林业科学  2016, Vol. 52 Issue (5): 45-54   PDF    
DOI: 10.11707/j.1001-7488.20160506
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文章信息

王文波, 王延平, 王华田, 马雪松, 伊文慧
Wang Wenbo, Wang Yanping, Wang Huatian, Ma Xuesong, Yi Wenhui
杨树人工林连作与轮作对土壤氮素细菌类群和氮素代谢的影响
Effects of Different Continuous Cropping and Rotation of Poplar Plantation on Soil Nitrogen Bacteria Community and Nitrogen Metabolism
林业科学, 2016, 52(5): 45-54
Scientia Silvae Sinicae, 2016, 52(5): 45-54.
DOI: 10.11707/j.1001-7488.20160506

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收稿日期：2015-04-09
修回日期：2016-04-05

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王文波, 王延平, 王华田, 马雪松, 伊文慧. 2016. 杨树人工林连作与轮作对土壤氮素细菌类群和氮素代谢的影响[J]. 林业科学, 52(5): 45-54.
Wang Wenbo, Wang Yanping, Wang Huatian, Ma Xuesong, Yi Wenhui. 2016. Effects of Different Continuous Cropping and Rotation of Poplar Plantation on Soil Nitrogen Bacteria Community and Nitrogen Metabolism. Scientia Silvae Sinicae, 52(5): 45-54.  DOI: 10.11707/j.1001-7488.20160506
杨树人工林连作与轮作对土壤氮素细菌类群和氮素代谢的影响
王文波, 王延平, 王华田 , 马雪松, 伊文慧    
山东省高校森林培育重点实验室 山东农业大学林学院 泰安 271018
收稿日期：2015-04-09; 修回日期：2016-04-05
基金项目：国家自然科学基金项目(31270670,31070550);教育部高等学校博士学科点专项科研基金(20133702110009)。
通讯作者： 王华田
摘要： 【目的】 氮素是影响杨树人工林生产力的最重要元素,研究杨树人工林连作和轮作氮素循环细菌类群演变动态及氮素代谢结构特征,有助于从养分循环角度揭示杨树人工林连作障碍机制。 【方法】 采用宏基因组测序技术,研究杨树人工林Ⅰ代林地、连作Ⅱ代林地、Ⅱ代林地主伐后轮作花生地和轮荒地土壤中氮素循环细菌类群及氮素代谢随不同连作代数及不同轮作模式的演变规律。 【结果】 发现参与氮素循环细菌4类11属,其中固氮细菌有拜叶林克氏菌属、慢生根瘤菌、根瘤菌属和弗兰克氏菌属,硝化细菌有硝化杆菌属和亚硝化螺菌属,反硝化细菌有假单胞菌属、罗尔斯通菌属、伯克氏菌属、芽孢杆菌属和链霉菌属,氨化细菌有芽孢杆菌属和假单胞菌属; 杨树人工林连作1代后,土壤中参与氮素循环细菌总数增加4.73%,土壤中氮素细菌的种类没有增减,固氮细菌的相对丰度增加53.44%,硝化细菌的相对丰度没有变化,反硝化细菌的相对丰度增加0.14%,氨化细菌的相对丰度增加1.33%; 与Ⅱ代林相比,花生地土壤中的氮素细菌的种类没有增减,固氮细菌的相对丰度减少71.14%,硝化细菌、反硝化细菌和氨化细菌的相对丰度分别增加120%,15.63%和20.76%; 轮荒地中的土壤氮素循环细菌缺少了硝化细菌,固氮细菌的相对丰度减少79.10%,反硝化细菌和氨化细菌的相对丰度分别增大17.39%和24.56%;杨树人工林连作1代后,土壤中的固氮细菌代谢活性增强,硝化细菌中的硝化杆菌属的代谢活性减弱,亚硝化螺菌属的代谢活性增强,氨化细菌代谢活性减弱; 与Ⅱ代林相比,轮作花生地中仅有硝化细菌的代谢活性增加,其他3种氮素代谢功能菌的活性都降低; 轮荒地中,所有的氮素循环细菌的代谢活性均比杨树Ⅱ代林地低。 【结论】 杨树人工林连作1代后,土壤中参与氮素循环的细菌总数增加,但代谢活性降低; 轮作花生后,大多数氮素代谢细菌的数量增加,但仅有硝化细菌的代谢活性明显增强; 轮作可以改善连作对杨树人工林地土壤硝化细菌生长繁殖和代谢活动的影响。
关键词: 杨树人工林     连作障碍     宏基因组测序技术     细菌类群     氮素代谢    
Effects of Different Continuous Cropping and Rotation of Poplar Plantation on Soil Nitrogen Bacteria Community and Nitrogen Metabolism
Wang Wenbo, Wang Yanping, Wang Huatian , Ma Xuesong, Yi Wenhui    
Key Laboratory of Silviculture in Shandong Provincial Forest College, Shandong Agricultural University Ta'ian 271018
Abstract: [Objective] Nitrogen is the most important element for poplar plantation productivity. Studies on the dynamic changes of nitrogen cycle bacteria community in continuous cropping and rotation of poplar plantation and the structure features of nitrogen metabolism will help to reveal the obstacle mechanism of continuous cropping to nitrification bacteria in poplar plantation in terms of nutrient cycling. [Method] In this study, the Metagenome sequencing technology was used to study the soil nitrogen cycling