林业科学  2016, Vol. 52 Issue (5): 101-110   PDF    
DOI: 10.11707/j.1001-7488.20160512
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文章信息

王新, 成仿云, 钟原, 文书生, 李刘泽木, 黄弄璋
Wang Xin, Cheng Fangyun, Zhong Yuan, Wen Shusheng, Li Liu, Huang Nongzhang
凤丹牡丹鳞芽离体培养与快繁技术
Establishment of in vitro Rapid Propagation System for Tree Peony(Paeonia ostii)
林业科学, 2016, 52(5): 101-110
Scientia Silvae Sinicae, 2016, 52(5): 101-110.
DOI: 10.11707/j.1001-7488.20160512

文章历史

收稿日期:2015-12-31
修回日期:2016-01-28

作者相关文章

王新
成仿云
钟原
文书生
李刘泽木
黄弄璋

凤丹牡丹鳞芽离体培养与快繁技术
王新1, 成仿云1,2 , 钟原1, 文书生1, 李刘泽木1, 黄弄璋1    
1. 北京林业大学园林学院 北京 100083;
2. 国家花卉工程技术研究中心 北京 100083
摘要【目的】 研究建立凤丹牡丹离体快繁技术体系,为油用牡丹优良单株无性快繁与新品种培育开拓新途径。 【方法】 早春从不同单株采集鳞芽外植体,置于WPM+6-BA 0.5 mg·L-1+GA3 0.2 mg·L-1培养基中离体培养,根据启动诱导率及增殖系数,筛选适宜离体培养的单株,并对最优单株展开深入研究; 在增殖阶段,采用单因子和随机区组试验设计,研究WPM培养基中Ca(NO3)2浓度和植物生长调节剂(PGRs)(6-BA,GA3,NAA,KT及TDZ)配比对增殖的影响,获得最佳增殖培养基及其PGRs组合; 在诱导生根阶段,采用单因子试验设计,研究冷处理时间和IBA浓度对生根率及生根质量的影响,获得最佳生根培养方案; 根据生根质量划分生根苗等级,并观察移栽成活率。 【结果】 1)凤丹牡丹启动培养存在基因型差别,供试的17个高结实单株中有7个诱导率≥50%、增殖系数≥2.50,适宜进行离体培养,其中单株FD10表现最佳(诱导率100%、增殖系数4.58),被用于研究建立离体快繁技术体系; 2)对培养基中Ca2+浓度与PGRs对增殖影响的研究结果表明,最佳增殖培养基及其PGRs组合为WPM[Ca(NO3)21 544 mg·L-1] +6-BA 0.5 mg·L-1+GA3 0.2 mg·L-1,以40天为继代周期,增殖系数为3.87,共继代6次; 3)对冷处理天数与IBA浓度对生根影响的研究表明,无根苗先在根诱导培养基(1/2 MS+IBA 2.0 mg·L-1+腐胺 1.0 mg·L-1)上培养30天(其中前8天进行4℃冷处理),再转入生根培养基[1/2 MS(CaCl2加倍)+活性炭4.0 g·L-1] 培养20天后生根率达56.67%; 4)把生根苗按生根质量分为1~3级,其中1级苗占比84%,2级和3级苗占比分别为12.5%和3.5%,移栽至基质泥炭土+蛭石+珍珠岩(体积比1:1:1)中,60天后发现愈伤组织少的1级苗成活率达66.67%,而愈伤组织发达的2级和3级苗则死亡,表明生根质量对移栽成活至关重要。 【结论】 凤丹牡丹离体快繁技术必须建立在基因型选择的基础上,本研究初步建立优株FD10的离体快繁技术体系,确定其最佳增殖培养基为WPM[Ca(NO3)2 1 544 mg·L-1] +6-BA 0.5 mg·L-1+GA3 0.2 mg·L-1; 最佳生根培养方案为1/2 MS+IBA 2.0 mg·L-1+腐胺1.0 mg·L-1,诱导初期冷处理8天; 1级生根苗移栽60天后成活率达66.67%。
关键词: 凤丹牡丹     基因型     硝酸钙     植物生长调节剂     生根     驯化移栽    
Establishment of in vitro Rapid Propagation System for Tree Peony(Paeonia ostii)
Wang Xin1, Cheng Fangyun1,2 , Zhong Yuan1, Wen Shusheng1, Li Liu1, Huang Nongzhang1    
1. College of Landscape Architecture, Beijing Forestry University Beijing 100083 ;
2. National Engineering Research Center for Floriculture Beijing 100083
Abstract: [Objective] An in vitro rapid propagation protocol was developed for Paeonia ostii to provide new method for the rapid propagation and cultivating elite varieties of oil tree peony. [Method] Buds were collected as explants in spring from selected individual plants of P. ostii and inoculated in the medium WPM+6-BA 0.5 mg·L-1+GA3 0.2 mg·L-1. Individuals or genotypes suitable for in vitro culture were selected by induction and multiplication ratios at initiation stage, among which the optimal one was studied further to set up rapid propagation protocol. During multiplication, the Ca(NO3)2 concentrations in the basal medium