文章信息
- 王新, 成仿云, 钟原, 文书生, 李刘泽木, 黄弄璋
- Wang Xin, Cheng Fangyun, Zhong Yuan, Wen Shusheng, Li Liu, Huang Nongzhang
- 凤丹牡丹鳞芽离体培养与快繁技术
- Establishment of in vitro Rapid Propagation System for Tree Peony(Paeonia ostii)
- 林业科学, 2016, 52(5): 101-110
- Scientia Silvae Sinicae, 2016, 52(5): 101-110.
- DOI: 10.11707/j.1001-7488.20160512
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文章历史
- 收稿日期:2015-12-31
- 修回日期:2016-01-28
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作者相关文章
2. 国家花卉工程技术研究中心 北京 100083
2. National Engineering Research Center for Floriculture Beijing 100083
我国每年食用油消费3 000万t以上,其中60%以上要靠进口,严重威胁着国家的食物安全(王汉中,2007)。立足国内油料作物多元化种植,重点扶持并培育高产量、高产值、高出油率的油料品种,已成为国家粮油发展的主要战略,其中木本油料作物已成为今后发展的重要方向之一。2014年国务院颁发了《关于加快木本油料产业发展的意见》,首次把油用牡丹列为国家重点发展的木本油料作物,并在全国范围内大力推广种植,但由于缺乏良种壮苗,其推广种植受到极大限制。因此,筛选并培育高产优质的油用牡丹优良品种,建立无性快繁技术,成为目前我国油用牡丹产业发展迫切需要解决的问题。
凤丹牡丹(Paeonia ostii)是由原种杨山牡丹(P. ostii)长期栽培演化形成的药用栽培种,包含‘凤丹白’(P. ostii‘Fengdan Bai’)、‘凤丹粉’(P. ostii‘Fengdan Fen’)等多个品种(李嘉珏,1999; 2006)。花色多样,花型多为单瓣,其根皮是著名中药材“丹皮”,是我国传统的药用植物;同时,因其生长势与适应性强、种子产量多(图 1A)且播种繁殖方便,常作为嫁接观赏牡丹(P. suffruticosa)的砧木使用(Cheng,2007)。近期研究表明,凤丹牡丹种子出油率为27%~33%,籽油含大量不饱和脂肪酸(>90%),特别是α-亚麻酸含量达39%以上(Li et al.,2015)。由于α-亚麻酸对于保护心血管、抑制癌症发生等具有显著的生理活性(Barcelo-Coblijn et al.,2009),具有较高的医疗保健价值,因此凤丹牡丹籽油是具有巨大发展潜力的高端食用油,2011年已被国家卫生部批准为新资源食品。然而,栽培凤丹牡丹仍然保持着原种杨山牡丹专性种子繁殖的特点(成仿云等,1997),其播种苗不仅结实性等各种性状分化明显,而且从种子到成熟植株开花结实至少需要5~6年时间(陈让廉,2004)。因此,建立优良单株无性快繁技术,生产无性系种苗,是实现凤丹牡丹高产、稳产亟待解决的问题。
植物的无性快繁包括扦插、嫁接、组织培养等多种方法,具有遗传稳定性高、繁殖速度快、经济价值高等优点,已成功应用于刺槐(Robinia pseudoacacia)、落羽杉(Taxodium distichum)、杉木(Cunninghamia lanceolata)等多种木本植物(高明寿等,1988; 欧阳磊等,2007)。就凤丹牡丹而言,种子繁殖不能保持母本的优良特点;在观赏牡丹中常用嫁接和分株等常规无性繁殖技术,因繁殖系数低而很难实现规模生产(曾瑞香等,2000)。因此,以组织培养为基础的无性快繁技术,在凤丹牡丹种苗生产中具有巨大发展潜力。