bacteria community and the evolvement pattern of nitrogen metabolism along with the continuous cropping generation and different rotation patterns in generationⅠ of poplar plantation, continuous cropping generation Ⅱ of poplar plantation, rotated peanut field and the abandoned land after poplar clear cutting. [Result] There were 11 bacteria from 4 genera related to nitrogen cycle, among which Azotobacter had genera of Beijerinckia, Bradyrhizobium, Rhizobium, and Frankia; Nitrobacteria had Nitrobacter, and Nitrosospira; Denitrifying bacteria had Pseudomonas, Ralstonia, Burkholderia, Bacillus, and Streptomyces; Ammonifying bacteria had Bacillus, and Pseudomonas. After the first continuous cropping of poplar plantation, the total number of nitrogen cycling bacteria in the soil increased by 4.73%, and the type of nitrogen cycle bacteria in the soil remained unchanged. The relative abundance of nitrogen fixing bacteria increased by 53.44%, nitrification bacteria was no change, denitrification bacteria increased by 0.14%, and ammonifying bacteria increased by 1.33%. Compared with generation Ⅱ of poplars, there was no increase or decrease in the type of nitrogen cycle bacteria in the rotated peanut soil. The relative abundance of nitrogen fixing bacteria reduced by 71.14%, nitrifying bacteria, denitrifying bacteria and ammonifying bacteria increased by 120%, 15.63% and 20.76%, respectively. Compared with generation Ⅱ of poplars, species of nitrogen cycle bacteria in the abandoned land soil reduced and the abandoned land was lack of nitrification bacteria. The relative abundance of nitrogen fixing bacteria reduced by 79.10%, while denitrifying bacteria and ammonifying bacteria increased by 17.39%, 24.56%, respectively. After the first continuous cropping of poplar plantation, the metabolic activity of soil azotobacteria enhanced, Nitrobacter weakened, Nitrosospira enhanced, and ammonifying bacteria weakened. Compared with generation Ⅱ of poplars, only the metabolic activity of nitrification bacteria increased, while the other three kinds of nitrogen metabolism function bacteria decreased in rotated peanut field. The metabolic activities of all nitrogen cycling bacteria in the abandoned land were lower than that in generation Ⅱ of poplar plantation. [Conclusion] After the first continuous cropping of poplar plantation, the total number of nitrogen cycle bacteria increased in the soil, but the metabolic activity decreased. After the rotation of peanuts, the most of nitrogen cycle bacteria increased significantly, but only the metabolic activity of the nitrification bacteria increased significantly. Thus, rotation could improve the adverse effects of continuous cropping of poplar plantation on the growth and metabolic activity of nitrification bacteria.
Key words: poplar plantation     continuous cropping obstacle     metagenome sequencing technology     bacteria community     nitrogen metabolic    