and combinations of plant growth regulators (PGRs: 6-BA, GA3, NAA, KT and TDZ) were studied by single-factor and randomized block design. During root inducing phase, the effects of cold treatments and IBA concentrations were evaluated by single-factor design. And at acclimation stage, in vitro rooted plantlets were classified by the rooting quality and transplanted into a greenhouse to investigate their survival rates. [Result] 1) The initiation performance of P. ostii in vitro culture was genotype-dependent. In 17 selected individuals with high seed yield, 7 individuals were suitable for in vitro initiation with induction rate≥50% and multiplication rate≥2.50, and the best FD10 (induction rate=100%, multiplication rate=4.58) was selected to set up rapid propagation protocol. 2) The optimal multiplication medium was WPM (Ca(NO3)2 1 544 mg·L-1)+6-BA 0.5 mg·L-1+GA3 0.2 mg·L-1, on which the highest multiplication rate (3.87) was obtained after 40 days of culture. And 6 subcultures were carried out. 3) By the effects of cold treatments and IBA concentrations in rooting, a two-step rooting protocol was set up. The shoots were cultured in the medium 1/2 MS+IBA 2.0 mg·L-1+putrescine 1.0 mg·L-1 for 30 days (including a 4℃ cold treatment of 8 days at the beginning) for root induction, and finished within 30 days, followed by culture in the medium 1/2 MS (double strength of CaCl2) +activated charcoal 4.0 g·L-1 for 20 days for root formation. The highest rooting percentage (56.67%) was obtained. 4) The in vitro rooted plantlets were classified into 3 grades by their rooting quality, and the percentage of grade 1 was 84%, while the grade 2 and grade 3 were 12.5% and 3.5%. During acclimatization the rooted plantlets were transferred into pots containing a mix of peat:vermiculite:perlite(1:1:1 by volume)substrate. After 60 days, plantlets of the grade 1 that had less callus survived 66.67%, but those plantlets that had obvious callus development died away totally, indicating the rooting quality was really an essential factor for survival of in vitro rooted plantlets of tree peony. [Conclusion] The rapid cloning propagation of P. ostii was genotype-dependent, and a rapid propagation protocol of FD10 was developed. The optimal medium for multiplication was WPM (Ca(NO3)2 1 544 mg·L-1)+6-BA 0.5 mg·L-1+GA3 0.2 mg·L-1, and the protocol for optimal rooting was 1/2MS+IBA 2.0 mg·L-1+ putrescine 1.0 mg·L-1, with 8 days cold treatment at the beginning of the rooting stage. The survival rate of transplanted plantlets in grade 1 was 66.67% 60 days after transplanting.
Key words: Paeonia ostii     genotype     Ca(NO3)2     plant growth regulator     rooting     acclimatization and transplanting    