有关牡丹(Paeonia Sect. Moutan)的组织培养研究,自Demoise等(1969)首次报道以来,经过近半个世纪,国内外学者开展了大量研究,但至今尚未建立能在生产中应用的技术体系(Cheng,2007; Qin et al.,2012)。过去的研究,主要以观赏牡丹的不同品种为主,少量研究包括了凤丹牡丹与紫斑牡丹(P. rockii)(Qin et al.,2012)。过去以观赏牡丹研究为主,由于凤丹牡丹的观赏价值不高,因而对其组织培养的研究也较少。以凤丹牡丹鳞芽为外植体的微繁殖研究,仅见Beruto等(2007)的报道,在培养16周后获得了2.2左右增殖率,但并未得到生根试管苗;其他研究则零散地涉及以离体胚(何桂梅等,2006)、花药(Shoyama et al.,1990)、根(时侠清等,2005)以及叶柄(李玉龙等,1984; 秦磊等,2012)等为外植体进行的愈伤组织诱导,普遍存在愈伤组织褐化严重、再分化率极低的问题,尚未建立成熟体系。
已有研究发现,除生长调节剂是影响牡丹离体培养的关键因素外,基本培养基中Ca2+浓度对于其试管苗的增殖生长也起到重要作用,其浓度增加可有效抑制玻璃化及茎尖坏死(Li et al.,2008; Bouza et al.,1994a);此外,生根培养阶段冷处理可促进试管苗营养物质吸收,有效提高生根率(贾文庆等,2013; Beruto et al.,2004)。为此,本研究从前期筛选出的17个高结实凤丹牡丹单株中,进一步筛选出适宜离体培养的单株,并对最优株增殖阶段最佳Ca2+浓度和生长调节剂配比、生根阶段最佳冷处理及IBA浓度,以及移栽阶段生根质量对成活率的影响进行深入研究,首次建立了凤丹牡丹离体快繁技术体系,为全面建立油用牡丹无性快繁技术体系奠定了基础,也为油用牡丹种苗生产与新品种培育提供一种新途径。
1 材料与方法 1.1 鳞芽启动培养本课题组自2001年以来,从安徽亳州、山东菏泽、河南洛阳以及日本岛根县大根岛(岛根大学青木宣明教授赠送种子培育)等地,收集了大批不同来源的凤丹牡丹种子,栽培保存于北京林业大学鹫峰试验林场牡丹研究基地。本研究根据形态观察,从中筛选出17个蓇葖果发育良好、结种量高的单株,编号为FD1—FD17,作为本研究的试验材料。
于2014年春季,在植株即将萌动时,剪取带有饱满鳞芽的枝,带回实验室后取下鳞芽,剥除1~2层外层鳞片,流水冲洗1 h,之后洗洁精溶液浸泡10 min,再流水冲洗15 min,吸干水分后置于超净工作台上消毒灭菌处理。先用70%乙醇表面灭菌20~30 s,再用2%NaClO溶液处理14~15 min,无菌水冲洗6次,剥去剩余鳞片及小叶,接种于WPM + 6-BA 0.5 mg·L-1+ GA30.2 mg·L-1(李萍,2007)培养基上。每瓶接种1个外植体,每单株接种10瓶,重复3次。培养14天后调查统计芽诱导率[诱导率(%)=(芽萌发外植体数/接种外植体数)×100],培养40天后调查统计增殖系数(增殖系数=培养末期茎长≥1 cm芽数/接种芽数),筛选适宜离体培养的单株。
1.2 芽增殖培养以启动培养得到的FD10健壮苗(茎长≥1 cm)为材料,按Hosoki等(1989)的方法进行切分后继代培养,研究培养基中Ca(NO3)2浓度及植物生长调节剂(PGRs)配比对增殖的影响。首先,在附加0.5 mg·L-1 6-BA与0.2 mg·L-1GA3的WPM培养基中,设置不同的Ca(NO3)2浓度[386(原浓度),772,1 544,2 316,3 088 mg·L-1共5个梯度]。然后,在含最佳Ca(NO3)2浓度的WPM培养基中,添加不同的PGRs及其组合:6-BA(0.5,1.0 mg·L-1);6-BA(0.5 mg·L-1)+GA3(0.1,0.2,0.4 mg·L-1);6-BA(0.5 mg·L-1)+NAA(0.1,0.3,0.5 mg·L-1);6-BA(0.5 mg·L-1)+ KT(0.1,0.3,0.5 mg·L-1);6-BA(0.5 mg·L-1)+ TDZ(0.002,0.01,0.05,0.25 mg·L-1)。最后,从上述试验结果获得最佳改良培养基及PGRs组合。