氮循环是氮气、无机氮化合物、有机氮化合物在自然界中相互转化过程的总称。土壤氮素循环是生物地球化学循环的重要组成部分,对土壤生产力起决定性影响(张晶等,2009)。土壤中95%以上的氮素为有机结合态,其中大部分需要经过土壤微生物转化成无机态氮,才能为植物所吸收利用(鲍士旦,1999),因此无机态氮在生态系统中的作用不容忽视的(Mistch et al,2000)。在生态系统中土壤微生物有机体组成了一个强大的动力资源库,在植物残体降解、腐殖质形成及养分转化与循环中扮演着十分重要的角色(Kennydy et al,1995； Bollag et al,1992；Schutter et al,2001； Yao et al,2000)。土壤氮素循环微生物是土壤生态系统的重要组成部分,参与氮素循环的固氮作用、硝化作用、反硝化作用和氨化作用,是土壤氮素循环的推动者,在氮素循环中发挥重要作用(Lucas et al,2007； Smith et al,2002； Doran et al,2000； 李思亮等,2002)。在土壤氮素循环微生物的作用下,有机氮经过氨化作用转化为无机氮、进而经过硝化作用转化为硝态氮、经过反硝化作用转化为N2进入大气中(Smith et al,1986； Robertson et al,2015)。

土壤氮素循环微生物群落的演变反映土壤质量的变化趋势。不同土壤因其酸碱度、水分含量、有机质含量及成土母质的不同,其氮素循环微生物种类和数量也各不相同(顾宗濂,1993)。近年来,针对不同土壤环境下微生物群落多样性的研究越来越多。研究发现,植物长期连作对土壤理化性质和微生物群落特征产生显著影响(Yao et al,2006； 焦如珍等,1999)。娄翼来等(2007)发现随着种植烟草(Nicotiana tabacum)年限延长,表层土壤的pH值呈现不同程度的下降趋势,表层土壤酸化明显。周科等(2011)也发现随着杨山牡丹(Paeonia ostii)连作代数的增加其根际土壤酚酸类物质积累,土壤pH值逐渐降低,根际土壤环境酸化,进而加剧了酶活性的降低。对花生(Arachis hypogaea)、大豆(Glycine max)、地黄(Rehmannia glutinosa)、烟草、杨树(Populus)等植物连作土壤中酚酸浓度与微生物群落结构的关系研究表明,长期连作导致土壤酚酸累积,进而改变土壤微生物区系特征,细菌种群数量减少,真菌种群数量增多(Wu et al,2011； 刘福德等,2005； 陈冬梅等,2010； 王进闯,2014)。国内外研究表明,采用轮作栽培方式,也会对土壤微生物的群落多样性和功能产生显著影响,进而影响土壤质量和生产力(张淑香等,2000)。吴凤芝等(2007)发现在设施栽培条件下,轮作有利于土壤微生物群落的多样性和稳定性的提高,有利于土壤生态环境的改善和黄瓜(Cucumis sativus)产量品质的提高。晋艳等(2004)研究发现,轮作土壤的 pH 值、有机质含量、全钾含量、速效硼含量、速效锌含量、交换性镁含量均高于连作,烟草的黑胫病(Phytophthora parasitica)发病率显著降低。贾志红等(2010)还指出轮作处理烟草连作地的土壤细菌群落丰富度指数较重茬大幅提高。传统的土壤微生物多样性研究方法多依赖于分离培养技术,但土壤中可培养微生物仅为其总数的 0.1%～1%,因而所获得的微生物多样性信息十分有限(车玉伶等,2005)。近年来,宏基因组技术的应用为从功能基因角度研究土壤养分循环相关微生物的群落结构、组成和相对丰度提供了契机(黄循柳等,2009)。

