林业科学  2016, Vol. 52 Issue (3): 59-67   PDF    
DOI: 10.11707/j.1001-7488.20160307
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文章信息

徐凤华, 程龙军, 魏晓玲, 窦锦青
Xu Fenghua, Cheng Longjun, Wei Xiaoling, Dou Jinqing
巨桉低温胁迫响应基因EgrCR的表达与功能
Expression and Function of EgrCR Gene Responding to Cold Stress in Eucalyptus grandis
林业科学, 2016, 52(3): 59-67
Scientia Silvae Sinicae, 2016, 52(3): 59-67.
DOI: 10.11707/j.1001-7488.20160307

文章历史

收稿日期:2015-04-17
修回日期:2015-05-18

作者相关文章

徐凤华
程龙军
魏晓玲
窦锦青

巨桉低温胁迫响应基因EgrCR的表达与功能
徐凤华, 程龙军, 魏晓玲, 窦锦青    
浙江农林大学亚热带森林培育国家重点实验室培育基地 临安 311300
摘要【目的】 通过对巨桉中冷响应基因EgrCR(Eucgr.B02857)的蛋白序列特征、亚细胞定位、低温等非生物逆境条件下的表达以及拟南芥中该基因超表达株系的表型分析,探讨EgrCR基因在巨桉响应低温等非生物逆境中的作用。【方法】 利用Protparam,PSIPRED,TMHMM,MatInspector和MEGA等生物信息学软件,预测EgrCR编码蛋白结构特征、启动子上的重要顺式作用元件,并构建其同源蛋白序列进化树;同时,采用基因枪轰击洋葱表皮方法进行基因编码蛋白亚细胞定位分析;组织特异性表达及低温等非生物逆境及昼夜节律下的表达分析,分别采用半定量和定量RT-PCR方法。通过构建35S::EgrCR超表达载体转化拟南芥,观察转基因株系在不同低温(0,4℃)处理下的表现,研究该基因对低温响应的功能特性。【结果】 EgrCR编码的蛋白序列含有144个氨基酸,二级结构中包含4个α螺旋、3个β折叠,没有预测到结构域、跨膜域的存在。在进化的亲缘关系上,EgrCR与毛果杨中的同源蛋白亲缘关系最近,氨基酸序列相似度达到68%。在其启动子序列上含有多个与植物逆境响应相关的顺式作用元件。亚细胞定位结果表明其编码蛋白在核中表达。正常条件下,EgrCR主要在茎和叶中表达。不同低温(0,2,4,6,8℃)处理和4℃低温下随处理时间(2,6,12,24,48 h)的延长,EgrCR受到强烈的诱导。ABA(100 μmol·L-1)对EgrCR表达没有明显影响,而NaCl(200 mmol·L-1)处理下则表现为先抑制后促进。昼夜节律也影响EgrCR的表达,光照下基因表达被诱导,黑暗条件下基因表达受抑制。拟南芥中EgrCR超表达转基因株系4℃处理条件下,花青素苷积累现象减轻; 0℃处理3天再恢复生长1周后,超表达株系能快速恢复生长,表现出较强的耐低温能力。【结论】 EgrCR基因参与巨桉低温胁迫响应,还可能参与巨桉的高盐胁迫响应,昼夜节律对其表达也有影响。
关键词巨桉    EgrCR    低温胁迫    基因表达    基因功能    
Expression and Function of EgrCR Gene Responding to Cold Stress in Eucalyptus grandis
Xu Fenghua, Cheng Longjun, Wei Xiaoling, Dou Jinqing     
The Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture Zhejiang A & F University Lin'an 311300
Abstract: [Objective] The protein structure, subcellular localization and expression with treatment of abiotic stresses for EgrCR(Eucgr.B02857), a cold responsive gene in Eucalyptus grandis, were characterized. And, the phenotype of Arabidopsis thaliana lines which over-expressed EgrCR were also analyzed to elucidate the roles it played in response to low temperature and other abiotic stresses in E. grandis. [Method] The characterization of EgrCR protein, cis-elements in promoter sequence of the gene and construction of phylogenetic tree of homologous proteins of EgrCR in different plants were analyzed with Protparam, PSIPRED, TMHMM, MatInspector and MEGA softwares. Subcellular localization of EgrCR was characterized with the method of introducing EgrCR-GFP fused genes into onion epidermal cells via gene gun bombardment. Gene expression analysis under treatments of abiotic stresses and circadian rhythm were carried on by semi-quantitative and quantitative RT-PCR methods respectively. The 35S::EgrCR over-expression vector was constructed and transformed into Arabidopsis thaliana, and the phenotypes of transgenic plants under different low temperatures (0, 4℃) were analyzed to elucidate the function of EgrCR under the treatment of low temperature. [Result] The protein encoded by EgrCR contains 144 amino acids and there were 4 α helixes and 3 β sheets. No domain and trans-membrane region were found in the protein. The phylogenetic tree based on homology comparison showed that it was closed to its homologous protein in Populus trichocarpa, sharing a 68% protein similarity for them. To the promoter sequence of EgrCR, Some cis-elements related with plant stresses response were found in it. Nuclear localization for EgrCR merged protein with GFP implied EgrCR was located in the nucleus. Under normal condition, EgrCR were mainly expressed in stems and leaves, and qRT-PCR result of EgrCR under 0, 2, 4, 6, 8℃ and time course (2, 6, 12, 24, 48 h) treatments at 4℃revealed that it was induced strongly by low temperature. In addition, EgrCR expression was not influenced by 100 μmol·L-1 ABA. However, under the salt stress (200 mmol·L-1), it was inhibited firstly and then induced. Circadian rhythm also regulates the EgrCR expression, and the transcription level of it was promoted under light and hampered in the darkness. When Arabidopsis thaliana transgenic lines of EgrCR overexpression were treated at 4℃, the accumulation of anthocyanin was reduced obviously. And, with one week recovery after 3 days treatment at 0℃, the transgenic lines can return to grow quickly, showing cold resistance compared to the wild type.[Conclusion] The EgrCR was involved in responses to cold and salt stresses in Eucalyptus grandis. Circadian rhythm also had an effect on its expression.
Key words: Eucalyptus grandis    EgrCR    cold stress    gene expression    gene function    

