermocycler热循环仪中进行。利用1%TAE琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。
1.2.3 BtCry1Ac毒蛋白的测定采用美国Agdia公司BtCry1Ac ELISA试剂盒,进行毒蛋白测定。取冻存于冰箱中的材料,称取各组织样品0.1 g左右(记录实际质量)液氮中研磨,加入1 mL 1×PBST提取缓冲液,研磨至匀浆状,之后离心收集上清液,用ELISA试剂盒进行Bt毒蛋白含量检测,详细步骤参照试剂盒说明书。用BioRad 550型酶标仪进行检测。根据标样的吸光值和浓度拟合绘制标准曲线,再由样品的吸光值和标准曲线计算Bt毒蛋白浓度。蛋白浓度以每克新鲜叶片所含毒蛋白(ng)计算。
1.3 数据分析采用DPS数据处理系统进行数据分析。
2 结果与分析 2.1 嫁接转基因杨树BtCry1Ac基因的PCR检测提取2种不同嫁接方式杨树砧木和接穗韧皮部DNA,以非转基因741杨DNA为阴性对照,以载体质粒pBtiA(携带BtCry1Ac基因)为阳性对照,采用BtCry1Ac基因的特异性引物进行目的基因的PCR扩增(图 2)。Pb29/741嫁接杨中接穗部分扩增出与阳性对照大小一致(546 bp)的特异性条带,砧木部分未扩增出特异性条带;741/Pb29嫁接杨中砧木部分扩增出与阳性对照大小一致(546 bp)的特异性条带,而接穗部分未扩增出特异性条带;阴性对照未扩增出特异性条带。证明外源Bt基因在嫁接杨树转基因部分稳定存在,未发现外源基因丢失现象。
以741杨为砧木嫁接Pb29,砧木和接穗部分同时检测到BtCry1Ac毒蛋白的存在,不同部位不同组织中BtCry1Ac毒蛋白含量不同。树干不同部位不同组织的毒蛋白含量趋势见图 3,树干上6个点的韧皮部中毒蛋白含量均较高,最高达到50 ng·g-1以上。接穗Pb29树干部分毒蛋白含量由上向下逐渐降低,在G2点毒蛋白含量最低,为5.40 ng·g-1;砧木741部分G1点毒蛋白含量高于接穗G2点;总体呈现先下降后上升的趋势。树干不同部位木质部和髓中毒蛋白含量均较低,变化趋势不明显。树冠不同位置枝条BtCry1Ac毒蛋白含量变化如图 4所示,不同位置枝条各组织中韧皮部毒蛋白含量较高,树冠基部、中部枝条均表现为近干端韧皮部毒蛋白含量高于远干端。不同位置枝条木质部和髓中毒蛋白含量均较低,变化趋势不明显。
不同位置枝条不同部位叶片毒蛋白含量如图 5所示,叶片毒蛋白含量变化在26.31~101.30 ng·g-1,树冠基部枝条和中部枝条的长枝叶毒蛋白含量均低于远干端P2点短枝叶毒蛋白含量,沿枝条向树冠内侧P1点毒蛋白含量降低。同枝条叶片毒蛋白含量均表现为长枝叶低于短枝叶。树冠基部枝条叶片毒蛋白含量略低于树冠中部枝条叶片,且叶片毒蛋白含量高于枝条中对应位置韧皮部。
在96孔酶标板上进行Bt毒蛋白的ELISA反应,从显色反应可以直观看出Bt毒蛋白含量差异,Pb29/741的部分检测结果见图 6。酶标板样孔内液体显示的黄色深浅程度代表Bt毒蛋白含量的高低,黄色越深代表检测样品中Bt毒蛋白含量越高。从图 6可以看出,G2、G3显色最浅,G1较明显,G4-G6黄色明显,且颜色逐渐加深,表明Pb29/741树干部分由下向上韧皮部毒蛋白含量在G2、G3处降低,G4、G5、G6又逐渐升高;树冠基部枝条P1点和中部枝条P1点颜色明显较深,表明两枝条的P1点毒蛋白含量均明显高于P2点;枝条长枝叶显色较浅,表明长枝叶毒蛋白含量低于短枝叶。木质部和髓显示黄色不明显,表明木质部和髓的毒蛋白明显低于韧皮部和叶片,且无明显变化规律。