杨树在我国是重要的速生工业用材林树种,在长江流域及黄淮海地区广泛栽培,但长期连作经营导致杨树人工林出现了不同程度的地力衰退。近年来,针对杨树人工林连作障碍机制的研究表明,连作导致的土壤微生物群落结构失衡和土壤养分循环障碍,有可能是连作障碍机制的核心。氮素是影响杨树人工林生产力的最重要元素,然而关于土壤中氮素循环微生物类群的变化及氮素代谢方面的研究尚未见报道。本研究采用宏基因组测序技术,研究了土壤氮素循环相关细菌类群的结构和功能及氮素代谢随杨树人工林不同连作代数及不同轮作模式的演变规律,以期阐明不同经营模式对杨树人工林土壤氮素循环细菌类群和氮素代谢的影响,为揭示杨树人工林连作障碍机制和长期经营提供理论依据。

1 研究区概况

研究区位于山东宁阳高桥国有林场(116°50′E,35°53′N),属于暖温带大陆性半湿润季风气候区,年日照时数2 679.3 h,年均降水量689.6 mm,年均气温13.4 ℃。试验林地处大汶河南岸河滩阶地,地下水位5～8 m,粗沙质河潮土,杨树Ⅰ代林的土壤pH为6.5,酚酸含量约为29.63 μg·g-1,杨树Ⅱ代林的土壤pH为6.1,酚酸含量约为31.13 μg·g-1,轮作花生地的土壤pH为6.8,酚酸含量约为20.80 μg·g-1。林场土壤密度1.48 g·cm-3,总孔隙度41.9%,有机质含量10.75 g·kg-1,全氮含量0.54 g·kg-1,铵态氮含量4.01 mg·kg-1,硝态氮含量2.28 mg·kg-1,全磷含量 0.31 g·kg-1。

试验区为相邻的杨树Ⅰ代林、Ⅱ代林、轮作花生地和轮荒地,总面积为120 m×180 m,专门用于杨树人工林连作障碍的长期定位研究。试验林为相邻的I-107杨(Populus×euramericana ‘Neva’)速生丰产林Ⅰ和Ⅱ代林,周围设置铁丝网围栏,搭建板房,固定专人管护。2011年冬季采伐部分Ⅱ年生连作Ⅱ代林,并于2012年春季在采伐区设计更新连作-轮作试验,分别为轮作花生、轮荒地。

其中,Ⅰ代I-107杨树试验林为2009年种植4年生林木,平均树高(12.4±0.2)m,平均胸径(11.6±0.2)cm； Ⅱ代I-107杨树试验林为5年生林木,平均树高(13.1±0.3)m,平均胸径(12.2±0.3)cm； 轮作花生地采用覆膜栽培,品种为丰花2号,单作,连作1年； 轮荒地为不加任何干扰的自然生境,轮荒1年。

2 材料与方法 2.1 土壤取样

调查固定样地内杨树Ⅰ,Ⅱ代林的胸径、树高和冠幅,按照平均树高和平均胸径2倍标准差的标准,选取干形通直、树冠饱满的5株标准木。在距离标准木树干基部1.0 m处呈梅花形等距布设5个取样点,去除表层杂草和浮土,挖取5～20 cm土层中的须根,抖落其上粘附土壤并经10目过筛,等量混合,即得杨树Ⅰ代林根际土和杨树Ⅱ代林根际土； 在同株标准木下分别取非根际土壤并经相同处理后即得杨树Ⅰ代林非根际土和杨树Ⅱ代林非根际土。在轮作花生地和轮荒地沿“S”形布设5个点,每个点设置直径2.0 m圆圈并均匀布设5个采样点,去除表层杂物和覆土,挖取5～20 cm土层中的土壤并过10目筛,等量混合,即为该取样点轮作地土样,编号为轮作花生土壤和轮荒土壤。土样装入标记编号的无菌离心管并置于液氮罐中,运回实验室处理。各处理土样编号依次为1:杨树Ⅰ代林根际土；2:杨树Ⅱ代林根际土；3:杨树Ⅰ代林非根际土；4:杨树Ⅱ代林非根际土；5:轮作花生地土壤；6:轮荒地土壤。