增殖培养每处理接种15个芽,重复3次,40天后统计增殖系数、株高和玻璃化苗比率[玻璃化苗比率(%)=(玻璃化芽数/培养末期芽数)×100]。
1.3 试管苗生根培养采用两步生根法,即先把茎长≥1 cm的FD10试管苗接种在诱导培养基[1/2 MS + IBA 1.0 mg·L-1+腐胺1.0 mg·L-1]上黑暗条件下诱导生根30天,再转接到根形成培养基[1/2 MS(CaCl2加倍)+活性炭4.0 g·L-1]中光照条件下培养20天促进根伸长生长。本试验在研究筛选出最佳诱导生根的冷处理天数的基础上,进一步筛选有利于生根的IBA浓度。
1.3.1 冷处理天数对试管苗生根的影响在根诱导培养阶段,先用4 ℃冷处理不同时间(0,6,8,10,12,15天),再转正常培养温度条件继续暗培养至30天,然后转入根形成培养基继续培养。从试验结果中总结获得最佳冷处理诱导的天数。
1.3.2 IBA浓度对试管苗生根的影响将试管苗接种于添加不同浓度IBA的诱导培养基[1/2 MS + IBA(0,0.5,1.0,2.0,4.0 mg·L-1)+腐胺1.0 mg·L-1]中,冷处理8天(上述试验获得的最佳处理)后转入正常温度条件继续暗培养至30天,然后完成与上述试验相同的根形成培养,研究得出最佳的IBA浓度处理。
生根培养每处理接种20个试管苗,重复3次,培养末期统计生根率[生根率(%)=(生根茎段数/培养茎段数)×100]、根数和根长。
1.4 驯化与移栽将生根苗置于4 ℃黑暗条件下冷藏30天解除休眠(Bouza et al.,1992),之后转至(24±1)℃光照环境闭瓶适应1周,开瓶锻炼3~5天,从瓶内取出后洗净根部琼脂,之后将生根苗垂直于地面放置,测量愈伤块中部位置宽度,并结合根茎发育情况将生根苗分为3级。1级苗:宽度≤2 mm,基本无愈伤组织;根数≥2条,长、绿色、端白;茎部发育好,无茎尖坏死(图 1G)。2级苗:2 mm≤宽度≤5 mm,基部膨大,愈伤组织较小;根数≥1条,较长、绿色或灰绿色、端白;茎部发育良好,叶黄色或无叶(图 1H)。3级苗:宽度>5 mm,基部愈伤化严重,愈伤组织较大;根数=1条,较短、多呈白色透明状;茎上部无叶(图 1I)。
移栽容器为7 cm边长的方形塑料花盆;移栽基质为经高压灭菌(121 ℃,40 min)的泥炭土+蛭石+珍珠岩(体积比1:1:1)。移栽后立即用0.1%多菌灵浇透,置于人工气候室[温度(20±1)℃,湿度70%,光照强度32.4 μmol·m-2s-1,光照周期14 h·d-1]培养。移栽15,30,60天后,分别统计成活率。
1.5 培养条件如无特殊说明,启动、增殖及生根培养基均附加蔗糖30 g·L-1、琼脂7.0 g·L-1,pH5.8~5.9;培养温度(24±1)℃;日光灯照明,光照时数14 h·d-1,光强32.4 μmol·m-2s-1。
1.6 数据处理采用SPSS 19.0数据分析软件进行方差分析,运用邓肯式(Duncan)新复极差法进行多重比较(P < 0.05)。
2 结果与分析 2.1 不同凤丹牡丹单株无菌诱导的差异接种的凤丹牡丹鳞芽离体培养14天后,不同单株诱导率出现差别,其中FD10,FD12及FD14为100%,FD15,FD16仅25%,其余单株居中(表 1)。离体培养40天后,各单株间增殖系数差异显著(表 1),其中FD10为4.58,显著高于其他单株,且芽长势健壮,无黄化及坏死现象(图 1B);而FD1和FD14增殖系数仅1.42,显著低于其他单株。以诱导率≥50%、增殖系数≥2.50为标准,在供试17个单株中,有7株适合进一步离体培养,包括FD2,FD4,FD6,FD8,FD10,FD11和FD12。本研究结合各单株表现,选取增殖率最高、综合表现最优的FD10进行增殖及生根研究。
