林业科学  2016, Vol. 52 Issue (3): 30-35   PDF    
DOI: 10.11707/j.1001-7488.20160304
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文章信息

向伟, 喻艳, 刘静, 徐立, 黄先智, 丁天龙, 左少纯
Xiang Wei, Yu Yan, Liu Jing, Xu Li, Huang Xianzhi, Ding Tianlong, Zuo Shaochun
新疆药桑枝条中抗氧化活性成分sanggenon A的分离鉴定
Separation and Identification of the Antioxidant Compound Sanggenon A from Xinjiang Medicine Mulberry Branches
林业科学, 2016, 52(3): 30-35
Scientia Silvae Sinicae, 2016, 52(3): 30-35.
DOI: 10.11707/j.1001-7488.20160304

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收稿日期:2015-01-07
修回日期:2015-05-03

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向伟
喻艳
刘静
徐立
黄先智
丁天龙
左少纯

新疆药桑枝条中抗氧化活性成分sanggenon A的分离鉴定
向伟1, 喻艳1, 刘静1, 徐立1, 黄先智1, 丁天龙2, 左少纯2    
1. 西南大学生物技术学院 重庆 400716;
2. 新疆维吾尔自治区和田蚕桑科学研究所 和田 848000
摘要:【目的】分离鉴定新疆药桑枝条中的抗氧化活性成分,揭示其抗氧化功效的物质基础,为发现新的天然抗氧化成分及新疆药桑的开发利用提供理论依据。【方法】将新疆药桑枝条利用70%乙醇冷浸的方法提取,滤液低温减压浓缩; TLC(薄层层析)与DPPH(1,1-二苯基-2-苦基苯肼)相结合的方式进行活性检测;以紫外显色、10%硫酸乙醇显色的方式进行物质检测;在活性跟踪下通过不同有机溶剂萃取分段、多次硅胶柱层析、凝胶柱层析及薄层层析,对新疆药桑枝条中抗氧化活性成分进行分离纯化。将分离得到的化合物以氘代氯仿为溶剂,TMS(四甲基硅烷)为内标,利用MS(质谱)及NMR(核磁共振)技术进行波谱测定及结构解析。以人工合成抗氧化剂BHT(2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚)为对照,进行清除DPPH自由基、OH自由基及总还原力的测定。【结果】从新疆药桑枝条乙酸乙酯萃取部分中分离得到1种易溶于甲醇及乙酸乙酯的深黄色粉末,根据其理化性质初步判断为黄酮类化合物。结合其理化性质并通过MS,1H-NMR,13C-NMR,DEPT的波谱数据分析,确定其为已知化合物sanggenon A(桑根酮A),分子式为C25H24O7,分子量为436。抗氧化活性研究表明,其清除DPPH自由基和OH自由基的IC50值分别为50.3和96.5 mg·L-1(对照BHT分别为64.2和231.6 mg·L-1),总还原力也明显高于对照。【结论】本文首次从桑树的枝条中分离得到该物质,拓展了提取分离该物质的原材料来源,可为新疆地区广泛种植的林业资源的开发利用提供理论基础。
关键词新疆药桑    枝条    sanggenon A    分离鉴定    黄酮    抗氧化活性    
Separation and Identification of the Antioxidant Compound Sanggenon A from Xinjiang Medicine Mulberry Branches
Xiang Wei1, Yu Yan1, Liu Jing1, Xu Li1, Huang Xianzhi1, Ding Tianlong2, Zuo Shaochun2     
1. College of Biotechnology, Southwest University Chongqing 400716;
2. Hetian Sericultural Research Institute of Xinjiang Uygur Autonomous Region Hetian 848000
Abstract: [Objective] Xinjiang medicine mulberry branches are characterized by their strong antioxidation, but have been untapped as by-products which are annually and largely produced in sericulture. Study on separating and identifying antioxidant active component from Xinjiang medicine mulberry branches can reveal their physical basis of antioxidation, and provide a theoretical foundation for discovery of new natural antioxidant component and for exploitation of Xinjiang medicine mulberry. [Method] The components in medicine mulberry branches are extracted with 70% ethanol and concentrated by reducing pressure at low temperature. Together with DPPH (1, 1-diphenyl-2 picrylhydrazyl), TLC (thin layer chromatography) was applied in activity detection, while ultraviolet spectrophotometry was used to detect the active substances with 10% sulfuric acid-ethanol solution coloration. Based on the activity tracking, separation and purification of the antioxidant compound in medicine mulberry branches were achieved by different organic solvents extraction and segmentation, repeated silica gel column chromatography, gel column chromatography and thin-layer chromatography. With deuterated chloroform as the solvent and TMS (tetramethylsilane) as the internal standard substance, the MS (mass spectra) and NMR (nuclear magnetic resonance) techniques were employed to make spectrum and structure analysis on the compound, and then DPPH free radical and OH free radical scavenging, as well as the total reducing power assay are proceeded with the synthetic antioxidant BHT as a control. [Results] The deep yellow powder, freely soluble in methanol and ethyl acetate, was separated from Xinjiang medicine mulberry branches with ethyl acetate extraction. According to its physical and chemical properties, the powder is classified as flavonoids by preliminary judgment, and then with spectral data analysis by MS, 1H-NMR, 13C-NMR, and DEPT, it was finally identified as the known compound, sanggenon A, and its molecular formula is C25H24O7, with the molecular weight of 436 Dalton. The antioxidant activity study showed that the IC50 values of scavenging DPPH radical and OH radical were 50.3 mg·L-1 and 96.5 mg·L-1, respectively (the IC50 values of the control BHT were 64.2 mg·L-1 and 231.6 mg·L-1, respectively). The total reducing power is significantly higher than the control BHT. [Conclusion] The antioxidant component, Sanggenon A, is firstly separated from mulberry branches in this study, which expands the sources of raw materials for extraction and separation of the component. In addition, this study provides theoretical basis for the further study of Sanggenon A and for exploitation of medicine mulberries that, as a forestry resource, are widely cultivated in the region of Xinjiang. The mechanism of the Sanggenon A production in mulberry branches remains further study.
Key words: Xinjiang medicine mulberry    branch    sanggenon A    separation and identification    flavonoid    antioxidant activity    