2.2 土壤微生物DNA提取、基因测序与基因预测

采用MO BIO PowerSoil DNA Isolation Kit试剂盒(MO BIO公司,美国)提取土壤样品微生物基因组DNA,检测样品DNA是否符合上机要求。检测合格的 DNA 样品用超声波破碎仪随机打断成长度为300 bp的片段,经末端修复、加 A尾、加测序接头、纯化、PCR扩增等步骤,完成整个文库制备。文库构建完成后,先使用 Qubit 2.0 进行初步定量,稀释文库至1 ng·μL-1,随后使用Agilent 2100对文库的insert size进行检测,insert size符合预期后,使用Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量(文库有效浓度＞2 nmol·L-1),以保证文库质量。库检合格后,使用Illumina HiSeq 2000 测序平台进行双末端测序,得到下机数据(Raw Data),Raw Data处理后得到的有效数据Clean Data用于后续的生物信息分析。基于相似性的预测方法,利用已知的 mRNA 或蛋白质序列为线索在DNA 序列中搜寻所对应的片段,通过对蛋白数据库、eggNOG和KEGG 数据库进行比对搜索来实现基因预测。

2.3 数据分析

方差分析使用SAS软件,图表的制作使用Microsoft Excel 2013和MeV。基因表达丰度的计算采用RPKM法:

RPKM(A)=109C/NL。

式中: RPKM(A)为基因A的表达丰度；C为唯一比对到基因A的reads数；N为唯一比对到基因组的总reads数；L为基因A编码区的碱基数。使用软件Mev,Z=(log2(signal sample)-average)/stdev绘制Heatmap聚类图,设置参数Current Metric为Euclidean Distance。

3 结果与分析 3.1 杨树人工林不同连作、轮作模式土壤氮素微生物类群变化

从表 1中可以看出,杨树人工林不同连作与轮作模式土壤中共得到4类11属氮素循环功能细菌。其中固氮细菌4个属: 拜叶林克氏菌属(Beijerinckia)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、根瘤菌属(Rhizobium)、弗兰克氏菌属(Frankia)； 硝化细菌2个属: 硝化杆菌属(Nitrobacter)、亚硝化螺菌属(Nitrosospira)； 反硝化细菌5个属: 假单胞菌属(Pseudomonas)、罗尔斯通菌属(Ralstonia)、伯克氏菌属(Burkholderia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、链霉菌属(Streptomyces)； 氨化细菌2个属: 芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)。4种功能细菌的相对丰度表现为反硝化细菌＞氨化细菌＞固氮细菌＞硝化细菌(P＜0.05),其中芽孢杆菌属是优势菌群,占氮素代谢细菌总数的76%以上,亚硝化螺菌属(Nitrosospira)和罗尔斯通菌属(Ralstonia)所占比例较小,均不到0.1%。在杨树Ⅰ代林地、Ⅱ代林地、花生地和轮荒地中,固氮细菌和硝化细菌主要分布在根际土中,反硝化细菌和氨化细菌则主要分布在非根际土； 这表明固氮作用和硝化作用主要在根际周围进行,反硝化作用和氨化作用主要在非根际土中进行。

表 1 不同土样中氮素循环细菌的相对丰度 Tab. 1 Relative abundance of nitrogen cycle bacteria in the different soil samples