我国每年食用油消费3 000万t以上,其中60%以上要靠进口,严重威胁着国家的食物安全(王汉中,2007)。立足国内油料作物多元化种植,重点扶持并培育高产量、高产值、高出油率的油料品种,已成为国家粮油发展的主要战略,其中木本油料作物已成为今后发展的重要方向之一。2014年国务院颁发了《关于加快木本油料产业发展的意见》,首次把油用牡丹列为国家重点发展的木本油料作物,并在全国范围内大力推广种植,但由于缺乏良种壮苗,其推广种植受到极大限制。因此,筛选并培育高产优质的油用牡丹优良品种,建立无性快繁技术,成为目前我国油用牡丹产业发展迫切需要解决的问题。

凤丹牡丹(Paeonia ostii)是由原种杨山牡丹(P. ostii)长期栽培演化形成的药用栽培种,包含‘凤丹白’(P. ostii‘Fengdan Bai’)、‘凤丹粉’(P. ostii‘Fengdan Fen’)等多个品种(李嘉珏,1999; 2006)。花色多样,花型多为单瓣,其根皮是著名中药材“丹皮”,是我国传统的药用植物;同时,因其生长势与适应性强、种子产量多(图 1A)且播种繁殖方便,常作为嫁接观赏牡丹(P. suffruticosa)的砧木使用(Cheng,2007)。近期研究表明,凤丹牡丹种子出油率为27%~33%,籽油含大量不饱和脂肪酸(>90%),特别是α-亚麻酸含量达39%以上(Li et al.,2015)。由于α-亚麻酸对于保护心血管、抑制癌症发生等具有显著的生理活性(Barcelo-Coblijn et al.,2009),具有较高的医疗保健价值,因此凤丹牡丹籽油是具有巨大发展潜力的高端食用油,2011年已被国家卫生部批准为新资源食品。然而,栽培凤丹牡丹仍然保持着原种杨山牡丹专性种子繁殖的特点(成仿云等,1997),其播种苗不仅结实性等各种性状分化明显,而且从种子到成熟植株开花结实至少需要5~6年时间(陈让廉,2004)。因此,建立优良单株无性快繁技术,生产无性系种苗,是实现凤丹牡丹高产、稳产亟待解决的问题。

植物的无性快繁包括扦插、嫁接、组织培养等多种方法,具有遗传稳定性高、繁殖速度快、经济价值高等优点,已成功应用于刺槐(Robinia pseudoacacia)、落羽杉(Taxodium distichum)、杉木(Cunninghamia lanceolata)等多种木本植物(高明寿等,1988; 欧阳磊等,2007)。就凤丹牡丹而言,种子繁殖不能保持母本的优良特点;在观赏牡丹中常用嫁接和分株等常规无性繁殖技术,因繁殖系数低而很难实现规模生产(曾瑞香等,2000)。因此,以组织培养为基础的无性快繁技术,在凤丹牡丹种苗生产中具有巨大发展潜力。

有关牡丹(Paeonia Sect. Moutan)的组织培养研究,自Demoise等(1969)首次报道以来,经过近半个世纪,国内外学者开展了大量研究,但至今尚未建立能在生产中应用的技术体系(Cheng,2007; Qin et al.,2012)。过去的研究,主要以观赏牡丹的不同品种为主,少量研究包括了凤丹牡丹与紫斑牡丹(P. rockii)(Qin et al.,2012)。过去以观赏牡丹研究为主,由于凤丹牡丹的观赏价值不高,因而对其组织培养的研究也较少。以凤丹牡丹鳞芽为外植体的微繁殖研究,仅见Beruto等(2007)的报道,在培养16周后获得了2.2左右增殖率,但并未得到生根试管苗;其他研究则零散地涉及以离体胚(何桂梅等,2006)、花药(Shoyama et al.,1990)、根(时侠清等,2005)以及叶柄(李玉龙等,1984; 秦磊等,2012)等为外植体进行的愈伤组织诱导,普遍存在愈伤组织褐化严重、再分化率极低的问题,尚未建立成熟体系。

已有研究发现,除生长调节剂是影响牡丹离体培养的关键因素外,基本培养基中Ca2+浓度对于其试管苗的增殖生长也起到重要作用,其浓度增加可有效抑制玻璃化及茎尖坏死(Li et al.,2008; Bouza et al.,1994a);此外,生根培养阶段冷处理可促进试管苗营养物质吸收,有效提高生根率(贾文庆等,2013; Beruto et al.,2004)。为此,本研究从前期筛选出的17个高结实凤丹牡丹单株中,进一步筛选出适宜离体培养的单株,并对最优株增殖阶段最佳Ca2+浓度和生长调节剂配比、生根阶段最佳冷处理及IBA浓度,以及移栽阶段生根质量对成活率的影响进行深入研究,首次建立了凤丹牡丹离体快繁技术体系,为全面建立油用牡丹无性快繁技术体系奠定了基础,也为油用牡丹种苗生产与新品种培育提供一种新途径。

1 材料与方法 1.1 鳞芽启动培养

本课题组自2001年以来,从安徽亳州、山东菏泽、河南洛阳以及日本岛根县大根岛(岛根大学青木宣明教授赠送种子培育)等地,收集了大批不同来源的凤丹牡丹种子,栽培保存于北京林业大学鹫峰试验林场牡丹研究基地。本研究根据形态观察,从中筛选出17个蓇葖果发育良好、结种量高的单株,编号为FD1—FD17,作为本研究的试验材料。