以Pb29为砧木嫁接未转基因741杨,砧木和接穗部分同时检测到了BtCry1Ac毒蛋白的存在,不同部位不同组织中BtCry1Ac毒蛋白含量不同。树干不同部位不同组织毒蛋白含量变化趋势如图 7所示,树干上5个点各组织中以韧皮部毒蛋白含量较高,最高达49.82 ng·g-1,且由树干基部至顶部呈下降趋势,G1、G2两点韧皮部毒蛋白含量高于其他位点;木质部和髓中毒蛋白含量较低,变化趋势不明显。树冠不同位置枝条不同部位毒蛋白含量如图 8所示,不同位置枝条各组织中,韧皮部毒蛋白含量较高,且不同枝条中韧皮部毒蛋白含量均表现为近干端低于远干端,树冠基部枝条低于树冠中部枝条;木质部和髓中毒蛋白含量均较低,变化趋势不明显。
树冠不同位置枝条不同叶片毒蛋白含量如图 9所示,毒蛋白含量变化在7.82~17.44 ng·g-1。树冠基部枝条叶片毒蛋白含量略高于树冠中部枝条叶片。同枝条不同位置叶片毒蛋白含量变化无明显规律。叶片中毒蛋白含量与对应位置枝条韧皮部毒蛋白含量相比,未表现出一致的高低变化规律。
8年生嫁接转基因741杨经过长期自然生长和对复杂环境条件适应后,Bt基因未向非转基因组织转移,BtCry1Ac毒蛋白可以通过嫁接途径在砧木和接穗间进行稳定运输。Pb29/741成年株中,根部为非转基因部分,地上枝干部分为转基因组织,地上转基因组织能够表达Bt毒蛋白,其含量呈现出树冠外侧向内侧逐渐升高,接穗树干部分向下又逐渐降低的趋势,且可以向根和树干基部非转基因组织运输和积累,且以韧皮部运输为主。741/Pb29成年株中,根部为转基因部分,地上枝干为非转基因组织,根和树干基部组织也可以表达Bt毒蛋白,且可以由根部和干基部由枝干向树冠外侧运输并积累,以韧皮部运输为主,非转基因枝干部分呈现出了树干向上逐渐降低,树冠内侧向外侧逐渐升高的趋势。尽管嫁接方式不同,但是Bt毒蛋白的运输都呈现出了由转基因部分向非转基因部分运输,毒蛋白含量呈现出一个类似由源向库运输积累的趋势。
4 讨论树木是多年生木本植物,其生命周期有几十年甚至上百年时间,树体大,根系深,外源基因在多年生树木中的稳定性及表达特性与农作物会有很大不同(胡建军等,2010;陈兴玲,2007)。树木集约经营水平较低,一般处于半集约和野生状态下生长,大部分树木栽植于荒山及条件恶劣地区,极易受到病虫、干旱等逆境条件的影响,对外源基因在树体内表达和代谢必将会产生一定影响(沈孝宙等,2002)。研究成年转基因树木外源基因的表达及运输规律,对于转Bt基因树木合理利用、抗性预测和安全评价管理具有重要参考价值。
王连荣等(2010)对1年生嫁接杨树毒蛋白运输研究中,通过RT-PCR检测,非转基因组织中未检测到Bt基因的mRNA,说明Bt基因的mRNA没有在砧木与接穗间进行运输。ELISA检测结果表明BtCry1Ac毒蛋白可以在砧木和接穗间进行运输,且主要以韧皮部运输为主。对Pb29/741的砧木和接穗两部分检测结果显示,接穗韧皮部和叶片Bt毒蛋白含量高于砧木部分;而8年生成年株中,接穗和砧木毒蛋白含量并不是简单的单方向高低变化,韧皮部毒蛋白含量由树冠外侧到内侧逐渐升高,在树干韧皮部达到一个峰值,又沿树干向下降低。对1年生嫁接杨741/Pb29砧木以及接穗的下中上3部分进行Bt毒蛋白含量检测,Bt毒蛋白含量逐渐降低;在8年生成年株中,虽然树干毒蛋白含量在向上运输过程中逐渐降低,但枝条韧皮部毒蛋白含量由树冠内侧到外侧逐渐升高。另外,2种嫁接杨树苗期叶片毒蛋白含量都显著低于韧皮部;而成年杨树中,同枝条叶片毒蛋白含量并未表现出与枝条韧皮部一致的单方向的降低或升高,且叶片的毒蛋白含量与对应位置枝条韧皮部相比,也没有表现出统一的高低规律。