杨树人工林连作1代后,土壤中参与氮素循环细菌总数增加了4.73%,土壤中氮素细菌的种类没有变化,固氮细菌的相对丰度增加了53.44%,硝化细菌的相对丰度没有变化,反硝化细菌的相对丰度增加了0.14%,氨化细菌的相对丰度增加了1.33%。和杨树Ⅱ代林地相比,轮荒地中土壤氮素循环细菌的种类变少了,缺少硝化细菌,固氮细菌的相对丰度减少了79.10%,反硝化细菌和氨化细菌的相对丰度分别增大了17.39%和24.56%。这可能是由于轮荒地中植被较少,而固氮细菌大多数需要和植物共生才能存活的缘故。轮作花生后和杨树Ⅱ代林地相比,土壤中氮素细菌的种类没有增减,除了固氮细菌的相对丰度减少了71.14%外,硝化细菌、反硝化细菌和氨化细菌的相对丰度分别增加了120%,15.63%和20.76%。其中,固氮细菌的相对丰度显著减少(P＜0.05),这可能是由于在花生地取样仅选取了非根际土,而固氮细菌大多分布在花生根际周围的缘故。因此,轮作有利于增加土壤氮素代谢细菌的数量,尤其是硝化细菌的数量,进而可以改善连作杨树林地的土壤氮素代谢。

3.2 杨树人工林不同连作、轮作模式土壤氮素代谢分析

氮素代谢途径的具体各个支路需要相关的酶参与完成,通过对图 1中氮素代谢通路图中基因和酶的对应关系分析可知,与反硝化作用有关的酶有硝酸还原酶(EC 1.7.99.4)、亚硝酸还原酶(EC 1.7.2.1)羟胺还原酶(EC 1.7.99.1)、一氧化氮还原酶(EC 1.7.2.5)和一氧化二氮还原酶(EC 1.7.2.4),与固氮作用有关的酶是固氮酶(EC 1.18.6.1),与硝化作用有关的酶有氨单加氧酶(EC 1.14.99.39)、羟胺脱氢酶(EC 1.7.2.6)和硝酸还原酶(EC 1.7.99.4),与氨化作用有关的酶有腈水解酶(EC 3.5.5.1)、谷氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.2,EC 1.4.1.3,EC 1.4.1.4)、氨基甲酸激酶(EC 2.7.2.2)、甲酰胺酶(EC 3.5.1.49)和氰酸酯裂解酶(EC 4.2.1.104)。其中,硝酸还原酶(EC 1.7.99.4)同时参与硝化作用和反硝化作用,在土壤氮素循环过程中有重要影响。

图 1 KEGG氮素代谢通路 Fig. 1 KEGG metabolic pathway of nitrogen metabolism 图1为样本基因在KEGG pathway 中比对后导出的结果。红色标记表明在样本中找到该基因及对应的酶，蓝色和白色在此次取样中没有找到该基因及对应的酶。 Fig.1 is the results of sample genes alignment in KEGG pathway.Red markers show the samples have the genes and the corresponding enzymes, and blue and white markers indicate the genes and the corresponding enzymes cannot be found in the samples.

根据图 1 KEGG氮素代谢通路,从本次试验宏基因组测序得到的基因功能注释数据中筛选出不同土壤样本中氮素代谢相关酶及基因表达丰度,并进行多样本丰度分析,发现不同土壤样本中氮素代谢酶基因表达丰度存在显著差异(P＜0.05),表现为Ⅰ代林地>Ⅱ代林地>轮作花生地>轮荒地(表 2)。

表 2 氮素代谢功能酶及其在样本中对应的基因表达丰度 Tab. 2 Metabolic of functional enzyme and their corresponding gene expression abundance in the samples