试验结果表明,随着WPM基本培养基中Ca(NO3)2浓度的增加,试管苗增殖系数及平均株高均呈先增后降趋势(表 2),且均在1 544 mg·L-1时达最佳;此时玻璃化苗比率最低,丛生芽较多、长势健壮。Ca(NO3)2浓度过低,产生的不定芽生长量小、茎秆细弱、易玻璃化;浓度过高,增殖系数下降、叶片变小且卷曲萎缩(图 1C)。
试验表明,不同PGRs对芽增殖影响的程度不同(表 3)。6-BA单独使用处理间无明显差异,增殖系数仅为1.15,茎伸长生长受抑(图 1D),无法促进丛生芽大量增殖。在0.5 mg·L-16-BA基础上,分别添加不同浓度的GA3,NAA,KT和TDZ,试验结果显示,GA3对促进增殖及生长效果最好,其次是NAA和KT,效果最差的是TDZ。在GA3浓度为0.2 mg·L-1时,增殖系数为3.87,平均株高6.18 cm,显著高于其他处理,且试管苗生长健壮、节间较长(图 1E),有利于继续继代培养。在NAA,KT和TDZ处理中,增殖系数最高分别为2.75,3.04和2.49,均显著低于0.2 mg·L-1GA3处理,而且NAA处理后愈伤组织发达,TDZ处理随浓度增加植株节间缩短、愈伤组织膨大明显(图 1F),均不利于继续继代培养。
由上述试验可以确定,单株FD10最佳增殖培养方案为改良WPM培养基[Ca(NO3)21 544 mg·L-1]+ 6-BA 0.5 mg·L-1 + GA30.2 mg·L-1。在此培养条件下,单株FD10以40天为继代周期,可连续继代6次,增殖系数保持在3~4,试管苗生长健壮,无玻璃化及褐化现象;6次之后试管苗长势减弱,增殖系数下降。
2.3 凤丹牡丹单株FD10的生根培养 2.3.1 冷处理天数对试管苗生根的影响试验结果表明,冷处理天数对试管苗生根率有显著影响、并且与生根质量有关(表 4)。未经冷处理的试管苗生根率为0;随冷处理天数增加,生根率呈先增后降趋势,在冷处理8天时达到峰值(30%),显著高于其他处理。同时,愈伤组织发育与冷处理密切相关(表 4),在冷处理10天内,试管苗基部均无明显愈伤组织形成;在冷处理超过12天后,基部愈伤组织开始膨大;冷处理15天时愈伤组织膨大十分明显。因此,根据上述试验结果可以认为,冷处理8天为最佳处理时间,生根率高,愈伤组织极少,生根质量高(图 1G)。
试验结果表明,不同IBA浓度对试管苗生根的影响差异显著(表 5)。随IBA浓度增加,生根率、生根数及根长呈先增后降趋势。当IBA浓度为0时,生根率为0;浓度为2.0 mg·L-1时,生根率为56.67%,显著高于其他处理,平均根长22.15 mm,且生根苗基部愈伤组织极少、生长健壮(图 1G),是本试验的最佳处理;当IBA浓度增加到4.0 mg·L-1时,生根率也较高(45.00%),但试管苗基部产生大量愈伤组织(图 1H,I),影响后期移栽成活。
由上述试验可以确定,单株FD10最佳生根培养方案为培养基1/2 MS + IBA 2.0 mg·L-1+腐胺1.0 mg·L-1、诱导初期冷处理8天。将继代培养6次后的试管苗接种在此生根条件下,经两步生根法及解除休眠处理后,得到可用于驯化移栽的生根苗。
2.4 凤丹牡丹单株FD10的驯化与移栽继代培养6次后所得生根苗中,1级苗占比84%,2级苗占比12.5%,3级苗占比3.5%。将各级生根苗分别进行移栽成活率统计,结果发现,生根苗质量与移栽成活率密切相关,基部愈伤组织越大,越不利于移栽成活(表 6)。愈伤组织较少的1级生根苗移栽15天后成活率达83.33%,新叶嫩绿、萌发后逐渐开展(图 1J);60天后成活率为66.67%,叶片浓绿、生长正常(图 1K)。而愈伤组织较多的2级和3级生根苗生长弱,后期逐渐死亡。