于2014年春季,在植株即将萌动时,剪取带有饱满鳞芽的枝,带回实验室后取下鳞芽,剥除1~2层外层鳞片,流水冲洗1 h,之后洗洁精溶液浸泡10 min,再流水冲洗15 min,吸干水分后置于超净工作台上消毒灭菌处理。先用70%乙醇表面灭菌20~30 s,再用2%NaClO溶液处理14~15 min,无菌水冲洗6次,剥去剩余鳞片及小叶,接种于WPM + 6-BA 0.5 mg·L-1+ GA30.2 mg·L-1(李萍,2007)培养基上。每瓶接种1个外植体,每单株接种10瓶,重复3次。培养14天后调查统计芽诱导率[诱导率(%)=(芽萌发外植体数/接种外植体数)×100],培养40天后调查统计增殖系数(增殖系数=培养末期茎长≥1 cm芽数/接种芽数),筛选适宜离体培养的单株。

1.2 芽增殖培养

以启动培养得到的FD10健壮苗(茎长≥1 cm)为材料,按Hosoki等(1989)的方法进行切分后继代培养,研究培养基中Ca(NO3)2浓度及植物生长调节剂(PGRs)配比对增殖的影响。首先,在附加0.5 mg·L-1 6-BA与0.2 mg·L-1GA3的WPM培养基中,设置不同的Ca(NO3)2浓度[386(原浓度),772,1 544,2 316,3 088 mg·L-1共5个梯度]。然后,在含最佳Ca(NO3)2浓度的WPM培养基中,添加不同的PGRs及其组合:6-BA(0.5,1.0 mg·L-1);6-BA(0.5 mg·L-1)+GA3(0.1,0.2,0.4 mg·L-1);6-BA(0.5 mg·L-1)+NAA(0.1,0.3,0.5 mg·L-1);6-BA(0.5 mg·L-1)+ KT(0.1,0.3,0.5 mg·L-1);6-BA(0.5 mg·L-1)+ TDZ(0.002,0.01,0.05,0.25 mg·L-1)。最后,从上述试验结果获得最佳改良培养基及PGRs组合。

增殖培养每处理接种15个芽,重复3次,40天后统计增殖系数、株高和玻璃化苗比率[玻璃化苗比率(%)=(玻璃化芽数/培养末期芽数)×100]。

1.3 试管苗生根培养

采用两步生根法,即先把茎长≥1 cm的FD10试管苗接种在诱导培养基[1/2 MS + IBA 1.0 mg·L-1+腐胺1.0 mg·L-1]上黑暗条件下诱导生根30天,再转接到根形成培养基[1/2 MS(CaCl2加倍)+活性炭4.0 g·L-1]中光照条件下培养20天促进根伸长生长。本试验在研究筛选出最佳诱导生根的冷处理天数的基础上,进一步筛选有利于生根的IBA浓度。

1.3.1 冷处理天数对试管苗生根的影响

在根诱导培养阶段,先用4 ℃冷处理不同时间(0,6,8,10,12,15天),再转正常培养温度条件继续暗培养至30天,然后转入根形成培养基继续培养。从试验结果中总结获得最佳冷处理诱导的天数。

1.3.2 IBA浓度对试管苗生根的影响

将试管苗接种于添加不同浓度IBA的诱导培养基[1/2 MS + IBA(0,0.5,1.0,2.0,4.0 mg·L-1)+腐胺1.0 mg·L-1]中,冷处理8天(上述试验获得的最佳处理)后转入正常温度条件继续暗培养至30天,然后完成与上述试验相同的根形成培养,研究得出最佳的IBA浓度处理。

生根培养每处理接种20个试管苗,重复3次,培养末期统计生根率[生根率(%)=(生根茎段数/培养茎段数)×100]、根数和根长。

1.4 驯化与移栽

将生根苗置于4 ℃黑暗条件下冷藏30天解除休眠(Bouza et al.,1992),之后转至(24±1)℃光照环境闭瓶适应1周,开瓶锻炼3~5天,从瓶内取出后洗净根部琼脂,之后将生根苗垂直于地面放置,测量愈伤块中部位置宽度,并结合根茎发育情况将生根苗分为3级。1级苗:宽度≤2 mm,基本无愈伤组织;根数≥2条,长、绿色、端白;茎部发育好,无茎尖坏死(图 1G)。2级苗:2 mm≤宽度≤5 mm,基部膨大,愈伤组织较小;根数≥1条,较长、绿色或灰绿色、端白;茎部发育良好,叶黄色或无叶(图 1H)。3级苗:宽度>5 mm,基部愈伤化严重,愈伤组织较大;根数=1条,较短、多呈白色透明状;茎上部无叶(图 1I)。