土壤微生物体内的酶与微生物自身的代谢活动有关,在微生物的活性受到抑制时,相应的体内的某些酶的数量也会受到影响。从表 2和图 2中可以得出,连作杨树人工林土壤固氮作用中的固氮酶(EC 1.18.6.1)的基因表达丰度增加了18.13%,固氮细菌的生理代谢活性增强。硝化作用中的硝酸还原酶(EC 1.7.99.4)的基因表达丰度降低了22.72%,羟胺脱氢酶(EC 1.7.2.6)的基因表达丰度增大了16.44%。反硝化作用中的细胞色素C-型蛋白质NapB(EC 1.7.99.5)和亚硝酸还原酶(EC 1.7.99.1)的基因表达丰度分别增加了14.71%和10.00%,一氧化氮还原酶(EC 1.7.2.5)和硝酸还原酶(EC 1.7.99.4)的基因表达丰度分别减小了33.36%和21.53%。氨化作用中的腈水解酶(EC 3.5.5.1)和谷氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.3,EC 1.4.1.4)的基因表达丰度分别减小了21.13%和17.36%,氨化细菌的生理代谢活性减弱。轮作花生后与杨树Ⅱ代林相比,除了细胞色素C-型蛋白质NapB(EC:1.7.99.5)、羟胺脱氢酶(EC:1.7.2.6)、甲烷/氨单加氧酶(EC:1.14.99.39/1.14.18.3)和硝酸还原酶(EC:1.7.99.4)的基因表达丰度增加外,其他氮素代谢相关酶的基因表达丰度均降低,说明花生地中除了参与硝化作用的功能菌代谢活性增加外,其他的4种氮素代谢功能菌的活性都降低了。轮荒地与杨树Ⅱ代林相比,除了氨基甲酸激酶(EC:2.7.2.2)和辅酶Ⅱ(EC:1.4.1.4)的基因表达丰度显著增加外,其他氮素代谢相关酶的基因表达丰度均降低,这表明短期撂荒处理不能及时改善连作对杨树人工林地氮素代谢细菌活性的影响。因此,杨树人工林连作后固氮细菌的代谢活性增强,部分氨化细菌的代谢活性减弱,相应的固氮作用和氨化作用会受到不同的影响； 轮作花生后除了明显改善杨树Ⅱ代林硝化细菌的代谢活性外,对其他氮素代谢细菌的活性没有明显改善效果。

图 2 氮素代谢通路基因表达丰度差异 Fig. 2 Differences in genes expression abundance of nitrogen metabolism pathway
4 讨论

研究发现,连作可使土壤微生物总数减少,连作年限越长,减少越明显。而轮作有利于保持土壤微生物的多样性与活性,同时也有利于作物根系生长和对土壤的养分吸收,从而促进微生物的生长和繁殖,有利于作物的产量形成(王震宇,1991)。连作土壤微生物群落多样性指数、丰富度及其均匀度指数均随着作物种植年限的增加而降低,产量显著下降； 轮作栽培有利于土壤微生物种群的多样性和稳定性的提高,有利于土壤生态环境的改善(吴凤芝,2007)。而且,轮作能够增加微生物总量和土壤有机质含量,同时增加土壤中细菌/真菌值,提高土壤pH,降低土壤酚酸含量,增加地上和地下生物量,有利于减轻连作障碍(吕毅,2014； 李威,2012； 王俊,2005)。在本研究中,杨树人工林连作1代后土壤中氮素细菌的种类没有增减,土壤中参与氮素循环细菌总数增加了4.73%,硝化细菌中的硝化杆菌属(Nitrobacter)和氨化细菌代谢活性减弱。研究表明,杨树的连作会产生酚酸,酚酸的浓度会随着连作代数的增加而增大。本次试验只选取了连作1代的杨树人工林,土壤中的酚酸浓度并不高,而在较低的酚酸浓度范围内,酚酸的存在能促进细菌生长繁殖,高浓度的酚酸才对细菌的数量、群落结构等表现出明显的抑制作用(谭秀梅,2008)。轮作花生后,土壤的pH提高了,酚酸含量降低了,氮素代谢细菌总数增加了16.60%,其中硝化细菌、反硝化细菌和氨化细菌的丰度均有所增加,硝化细菌的代谢活性增强。众多研究表明,轮作能改善因连作带来的土壤微生物多样性与活性降低、产量下降、土壤生态环境恶化、地力衰退等问题,是防止土壤连作障碍发生的有效途径。本研究发现,杨树Ⅱ代林地轮作花生后,土壤中氮素细菌的种类没有增减,硝化细菌、反硝化细菌和氨化细菌的相对丰度分别增加了120%,15.63%和20.76%,但仅有硝化细菌的代谢活性增加。对比轮荒地中,土壤氮素循环细菌的种类变少了,缺少硝化细菌,固氮细菌相对丰度减少了79.10%,反硝化细菌和氨化细菌的相对丰度分别增大了17.39%和24.56%,但仅有氨化细菌的代谢活性增加。因此,轮作可以改善连作对杨树人工林地土壤硝化细菌生长繁殖和代谢活动的影响。