低温作为主要的非生物逆境因子严重影响植物生长发育、经济产量以及地理栽培范围。为了应对低温逆境伤害,植物在长期进化过程中形成了一系列低温应答机制。在这些响应过程中,由基因表达控制的生理代谢和形态调整几乎涉及了植物生长、发育的各个方面(Chinnusamy et al.,2004; Krasensky et al.,2012)。

植物对低温胁迫响应在生理代谢层面上,包括植物激素(ABA、生长素、乙烯等)水平的改变(Rahman,2013; Shi et al.,2014)、膜质组成的变化以及渗透调节物质(可溶性糖、脯氨酸和甜菜碱等)的积累。在分子水平上,ICE1-CBF-CORs途径是目前了解较为详细的植物响应低温胁迫的分子路径。在该途径中,低温导致的Ca2+信号变化能够使ICE1(1个MYC型bHLH转录因子)磷酸化而激活,进而启动CBF(C重复结合因子,C repeat binding factors)/DREB(干旱响应原件结合因子,dehydration responsive element binding factors)类基因的表达(Chinnusamy et al.,2003)。CBF编码的蛋白能够和下游冷调节基因CORs(cold regulated genes)启动子区域的CRT(C重复序列,C repeat)/DRE(干旱响应原件,dehydration responsive element)顺式作用元件结合,激活它们的转录,参与冷诱导效应的形成(Liu et al.,1998; Thomashow,1999; Maruyama et al.,2012)。冷胁迫响应相关的基因中,大约有12%属于CBF途径。因此,除了CBF途径外,还有被称为不依赖于CBF的分子途径参与了冷胁迫响应(Fowler et al.,2002)。ABA依赖的冷信号转导途径是另一个参与植物冷胁迫响应的分子机制,转录组分析表明,ABA响应的基因中约10%同样对冷胁迫也有响应(Kreps et al.,2002)。RD29ARD22COR15ACOR47COR基因启动子上,不仅含有CRT/DRE顺式作用元件,也含有脱落酸响应顺式作用元件(ABRE)(Uno et al.,2000)。ABRE的结合蛋白基因ABI3在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中的超表达,能够提高植株的抗寒性(Tamminen et al.,2001)。另外,一类锌指结构蛋白(ZFP,zinc finger proteins)转录因子参与的低温调控途径可能也独立于CBF途径,拟南芥中的ZAT12负调控CBF3,但超表达ZAT12同样可以提高植株的抗寒性;通过基因芯片技术对ZAT12调节的下游基因进行分析,发现有24个COR基因表达发生变化(Vogel et al.,2005)。在巨桉(Eucalyptus grandis)中也发现了多个与低温胁迫响应相关的ZFP基因(Wang et al.,2014)。