图 1 凤丹牡丹鳞芽离体快繁体系 Fig. 1 Rapid propagation from shoots culture in vitro of Paeonia ostii A:凤丹牡丹成熟种子;B:鳞芽启动培养40天后的FD10丛生芽;C: 不同Ca(NO3)2处理继代培养40天后的FD10丛生芽(由左至右浓度依次为386,772,1 544,2 316,3 088 mg·L-1);D-F: 不同植物生长调节剂处理继代培养40天后的FD10丛生芽(D: 6-BA 0.5 mg·L-1;E: 6-BA 0.5 mg·L-1+GA3 0.2 mg·L-1;F: 6-BA 0.5 mg·L-1+TDZ 0.25 mg·L-1);G-I:不同生根质量的FD10生根苗(G: 1级苗;H: 2级苗;I: 3级苗);J: 移栽15天后的FD10组培苗;K: 移栽60天后的FD10组培苗。 A: The mature seeds of P. ostii; B: The FD10 shoot cluster induced from buds 40 days after initial culture; C: The FD10 shoot cluster 40 days after subculture under different treatments of Ca(NO3)2 concentration (386, 772, 1 544, 2 316, 3 088 mg·L-1 from left to right); D-F: The FD10 shoot cluster 40 days after subculture under different treatments of plant growth regulators (D: 6-BA 0.5 mg·L-1; E: 6-BA 0.5 mg·L-1+GA3 0.2 mg·L-1; F: 6-BA 0.5 mg·L-1+TDZ 0.25 mg·L-1); G-I: The FD10 rooted plantlets with different rooting quality (G: Grade 1; H: Grade 2; I: Grade 3); J: The FD10 plantlets 15 days after transplanted; K: The FD10 plantlets 60 days after transplanted.

移栽容器为7 cm边长的方形塑料花盆;移栽基质为经高压灭菌(121 ℃,40 min)的泥炭土+蛭石+珍珠岩(体积比1:1:1)。移栽后立即用0.1%多菌灵浇透,置于人工气候室[温度(20±1)℃,湿度70%,光照强度32.4 μmol·m-2s-1,光照周期14 h·d-1]培养。移栽15,30,60天后,分别统计成活率。

1.5 培养条件

如无特殊说明,启动、增殖及生根培养基均附加蔗糖30 g·L-1、琼脂7.0 g·L-1,pH5.8~5.9;培养温度(24±1)℃;日光灯照明,光照时数14 h·d-1,光强32.4 μmol·m-2s-1

1.6 数据处理

采用SPSS 19.0数据分析软件进行方差分析,运用邓肯式(Duncan)新复极差法进行多重比较(P < 0.05)。

2 结果与分析 2.1 不同凤丹牡丹单株无菌诱导的差异

接种的凤丹牡丹鳞芽离体培养14天后,不同单株诱导率出现差别,其中FD10,FD12及FD14为100%,FD15,FD16仅25%,其余单株居中(表 1)。离体培养40天后,各单株间增殖系数差异显著(表 1),其中FD10为4.58,显著高于其他单株,且芽长势健壮,无黄化及坏死现象(图 1B);而FD1和FD14增殖系数仅1.42,显著低于其他单株。以诱导率≥50%、增殖系数≥2.50为标准,在供试17个单株中,有7株适合进一步离体培养,包括FD2,FD4,FD6,FD8,FD10,FD11和FD12。本研究结合各单株表现,选取增殖率最高、综合表现最优的FD10进行增殖及生根研究。

表 1 凤丹牡丹不同单株离体培养的诱导与增殖表现 Tab. 1 The initiation and multiplication of different P. ostii in vitro cultured plantlets
2.2 凤丹牡丹单株FD10的增殖培养 2.2.1 Ca(NO3)2浓度对芽增殖的影响

试验结果表明,随着WPM基本培养基中Ca(NO3)2浓度的增加,试管苗增殖系数及平均株高均呈先增后降趋势(表 2),且均在1 544 mg·L-1时达最佳;此时玻璃化苗比率最低,丛生芽较多、长势健壮。Ca(NO3)2浓度过低,产生的不定芽生长量小、茎秆细弱、易玻璃化;浓度过高,增殖系数下降、叶片变小且卷曲萎缩(图 1C)。