本次试验的杨树Ⅰ代林的土壤pH为6.5,杨树Ⅱ代林的土壤pH为6.1,杨树人工林连作一代后土壤pH值降低。研究表明,土壤pH值随种植年限的增加呈下降趋势,这种土壤酸化趋势可能与连作障碍有一定的相关性(Mubyana,2003； 刘来,2013； 刘福德,2005)。土壤pH过低影响微生物活性,导致土壤有机质中氮素营养释放受影响,且养分有效性降低(刘来,2013)。土壤pH影响硝化细菌的生理代谢过程和土壤硝化作用(Koops,2006)。研究表明,酸性土壤硝化作用不明显,微酸性土壤硝化作用较为缓慢,中性至微碱性土壤硝化作用比较强烈(Katyal,1988； Sahrawat,1982)。pH值不仅影响土壤的硝化微生物活性,而且还会影响硝化作用进程,当土壤的pH从4.7增大到6.5时,其硝化速率增加了3~5倍(Dancer,1973)。pH值不同使得硝化细菌的种类与活性也各不相同,硝化作用的强弱与土壤中硝化微生物的数量、种类及其活性有着密切的联系(Koops,2006)。在pH较低的土壤中,自养硝化细菌的数量相对比较少,且活性也较低,导致土壤的硝化作用比较弱,一般认为自养硝化细菌生长的最适pH范围为6.6~8.0或者更高(李良谟,1987)。硝化作用是由氨氧化细菌和亚硝酸氧化细菌来完成的2个连续过程。本次试验发现的亚硝化螺菌属属于氨氧化细菌的一种,硝化杆菌属属于亚硝酸氧化细菌的一种。杨树人工林连作后硝化杆菌属的相对丰度减少,亚硝化螺菌属的相对丰度增加,而硝化作用中的硝酸还原酶来自于硝化杆菌属(Helmer,1998),羟胺脱氢酶来自于亚硝化螺菌属(Koops,2001),由图 3的分析可知,硝酸还原酶的基因表达丰度降低,而羟胺脱氢酶的基因表达丰度增加。因此,连作后的土壤酸化导致硝化杆菌属的代谢活性减弱,亚硝化螺菌属的代谢活性增强。综合以上分析可知,杨树人工林连作后土壤酸化,土壤中的2种硝化细菌活性受到不同影响,进而影响其各自的硝化作用进程。

5 结论

本研究采用宏基因组测序技术,研究了杨树人工林Ⅰ代林地、连作Ⅱ代林、Ⅱ代林地主伐后轮作花生地和轮荒地土壤中氮素循环细菌类群及氮素代谢随不同连作代数及不同轮作模式的演变规律。共发现参与氮素循环细菌4类11属,其中固氮细菌4个属,硝化细菌2个属,反硝化细菌5个属,氨化细菌2个属。杨树人工林连作1代后,土壤中参与氮素循环的细菌总数增加,但代谢活性降低； Ⅱ代林地主伐轮作花生后,大多数氮素代谢细菌的数量增加,但仅有硝化细菌的代谢活性明显增强。Ⅱ代林地主伐轮荒后,氮素循环细菌的种类减少、相对丰度和代谢活性降低。因此,轮作花生对连作杨树人工林土壤硝化细菌的生长繁殖和代谢活动有一定促进作用。

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