由此可见,植物冷胁迫调控的分子机制非常复杂。除了上述参与低温响应的基因外,仍有大量其他基因参与了冷胁迫效应。利用转录组对低温诱导下植物中基因表达变化的数据进行分析,发现拟南芥冷胁迫处理1周后,表达发生变化的基因有8 000多个,其中有相当数量未知功能基因具有明显的冷胁迫效应(Fowler et al.,2002)。对这些基因功能进一步的分析,有助于深入揭示植物冷胁迫响应的分子调控机制。本文在巨桉低温(4 ℃)不同时间处理的数字表达谱数据中筛选得到1个受低温强烈诱导的基因,命名为EgrCR(cold responsive),分析了该基因的特征和低温等不同逆境条件下的表达情况,并利用异源转化手段,在拟南芥超表达,初步对其响应低温胁迫的功能进行了分析。

1 材料与方法 1.1 材料

通过组培无性繁殖的巨桉幼苗种植于浙江省杭州市临安浙江农林大学的苗圃地。选取生长3个月,健康、长势一致的幼苗作为试验材料。试验处理在生长箱(Snijders MC1000,荷兰)中进行,正常培养条件为:日照16 h,日温28 ℃,夜温22 ℃,光强150 μmol·m-2s-1,相对湿度70%。试验处理完毕后收获所需根、茎和叶等组织,迅速放入液态氮中冷冻进行RNA提取。

1.2 EgrCR基因、蛋白序列及启动子元件分析

根据数字表达谱中EgrCR基因注释编号,即http://www.phytozome.net/search.php网站上巨桉基因组数据库的相应基因编号(Eucgr.B02857),将基因序列、蛋白序列在该网站下载。其蛋白的氨基酸序列在http://www.expasy.ch/tools网站中利用Protparam软件进行分子量、等电点的分析。其二级结构利用蛋白质序列二级结构预测分析网站http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/index.php中的PSIPRED软件进行分析。蛋白质跨膜结构域的预测则利用在线TMHMM2.0软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)来进行。

系统进化树的构建则是利用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)blast软件比对获得的EgrCR的同源蛋白序列来进行,对不同植物的EgrCR同源蛋白序列进行多序列联配,并用MEGA4.0软件(http://www.megasoftware.net/)构建1 000个自举重复的无根邻接树。

EgrCR基因起始密码子ATG为起点,截取其上游1.5 kb序列作为EgrCR的启动子序列,利用在线软件MatInspector(http://www.genomatix.de/cgi-bin//matinspector_prof)对序列进行分析。