大量研究表明,牡丹对离体培养及其培养条件的反应因品种即基因型不同而异(Qin et al.,2012)。具体表现在2个方面:其一是不同品种在相同培养基及培养条件下,其增殖、生根及生长状况等多存在明显差异(Beruto et al.,2007);其二是同一品种在离体快繁不同阶段所需基本培养基、PGRs以及其他培养条件等也各不相同(Li et al.,2008; Wang et al.,2001)。凤丹牡丹具有长期异花授粉与种子繁殖的特性,已成为一个遗传上相当杂合的栽培品种群(Yuan et al.,2014);其播种苗单株的性状,包括结实性在内都存在明显差异。因此,以油用栽培为目的的离体快繁技术,必须建立在基因型(优良单株)选择的基础上才有实际应用价值。为此,本试验对17个高结实凤丹牡丹单株进行了离体启动培养的筛选,结果表明以离体诱导率≥50%及增殖系数≥2.50为标准,其中有7个单株适合进行离体培养,而大多数单株并不适合,这与观赏牡丹中离体培养高度依赖基因型的结论一致(Qin et al.,2012; Beruto et al.,2004; 2007)。正是基于这一认识,本研究又从7个优良单株中,选择表现最优的FD10(启动诱导率100%,增殖系数4.58)进行了离体快繁技术体系研究。
3.2 体系化是凤丹牡丹离体快繁技术的关键植物离体快繁技术,是由包括启动培养、增殖、生根与驯化移栽4个阶段组成的技术体系(成仿云,2012)。基于对牡丹离体快繁高度依赖于基因型的基本认识与相关研究结果,本研究对凤丹牡丹离体快繁的各个环节分别进行了优化筛选,旨在确保技术的完整性、实现技术的体系化。
在启动培养阶段,本研究使用WPM培养基附加6-BA 0.5 mg·L-1与GA3 0.2 mg·L-1(李萍,2007),在相同条件下筛选出适宜离体诱导的单株,选择表现最优的FD10单株进行深入研究。在增殖培养阶段,本研究重点是通过探究培养基中Ca2+含量与PGRs的种类及浓度,筛选出增殖系数高、丛生芽生长健壮的组合。WPM培养基是木本植物组织培养专用培养基(Lloyd et al.,1980),其中Ca2+以CaCl2和Ca(NO3)2 2种形式存在,Cl-浓度过高易导致植株玻璃化(Quoirin et al.,1977)。本研究在李萍(2007)研究基础上,以WPM + 6-BA 0.5 mg·L-1 + GA3 0.2 mg·L-1为增殖培养基,发现提高Ca(NO3)2浓度至1 544 mg·L-1(原浓度4倍)时,单株FD10的增殖系数由2.36增至3.07,而且玻璃化苗少、无茎尖坏死现象。Bouza等(1994a)指出,提高MS培养基中CaCl2浓度,可有效降低牡丹试管苗玻璃化及茎尖坏死现象的发生;Li等(2008)研究发现,降低MS培养基中NH+4-N/NO-3-N比值,可促进牡丹试管苗增殖及生长。本研究中,Ca(NO3)2浓度的增加在提高Ca2+浓度的同时,降低了NH+4-N/NO-3-N比值,从而显著促进了FD10试管苗增殖和生长。因此,在一定范围内提高WPM培养基中Ca(NO3)2浓度,是促进凤丹牡丹丛生芽增殖生长的有效途径。
植物生长调节剂(PGRs)对牡丹试管苗的增殖和生长起着关键作用,不同种及品种对其种类、浓度等存在感受性差异(Qin et al.,2012)。在各类细胞分裂素中,6-BA使用最为广泛(Bouza et al.,1994a; Albers et al.,1992),然而,其单独使用时增殖率较低,且无法促进试管苗的高生长(Gabryszewska,1998),这与本研究的结果一致;6-BA只有与GA3(Bouza et al.,1992; 1994a; 1994b)、NAA(孟清秀等,2011)、KT(李玉龙等,1984)等配合使用,才有利于不定芽的增殖及向高生长。本研究将6-BA与GA3,NAA,KT,TDZ配合使用,结果表明:0.5 mg·L-1 6-BA与0.2 mg·L-1 GA3配合使用,在继代周期为40天情况下,能实现3.87的增殖系数,且试管苗生长健壮、节间伸长明显、愈伤组织发育不明显,是凤丹牡丹FD10试管苗离体增殖最佳PGRs组合;而使用NAA,KT和TDZ与6-BA组合处理中,试管苗增殖系数均较低,且愈伤组织较发达或节间距缩短,不利于增殖培养。