综合分析可知,与苗期对比,成年杨树Pb29/741毒蛋白含量在树冠中树干部分达到一个较高峰值,分析原因可能是接穗毒蛋白向下运输过程中,各部分枝条及叶片毒蛋白运输至树干部位的汇集现象所致。而2种嫁接方式杨树中,同枝条叶片与叶片、叶片与对应位置韧皮部之间毒蛋白含量都未表现出变化规律,其原因可能因为叶片仅是Bt毒蛋白产生和积累器官而非运输器官,而且叶片毒蛋白表达或积累量与叶片的叶龄和生长状态有关,例如:叶龄不同,毒蛋白的合成和积累量以及分解代谢程度不同。叶片所处位置不同,叶片浓密程度、光照条件、CO2浓度不同,则叶片的光合作用、能量代谢、蒸腾拉力也会出现差别,从而导致植物体内物质运输和积累能力表现出不一致性。
嫁接是林业生产中应用广泛的苗木繁殖手段,嫁接在保持良种接穗优良性状的基础上,充分利用砧木特有的性状,提高栽培品种的抗逆性和适应性,加速良种的繁殖(Goldschmidt,2014)。杨树等树种主要通过无性方式进行繁殖,转基因植物与非转基因植物嫁接繁殖在生产上应用具有现实可能性。本研究证明,成年转基因嫁接树木,外源Bt基因能够稳定表达,其产物Bt毒蛋白可以向非转基因组织运输,这些研究结果为转基因杨树通过嫁接方式在生产上应用提供了依据。转基因杨树的嫁接应用,可以提高其生态安全性。通过转基因砧木嫁接非转基因接穗,可有效避免外源基因由花粉或种子进行传播扩散,控制发生基因漂移;通过非转基因砧木嫁接转基因接穗,可以避免或减少转基因林木根系向土壤中分泌Bt毒蛋白,降低外源基因在林木与土壤微生物间发生外源基因水平转移的可能性。但是,Bt毒蛋白由转基因组织向非转基因组织运输过程中,含量呈降低趋势,转基因嫁接大树是否能保持较高的抗虫效果,还需要进一步深入研究。
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陈兴玲. 2007.转基因杨树环境安全评价研究.沈阳:沈阳农业大学硕士学位论文. ( Chen X L. 2007. Research on ecosystem safety evaluation of transgenic poplar. Shenyang:MS thesis of Shenyang Agricultural University.[in Chinese][in Chinese]) |
[] |
崔旭东, 张冰玉, 丁昌俊, 等. 2013. 植物转基因技术及其在林木遗传改良中的应用. 世界林业研究 , 26 (5) : 41–46.
( Cui X D, Zhang B Y, Ding C J, et al.2013. Plant transgenic technology and its application to genetic improvement of forest trees. World Forestry Research , 26 (5) : 41–46. [in Chinese] ) (0) |
[] |
胡建军, 杨敏生, 卢孟柱. 2010. 我国抗虫转基因杨树生态安全性研究进展. 生物多样性 , 18 (4) : 336–345.
( Hu J J, Yang M S, Lu M Z.2010. Advances in biosafety studies on transgenic insect-resistant poplars in China. Biodiversity Science , 18 (4) : 336–345. DOI:10.3724/SP.J.1003.2010.336 [in Chinese] ) (0) |
[] |
廖维华, 安新民. 2013. 转基因树木研究现状及发展趋势. 中国生物工程杂志 , 33 (5) : 148–160.