1.3 冷胁迫处理

在生长箱中进行,25 ℃生长条件下的幼苗作为对照(CK)。0,2,4,6,8 ℃作为低温处理温度,每处理组3个重复,巨桉幼苗处理2 h后,收获叶片提取RNA备用。4 ℃低温下不同处理时间试验中,4 ℃低温培养箱中,采用先后间隔0,24,36,42,46 h依次放入处理苗的方法,分别作为48,24,12,6,2 h的低温处理组,每组处理3个重复。处理完成后统一提取处理苗的叶片RNA备用。

1.4 盐胁迫、ABA和昼夜节律处理

盐处理和ABA处理试验根据Kayal等(2006)的方法进行。从巨桉幼苗完整的完全展开的叶片上剪取直径1.5 cm的叶盘,分别在100 μmol·L-1ABA(DMSO作为ABA溶剂,终浓度为10%,含有10%DMSO的蒸馏水作为对照)和200 mmol·L-1NaCl溶液(以去离子水培养的同一无性系幼苗叶盘作为对照)中处理2,6,12,24 h,处理结束后提取叶片RNA。昼夜节律试验中,将桉树幼苗放生长箱中培养,培养条件为:光照25 ℃ 12 h,黑暗22 ℃12 h,相对湿度80%。以光照开始为起点,分别在0,4,8,12,16,20,24 h时间点收获处理植株叶片,提取RNA备用。

1.5 RNA的提取、cDNA合成及基因定量表达分析

根据王亚红等(2010)的方法提取处理材料的RNA。组织特异性表达分析以正常生长条件下的苗龄3个月的巨桉根、茎、叶为RNA提取材料。RNA反转录利用PrimeScriptRT reagent Kit(TaKaRa,大连,中国)试剂盒完成。

定量荧光染料SYBR-Green(Takara,大连,中国)和BIO-RAD CFX96实时PCR系统(Bio-Rad,USA)用于EgrCR基因的定量试验。以Egr18SrRNA作为内参基因,试验设3个重复。结果用Bio-Rad CFX Manager(Version 1.5.534)软件进行分析。引物序列见表 1

表 1 实时荧光定量、半定量、亚细胞定位及超表达载体构建所用引物序列 Tab.1 List of primer sequences used in RT-PCR, qRT-PCR, sGFP and 35S vector construction
1.6 EgrCR蛋白表达的亚细胞定位

设计引物(表 1),克隆用于EgrCR::sGFP载体构建的基因片段克隆,将PCR克隆得到的带有BamHⅠ和XbaⅠ酶切位点的EgrCR基因开放阅读框序列,插入到pCAMBIA1300载体为基础载体的35S-sGFP载体中。转化入大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α中,挑取阳性克隆,测序验证,提取质粒。通过PDS-1000/He型基因枪法(Xu et al.,1998)转化洋葱(Allium cepa)表皮细胞进行亚细胞定位。定位结果用激光共聚焦扫描显微镜观察,成像。

1.7 EgrCR超表达载体构建、拟南芥转化与转基因株系的低温处理

设计引物克隆EgrCR带有SmaⅠ和XbaⅠ酶切位点的全长基因序列(表 1),插入带有35S启动子序列的pCAMBIA1301载体上,构建35S::EgrCR超表达载体。电击转化农杆菌(Agrobacterium)EHA101。挑取阳性克隆测序验证后,进行扩大培养,菌液浓度摇至OD600为1.0时,加0.02% Silwet。拟南芥(Arabidopsis thaliana)选取盛花期植株,采用沾花法侵染。收获侵染植株种子后,用20 mg·L-1潮霉素(hygromycin)进行筛选,阳性植株继续繁殖,收获,筛选,直到获得转基因纯合阳性株系。转基因株系分别在4 ℃处理3天、6天后观察其表型变化。同时,还利用0 ℃处理转基因株系3天后再恢复1周,观察转基因株系生长情况。