表 2 Ca(NO3)2浓度对凤丹牡丹(FD10)芽增殖和生长的影响 Tab. 2 Effect of Ca(NO3)2 concentration on the multiplication and growth of P. ostii (FD10) in vitro cultured shoots
2.2.2 植物生长调节剂对芽增殖的影响

试验表明,不同PGRs对芽增殖影响的程度不同(表 3)。6-BA单独使用处理间无明显差异,增殖系数仅为1.15,茎伸长生长受抑(图 1D),无法促进丛生芽大量增殖。在0.5 mg·L-16-BA基础上,分别添加不同浓度的GA3,NAA,KT和TDZ,试验结果显示,GA3对促进增殖及生长效果最好,其次是NAA和KT,效果最差的是TDZ。在GA3浓度为0.2 mg·L-1时,增殖系数为3.87,平均株高6.18 cm,显著高于其他处理,且试管苗生长健壮、节间较长(图 1E),有利于继续继代培养。在NAA,KT和TDZ处理中,增殖系数最高分别为2.75,3.04和2.49,均显著低于0.2 mg·L-1GA3处理,而且NAA处理后愈伤组织发达,TDZ处理随浓度增加植株节间缩短、愈伤组织膨大明显(图 1F),均不利于继续继代培养。

表 3 植物生长调节剂对凤丹牡丹(FD10)芽增殖和生长的影响 Tab. 3 Effect of plant growth regulators on the multiplication and growth of P. ostii (FD10) in vitro cultured shoots

由上述试验可以确定,单株FD10最佳增殖培养方案为改良WPM培养基[Ca(NO3)21 544 mg·L-1]+ 6-BA 0.5 mg·L-1 + GA30.2 mg·L-1。在此培养条件下,单株FD10以40天为继代周期,可连续继代6次,增殖系数保持在3~4,试管苗生长健壮,无玻璃化及褐化现象;6次之后试管苗长势减弱,增殖系数下降。

2.3 凤丹牡丹单株FD10的生根培养 2.3.1 冷处理天数对试管苗生根的影响

试验结果表明,冷处理天数对试管苗生根率有显著影响、并且与生根质量有关(表 4)。未经冷处理的试管苗生根率为0;随冷处理天数增加,生根率呈先增后降趋势,在冷处理8天时达到峰值(30%),显著高于其他处理。同时,愈伤组织发育与冷处理密切相关(表 4),在冷处理10天内,试管苗基部均无明显愈伤组织形成;在冷处理超过12天后,基部愈伤组织开始膨大;冷处理15天时愈伤组织膨大十分明显。因此,根据上述试验结果可以认为,冷处理8天为最佳处理时间,生根率高,愈伤组织极少,生根质量高(图 1G)。

表 4 冷处理天数对凤丹牡丹(FD10)试管苗生根的影响 Tab. 4 Effect of cold treatment days on in vitro rooting of P. ostii (FD10) shoots
2.3.2 IBA浓度对试管苗生根的影响

试验结果表明,不同IBA浓度对试管苗生根的影响差异显著(表 5)。随IBA浓度增加,生根率、生根数及根长呈先增后降趋势。当IBA浓度为0时,生根率为0;浓度为2.0 mg·L-1时,生根率为56.67%,显著高于其他处理,平均根长22.15 mm,且生根苗基部愈伤组织极少、生长健壮(图 1G),是本试验的最佳处理;当IBA浓度增加到4.0 mg·L-1时,生根率也较高(45.00%),但试管苗基部产生大量愈伤组织(图 1HI),影响后期移栽成活。

表 5 IBA浓度对凤丹牡丹(FD10)试管苗生根的影响 Tab. 5 Effect of IBA concentration on in vitro rooting of P. ostii (FD10) shoots

由上述试验可以确定,单株FD10最佳生根培养方案为培养基1/2 MS + IBA 2.0 mg·L-1+腐胺1.0 mg·L-1、诱导初期冷处理8天。将继代培养6次后的试管苗接种在此生根条件下,经两步生根法及解除休眠处理后,得到可用于驯化移栽的生根苗。