( Liao W H, An X M.2013. Research status and development trend of transgenic trees. China Biotechnology , 33 (5) : 148–160. [in Chinese] ) (0) |
[] |
沈孝宙, 钱迎倩, 张树庸. 2002. 基因工程树的现状、生态风险与对策. 高技术通讯 (4) : 100–105.
( Shen X Z, Qian Y Q, Zhang S Y.2002. Genetically engineered forest trees:recent progress, ecological risks and management strategies. High Technology Letters (4) : 100–105. [in Chinese] ) (0) |
[] |
王桂英, 杨敏生, 霍雪梅, 等. 2012. 741杨双Bt基因的遗传转化及转基因株系的抗虫性. 林业科学 , 48 (9) : 42–49.
( Wang G Y, Yang M S, Huo X M, et al.2012. Transformation of 741 poplar with double Bt genes and the insect-resistance of the transgenic plant. Scientia Silvae Sinicae , 48 (9) : 42–49. [in Chinese] ) (0) |
[] |
王连荣, 杨敏生. 2010. 转基因杨树中外源Bt基因mRNA及其蛋白运输. 林业科学 , 46 (7) : 49–54.
( Wang L R, Yang M S.2010. Transportation of the mRNA and protein of the foreign Bt gene in transgenic poplar. Scientia Silvae Sinicae , 46 (7) : 49–54. [in Chinese] ) (0) |
[] |
夏兰芹, 王远, 郭三堆. 2000. 外源基因在转基因植物中的表达与稳定性. 生物技术通报 (3) : 8–12.
( Xia L Q, Wang Y, Guo S D.2000. The stability of the expression of foreign genes in transgenic plants. Biotechnology Information (3) : 8–12. [in Chinese] ) (0) |
[] |
杨敏生, 高宝嘉, 王进茂, 等. 2005. 转双抗虫基因741杨基本特性分析. 林业科学 , 41 (1) : 91–97.
( Yang M S, Gao B J, Wang J M, et al.2005. Analysis of main characteristic of white poplar hybrid 741 transformed two insect-resistant genes. Scientia Silvae Sinicae , 41 (1) : 91–97. [in Chinese] ) (0) |
[] | Crete P, Leuenberger S, Iglesias V A, et al.2001. Graft transmission of induced and spontaneous post-transcriptional silencing of chitinase genes. Plant J , 28 (5) : 493–501. DOI:10.1046/j.1365-313X.2001.01171.x (0) |
[] | Goldschmidt E E.2014. Plant grafting:new mechanisms, evolutionary implications. Front Plant Science , 5 (5) : 727. (0) |
[] | Golecki B, Schulz A, Carstens-Behrens U, et al.1998. Evidence for graft transmission of structural phloem proteins or their precursors in heterografts of Cucurbitaceae. Planta , 206 : 630–640. DOI:10.1007/s004250050441 (0) |
[] | Hjältén J, Axelsson E, Whitham T, et al.2012. Increased resistance of Bt aspens to Phratora vitellinae Coleoptera) leads to increased plant growth under experimental conditions. PLoS One , 7 (1) : e30640. DOI:10.1371/journal.pone.0030640 (0) |
[] | Klocko A, Meilan R, James R, et al.2013. Bt-Cry3Aa transgene expression reduces insect damage and improves growth in field-grown hybrid poplar. Canadian Journal of Forest Research , 44 (1) : 28–35. (0) |
[] | Meyer P, Heidmann I.1994. Epigenetic variants of a transgenic petunia line show hypermethylation in transgene DNA:an indication for specific recognition of foreign DNA in transgenic plant. Mol Gen Genet , 243 (4) : 390–399. (0) |
[] | Taylor C B.1997. Comprehending cosuppression. Plant Cell , 9 (8) : 1245–1249. DOI:10.1105/tpc.9.8.1245 (0) |
[] | Stem M, Mol J, Kooter J.1997. The silencing of genes in transgenic plants. Annals of Botany , 79 (1) : 3–12. DOI:10.1006/anbo.1996.0295 (0) |
[] | Yang M S, Liang H Y, Gao B J, et al.2003. Insecticidal activity and transgene expression stability of transgenic hybrid poplar clone 741 carrying two insect-resistant genes. Silvae Genetica , 52 (6) : 197–201. (0) |