生根困难一直是观赏牡丹离体快繁技术研究的难题(Wang et al.,2001;Qin et al.,2012),提高生根率与生根质量,同样也是建立凤丹牡丹离体快繁技术的关键。牡丹、马大杂种相思(Acacia mangium×A.auriculiformis)、巨桉(Eucalyptus grandis)等多种木本植物组织培养生根阶段常用1/2 MS培养基(Qin et al.,2012; 施琼等,2014; 石大兴等,2003),添加一定浓度(1.0 mg·L-1)的腐胺可有效提高紫斑牡丹多个品种的试管苗生根率(邱金梅,2010)。已有研究表明,4 ℃左右暗培养条件可抑制酶活性、减少酚类物质氧化、促进试管苗营养物质吸收,从而促进其生根(贾文庆等,2013; Beruto et al.,2004);此外,生长素类物质中,以IBA诱导生根效果最好,其最佳使用浓度因品种不同而异(Albers et al.,1992; Beruto et al.,2007; Wang et al.,2012; 李萍,2007)。本研究在两步生根法的根原基诱导阶段,以1/2 MS(CaCl2加倍)+ 腐胺1.0 mg·L-1为基本生根培养基,选取4 ℃处理时间及IBA浓度为研究对象,结果表明,4 ℃低温诱导处理8天,结合在培养基中添加2.0 mg·L-1 IBA,生根率最高,且基部愈伤组织少,利于后期移栽成活,这与贾文庆等(2013)和李萍(2007)的结论相一致。
驯化移栽是植物离体快繁技术的最后一个阶段,也是需要克服的又一个障碍。大量研究表明,牡丹生根苗的质量直接影响后期移栽成活,获得高质量的生根苗是后期移栽成活的关键(Qin et al.,2012; 邱金梅,2010)。本研究将单株FD10继代6次后的试管苗进行生根,并将生根苗以愈伤组织大小为主要分级标准,分为3级分别进行移栽,60天后仅没有明显愈伤组织形成的1级苗移栽成活率为66.67%,2级与3级苗则逐渐全部死亡。生根苗基部愈伤组织越多,移栽成活率越低,这与观赏牡丹的表现一致。其原因一方面是由于大量愈伤组织发生时,根茎间形成离层、使不定根与茎间的维管组织连接不畅,阻碍了养分和水分的吸收(贾文庆等,2013);另一方面是移栽后愈伤组织极易腐烂导致植株死亡(Qin et al.,2012)。因此,进一步提高组培苗生根质量,不仅是优化凤丹牡丹离体快繁技术体系中第3阶段生根、也是第4阶段移栽的重要问题,是关系到油用牡丹离体快繁技术能否进入实际应用的关键,值得进一步深入研究。
4 结论本研究从基因型筛选入手,从17个高产凤丹牡丹单株中筛选出7个适宜启动培养的单株,并针对优株FD10在增殖、生根及移栽阶段存在的问题,开展系统的试验研究,首次建立了凤丹牡丹离体快繁技术体系:初春采鳞芽外植体,在WPM + 6-BA 0.5 mg·L-1+GA30.2 mg·L-1培养基中启动离体培养;最佳增殖培养方案为WPM[Ca(NO3)2 1 544 mg·L-1]+ 6-BA 0.5 mg·L-1+ GA3 0.2 mg·L-1;最佳生根培养方案为培养基1/2 MS + IBA 2.0 mg·L-1+ 腐胺1.0 mg·L-1,诱导初期冷处理8天;生根质量是试管苗移植成活的关键,在所得生根苗中,1级苗占比84%,移栽60天后成活率66.67%。
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