2 结果与分析 2.1 EgrCR基因及蛋白序列分析

利用巨桉3个月龄幼苗,对低温(4 ℃)不同时间(2,6,12,24,48 h)处理条件下的表达谱数据进行分析,发现1个基因编号为Eucgr.B02857的基因表达水平在不同处理时间下相对于对照均有明显上调,将其命名为EgrCR。根据http://www.phytozome.net/search.php网站上下载的该基因序列数据并进行PCR验证,结果表明该基因转录本长度为634 bp,开放阅读框长435 bp,没有内含子,编码1个包含144个氨基酸残基的蛋白。Protparam软件预测其分子量为16.34 kDa,等电点为10.82。从目前已有的注释信息来看,该基因没有明确的功能域,为功能未知基因。PSIPRED分析系统对EgrCR蛋白二级结构进行预测,发现该基因编码蛋白序列包含4个α螺旋、3个β折叠片结构,其他为无规则卷曲(图 1)。TMHMM软件预测EgrCR蛋白序列也没有明显跨膜区域,序列中所有氨基酸序列位点的跨膜几率均小于0.2(图 2)。

图 1 EgrCR蛋白二级结构预测 Fig. 1 The secondary structure prediction of EgrCR protein sequence
图 2 EgrCR蛋白序列跨膜区分析 Fig. 2 Transmembrane region analysis of EgrCR protein sequence

Blast分析表明该基因编码蛋白的同源序列在植物中广泛存在,对12种植物的同源蛋白序列进行进化树构建发现EgrCR与与木本植物中的同源蛋白序列相似程度较高,其中与毛果杨(Populus trichocarpa)中的氨基酸序列相似程度最高,达到了68%;而与草本植物拟南芥和水稻(Oryza sativa)中的同源蛋白氨基酸序列相似程度都比较低,分别只有40%和41%(图 3)。

图 3 植物EgrCR同源蛋白的系统发育树 Fig. 3 Phylogenetic tree of homologous proteins of EgrCR in different plants
2.2 EgrCR启动子顺式作用元件分析

EgrCR 基因启动子序列中含有与植物非生物逆境胁迫密切相关的顺式作用元件,其中包括1个乙烯响应元件(EREF)、1个干旱应答元件(DREB)、9个MYB转录因子结合序列位点(MBS)、4个热击蛋白结合的顺式作用元件(HSE)、8个WRKY转录因子结合元件(W-BOX),此外,还有7个昼夜节律应答元件(CCA)(表 2)。

表 2 EgrCR基因启动子上的顺式作用元件 Tab.2 List of cis-element in the promoter of EgrCR
2.3 EgrCR蛋白表达的亚细胞定位

为了进一步了解EgrCR基因在细胞中所发挥的功能,确定其蛋白表达的可能部位,构建了EgrCR::GFP表达载体,利用基因枪轰击洋葱表皮的方法对EgrCR表达蛋白的亚细胞定位特性进行了研究。结果表明,在洋葱细胞中EgrCR蛋白定位在细胞核(图 4),暗示其作用的发挥可能主要在细胞核中进行。

图 4 EgrCR的亚细胞定位 Fig. 4 Subcellular localization of EgrCR
2.4 EgrCR组织特异性表达分析

对正常生长条件下,巨桉幼苗根、茎和叶不同的器官进行半定量RT-PCR分析,结果表明,巨桉正常生长状态下,EgrCR基因主要在茎和叶中表达,根组织中的表达量很低(图 5)。

图 5 巨桉EgrCR基因在根、茎、叶中的表达 Fig. 5 Analysis of EgrCR gene expression in root,stem and leaf in E. grandis
2.5 不同逆境条件及昼夜节律下EgrCR表达分析

qRT-PCR结果分析表明EgrCR基因在不同低温(0,2,4,6,8 ℃)下都被诱导表达。在温度为2 ℃时诱导表达量达到最高,相对表达量水平是对照的235倍(图 6a)。4 ℃不同处理时间EgrCR也均被诱导。在处理2 h后EgrCR表达量即为对照(25 ℃)处理的10.5倍,随着时间的延长,其表达水平相对于对照继续提高,处理48 h时,EgrCR相对于对照的表达倍数已达到113.4倍(图 6b)。说明低温处理对该基因的诱导非常强烈。