2.4 凤丹牡丹单株FD10的驯化与移栽

继代培养6次后所得生根苗中,1级苗占比84%,2级苗占比12.5%,3级苗占比3.5%。将各级生根苗分别进行移栽成活率统计,结果发现,生根苗质量与移栽成活率密切相关,基部愈伤组织越大,越不利于移栽成活(表 6)。愈伤组织较少的1级生根苗移栽15天后成活率达83.33%,新叶嫩绿、萌发后逐渐开展(图 1J);60天后成活率为66.67%,叶片浓绿、生长正常(图 1K)。而愈伤组织较多的2级和3级生根苗生长弱,后期逐渐死亡。

表 6 生根质量对凤丹牡丹(FD10)生根苗移栽成活率的影响 Tab. 6 Effect of rooting quality on survival rate of P. ostii (FD10) plantlets
3 讨论 3.1 基因型选择是建立凤丹牡丹离体快繁技术的基础

大量研究表明,牡丹对离体培养及其培养条件的反应因品种即基因型不同而异(Qin et al.,2012)。具体表现在2个方面:其一是不同品种在相同培养基及培养条件下,其增殖、生根及生长状况等多存在明显差异(Beruto et al.,2007);其二是同一品种在离体快繁不同阶段所需基本培养基、PGRs以及其他培养条件等也各不相同(Li et al.,2008; Wang et al.,2001)。凤丹牡丹具有长期异花授粉与种子繁殖的特性,已成为一个遗传上相当杂合的栽培品种群(Yuan et al.,2014);其播种苗单株的性状,包括结实性在内都存在明显差异。因此,以油用栽培为目的的离体快繁技术,必须建立在基因型(优良单株)选择的基础上才有实际应用价值。为此,本试验对17个高结实凤丹牡丹单株进行了离体启动培养的筛选,结果表明以离体诱导率≥50%及增殖系数≥2.50为标准,其中有7个单株适合进行离体培养,而大多数单株并不适合,这与观赏牡丹中离体培养高度依赖基因型的结论一致(Qin et al.,2012; Beruto et al.,2004; 2007)。正是基于这一认识,本研究又从7个优良单株中,选择表现最优的FD10(启动诱导率100%,增殖系数4.58)进行了离体快繁技术体系研究。

3.2 体系化是凤丹牡丹离体快繁技术的关键

植物离体快繁技术,是由包括启动培养、增殖、生根与驯化移栽4个阶段组成的技术体系(成仿云,2012)。基于对牡丹离体快繁高度依赖于基因型的基本认识与相关研究结果,本研究对凤丹牡丹离体快繁的各个环节分别进行了优化筛选,旨在确保技术的完整性、实现技术的体系化。

在启动培养阶段,本研究使用WPM培养基附加6-BA 0.5 mg·L-1与GA3 0.2 mg·L-1(李萍,2007),在相同条件下筛选出适宜离体诱导的单株,选择表现最优的FD10单株进行深入研究。在增殖培养阶段,本研究重点是通过探究培养基中Ca2+含量与PGRs的种类及浓度,筛选出增殖系数高、丛生芽生长健壮的组合。WPM培养基是木本植物组织培养专用培养基(Lloyd et al.,1980),其中Ca2+以CaCl2和Ca(NO3)2 2种形式存在,Cl-浓度过高易导致植株玻璃化(Quoirin et al.,1977)。本研究在李萍(2007)研究基础上,以WPM + 6-BA 0.5 mg·L-1 + GA3 0.2 mg·L-1为增殖培养基,发现提高Ca(NO3)2浓度至1 544 mg·L-1(原浓度4倍)时,单株FD10的增殖系数由2.36增至3.07,而且玻璃化苗少、无茎尖坏死现象。Bouza等(1994a)指出,提高MS培养基中CaCl2浓度,可有效降低牡丹试管苗玻璃化及茎尖坏死现象的发生;Li等(2008)研究发现,降低MS培养基中NH+4-N/NO-3-N比值,可促进牡丹试管苗增殖及生长。本研究中,Ca(NO3)2浓度的增加在提高Ca2+浓度的同时,降低了NH+4-N/NO-3-N比值,从而显著促进了FD10试管苗增殖和生长。因此,在一定范围内提高WPM培养基中Ca(NO3)2浓度,是促进凤丹牡丹丛生芽增殖生长的有效途径。