图 6 不同低温(a)和4 ℃不同时间(b)处理下EgrCR的相对表达差异 Fig. 6 Relative expression of EgrCR under different low temperatures (a) and time course treatment at 4 ℃ (b)

EgrCR在200 mmol·L-1盐胁迫处理下(图 7a),相对于未处理样品,基因表达先是受到抑制,处理2 h时,基因表达仅为对照的1/6左右,但随着处理时间的延长,这种抑制作用逐渐减弱; 24 h后,EgrCR相对于对照表现出表达上调现象。在100 μmol·L-1 ABA(图 7b)处理下,该基因的表达与对照相比,变化不明显。

图 7 盐胁迫(a)和ABA处理(b)下EgrCR的相对表达差异 Fig. 7 Relative expression of EgrCR under salt stress (a) and ABA treatment (b)

目前发现很多与逆境胁迫相关的基因表达都受到昼夜节律和光照的影响(Shi et al.,2014)。EgrCR的表达同样受光照诱导,受黑暗条件的抑制,光照8 h时达到最高诱导水平,随后有所下降。而随黑暗处理时间的延长,该基因受抑制的作用也不断加强(图 8)。

图 8 在昼夜节律下EgrCR的相对表达差异 Fig. 8 Relative expression of EgrCR under circadian rhythm
2.6 利用异源转化对EgrCR低温响应的功能分析

异源转化获得2个EgrCR超表达的拟南芥纯合株系EgrCR-OE1和EgrCR-OE2,在4 ℃处理条件下,随时间的延长,EgrCR-OE1和EgrCR-OE2的植株虽然也有花青素苷积累现象,但相对于野生型明显减弱(图 9)。而在0 ℃处理3天、25 ℃恢复1周后,野生型植株大部分死亡,EgrCR-OE1和EgrCR-OE2两个株系却开始恢复生长(图 10)。表明EgrCR基因在植物抗寒性功能发挥上具有一定作用。

图 9 4 ℃处理条件下拟南芥超表达EgrCR转基因株系的表型 Fig. 9 Phenotype of Arabidopsis thaliana transgenic lines of over-expression of EgrCR under 4 ℃ treatment
图 10 0 ℃处理3天恢复1周后拟南芥超表达EgrCR转基因株系的表型 Fig. 10 Phenotype of Arabidopsis thaliana transgenic lines of over-expression of EgrCR after 1 week recovery from treatment at 0 ℃ for 3 days
3 讨论

参与植物逆境响应的基因数目非常庞大,其中大多数尚未进行详细研究(Fowler et al.,2002)。本实验室前期于4 ℃不同时间处理的数字表达谱测序试验中发现了数量众多的低温响应基因,其中有相当一部分没有明确的功能注释,EgrCR基因就是其中1个,其随低温处理时间的延长,表达水平不断提高。其编码蛋白序列中没有发现已知的功能域和跨膜结构域。EgrCR蛋白同源序列在不同植物中广泛存在,但并没有其相关功能的研究报道,表明其属于一个尚未得到详细认知的可能参与植物低温胁迫响应的基因。亚细胞定位结果表明其主要在核中表达,但它是作为转录因子参与相关基因的转录调控,还是在核内发挥其他作用,仍需做进一步研究加以证实。EgrCR基因不同组织表达特异性分析表明,正常条件下,基因主要在茎和叶中表达,在根中表达量很低,暗示其功能的发挥可能主要在茎和叶器官中进行。

EgrCR基因启动子区域含有的顺式作用元件大多与逆境胁迫响应有关,如DREB元件被认为是CBF等低温和干旱胁迫相关转录因子结合序列(Baker et al.,1994); MBS和W-BOX元件则分别为MYB转录因子和WRKY转录因子结合的序列。相当多的MYB类转录因子参与了植物的生物和非生物逆境调控过程(Ambawat et al.,2013);而WRKY在植物抗病、非生物逆境响应、衰老及激素控制等过程中同样发挥重要作用(Bakshi et al.,2014)。此外,EgrCR启动子中的乙烯响应元件(EREF)和昼夜节律应答元件(CCA)的存在,暗示该基因功能的发挥可能受多种因素的影响。