植物生长调节剂(PGRs)对牡丹试管苗的增殖和生长起着关键作用,不同种及品种对其种类、浓度等存在感受性差异(Qin et al.,2012)。在各类细胞分裂素中,6-BA使用最为广泛(Bouza et al.,1994a; Albers et al.,1992),然而,其单独使用时增殖率较低,且无法促进试管苗的高生长(Gabryszewska,1998),这与本研究的结果一致;6-BA只有与GA3(Bouza et al.,1992; 1994a; 1994b)、NAA(孟清秀等,2011)、KT(李玉龙等,1984)等配合使用,才有利于不定芽的增殖及向高生长。本研究将6-BA与GA3,NAA,KT,TDZ配合使用,结果表明:0.5 mg·L-1 6-BA与0.2 mg·L-1 GA3配合使用,在继代周期为40天情况下,能实现3.87的增殖系数,且试管苗生长健壮、节间伸长明显、愈伤组织发育不明显,是凤丹牡丹FD10试管苗离体增殖最佳PGRs组合;而使用NAA,KT和TDZ与6-BA组合处理中,试管苗增殖系数均较低,且愈伤组织较发达或节间距缩短,不利于增殖培养。

生根困难一直是观赏牡丹离体快繁技术研究的难题(Wang et al.,2001Qin et al.,2012),提高生根率与生根质量,同样也是建立凤丹牡丹离体快繁技术的关键。牡丹、马大杂种相思(Acacia mangium×A.auriculiformis)、巨桉(Eucalyptus grandis)等多种木本植物组织培养生根阶段常用1/2 MS培养基(Qin et al.,2012; 施琼等,2014; 石大兴等,2003),添加一定浓度(1.0 mg·L-1)的腐胺可有效提高紫斑牡丹多个品种的试管苗生根率(邱金梅,2010)。已有研究表明,4 ℃左右暗培养条件可抑制酶活性、减少酚类物质氧化、促进试管苗营养物质吸收,从而促进其生根(贾文庆等,2013; Beruto et al.,2004);此外,生长素类物质中,以IBA诱导生根效果最好,其最佳使用浓度因品种不同而异(Albers et al.,1992; Beruto et al.,2007; Wang et al.,2012; 李萍,2007)。本研究在两步生根法的根原基诱导阶段,以1/2 MS(CaCl2加倍)+ 腐胺1.0 mg·L-1为基本生根培养基,选取4 ℃处理时间及IBA浓度为研究对象,结果表明,4 ℃低温诱导处理8天,结合在培养基中添加2.0 mg·L-1 IBA,生根率最高,且基部愈伤组织少,利于后期移栽成活,这与贾文庆等(2013)李萍(2007)的结论相一致。

驯化移栽是植物离体快繁技术的最后一个阶段,也是需要克服的又一个障碍。大量研究表明,牡丹生根苗的质量直接影响后期移栽成活,获得高质量的生根苗是后期移栽成活的关键(Qin et al.,2012; 邱金梅,2010)。本研究将单株FD10继代6次后的试管苗进行生根,并将生根苗以愈伤组织大小为主要分级标准,分为3级分别进行移栽,60天后仅没有明显愈伤组织形成的1级苗移栽成活率为66.67%,2级与3级苗则逐渐全部死亡。生根苗基部愈伤组织越多,移栽成活率越低,这与观赏牡丹的表现一致。其原因一方面是由于大量愈伤组织发生时,根茎间形成离层、使不定根与茎间的维管组织连接不畅,阻碍了养分和水分的吸收(贾文庆等,2013);另一方面是移栽后愈伤组织极易腐烂导致植株死亡(Qin et al.,2012)。因此,进一步提高组培苗生根质量,不仅是优化凤丹牡丹离体快繁技术体系中第3阶段生根、也是第4阶段移栽的重要问题,是关系到油用牡丹离体快繁技术能否进入实际应用的关键,值得进一步深入研究。

4 结论

本研究从基因型筛选入手,从17个高产凤丹牡丹单株中筛选出7个适宜启动培养的单株,并针对优株FD10在增殖、生根及移栽阶段存在的问题,开展系统的试验研究,首次建立了凤丹牡丹离体快繁技术体系:初春采鳞芽外植体,在WPM + 6-BA 0.5 mg·L-1+GA30.2 mg·L-1培养基中启动离体培养;最佳增殖培养方案为WPM[Ca(NO3)2 1 544 mg·L-1]+ 6-BA 0.5 mg·L-1+ GA3 0.2 mg·L-1;最佳生根培养方案为培养基1/2 MS + IBA 2.0 mg·L-1+ 腐胺1.0 mg·L-1,诱导初期冷处理8天;生根质量是试管苗移植成活的关键,在所得生根苗中,1级苗占比84%,移栽60天后成活率66.67%。

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