无论在不同低温处理条件下,还是在低温(4 ℃)不同处理时间下,EgrCR都有非常明显的低温诱导效应,进一步证明该基因功能可能与低温胁迫响应的关系非常密切。与4,6,8 ℃低温处理相比,2 ℃低温对EgrCR的诱导作用最强,表明该基因对不同低温的响应敏感性不同。0 ℃条件下,诱导作用相对较弱,这可能是因为冷冻温度下,植株细胞中的代谢作用被削弱,导致分子响应的迟钝。低温在拟南芥中会导致花青素的积累,使叶色呈现为紫红色(Leyva et al.,1995)。EgrCR基因在拟南芥中超表达,转基因株系在低温处理下与对照相比,花青素苷积累现象明显减弱;同时,0 ℃处理再恢复的试验中,转基因株系的死亡率与对照相比也大幅度降低,恢复生长能力也比较强,表明其对低温造成的影响具有一定的抵抗能力。EgrCR低温处理条件下的表达和异源转化试验都表明了该基因可能在巨桉低温响应过程中发挥着重要作用。

参与不同逆境胁迫响应的基因之间存在复杂的互作关系(Huang et al.,2012)。某些基因还参与了多种非生物逆境胁迫的响应。如拟南芥中的COR15aRD29A既能被低温诱导,也能被干旱、高盐等脱水逆境条件诱导(Xiong et al.,2002)。超表达AtCBF1能提高转基因拟南芥植株对低温的抗性,而其在欧洲油菜(Brassica napus)、番茄(Solanum lycopersicum)中的表达还能提高转基因植株的抗旱性和耐盐性(Jaglo et al.,2001; Hsieh et al.,2002)。陆地棉(Gossypium hirsutum)中的GhDREB1L除了受低温诱导外,还在干旱和高盐条件下上调表达(Huang et al.,2007)。本研究中,定量RT-PCR结果表明,EgrCR基因在高盐处理时表现出先抑制后诱导的现象,表明该基因对盐胁迫也有一定响应。植物激素ABA含量水平在低温处理下会明显上升(Chen et al.,1983),低温响应的基因按照其与ABA的关系还可以分为ABA依赖性的和ABA非依赖性的2种(Xiong et al.,2002)。但从ABA处理下EgrCR的表达情况来看,该基因表达并不受ABA处理的影响,其作用的发挥可能是独立于ABA调控途径的。

另外,低温胁迫响应基因还受昼夜节律影响,参与昼夜节律调控的2个关键因子CCA1和LHY对CBF类基因都有正调控效应(Dong et al.,2011);拟南芥CBF1-3在低温条件下的表达变化除了与低温时间长短有关外,昼夜节律在其中发挥重要作用(Fowler et al.,2005);马铃薯(Solanum sogarandinum)中的SsBBX24基因表达也有明显的昼夜节律,同时该节律还会受低温等逆境影响(Kielbowicz-Matuk et al.,2014)。EgrCR的表达在24 h内同样受光照的诱导、黑暗的抑制,在光照条件下表达量表现出先上升后下降的趋势,体现出昼夜节律在该基因表达调控中发挥了重要作用,暗示昼夜节律可能也对该基因功能的发挥产生影响。其启动子序列上CCA昼夜节律相关顺式作用元件的存在,也在一定程度上证明了这一点。

4 结论

巨桉EgrCR基因在不同非生物逆境胁迫下的表达变化说明其参与了巨桉低温胁迫响应,同时它在巨桉高盐胁迫响应中也发挥一定的作用,昼夜节律对其表达也有影响。该基因的异源转化植株在低温下的表现进一步证明了该基因可能在植物的低温胁迫中发挥一定的功能。

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