新疆药桑属于桑科(Moraceac)桑属(Morus)黑桑种(Morus nigra),原产于伊朗,16世纪引入我国,主要栽种于新疆南部和田、喀什、阿克苏等地,是新疆地区特有的自然22倍体桑树。其生长环境属大陆性荒漠气候,干旱少雨,昼夜温差大,独特的地理环境及特殊的染色体倍数使得新疆药桑体内化学成分的组成及含量有别于普通桑树。目前关于新疆药桑的化学成分研究主要集中在黄酮、多糖、生物碱及二苯乙烯类化合物(蒋昊等,2011)。新疆药桑中主要黄酮类化合物有桑色素、芦丁、花青素和其他黄酮类化合物及其衍生物,前人对其黄酮类化合物进行了较多提取分离研究: 周林等(2011)将新疆药桑枝条提取物经乙酸乙酯萃取,聚酰胺分离2次纯化出了桑色素,阿娜姑·托合提(2012)从药桑叶乙酸乙酯部分分离得到了含一分子葡萄糖的槲皮素和山奈酚,杨玲等(2012)对新疆药桑椹中花色苷进行分离鉴定,初步确定了矢车菊-3-O-芸香糖苷,天竺葵-3-O-芸香糖苷,矢车菊-3-O-葡萄糖苷,天竺葵-3-O-葡萄糖苷4种成分。江岩等(2015)将新疆药桑椹花青素提取物中分离纯化得到了飞燕草色素、芍药花色苷、矢车菊花色苷及牵牛花色苷等4个化合物。

新疆药桑具有良好的药理活性,目前在维吾尔地区人们主要是利用其桑椹作为传统的民族药材治疗扁桃体炎、咽喉肿痛等,基于药桑桑椹开发的多种产品因具有良好的药理活性深受消费者喜爱(卢红等,2011)。近年来,国内外科学家发现其枝条具有很好的抗氧化活性(刘静等,2013; Abbas et al.,2014)。许多研究表明,细胞代谢过程中会不断产生自由基,正常情况下代谢所产生的自由基能被机体自身清除,若是机体或环境发生改变,就会产生过量的自由基攻击生命大分子如蛋白质、DNA、脂质等,进而引起机体的衰老及众多疾病的发生,故此时就需要外源抗氧化剂的参与以清除过量的自由基,而目前在很多人工合成抗氧化剂安全性受到质疑(Ito et al.,1986; Takahashi et al.,1978),寻找安全的天然植物源抗氧化成分已经成为研究趋势(吕双双等,2013; 谭榀新等,2010; Naczk et al.,2006)。本文对新疆药桑枝条中的抗氧化活性成分进行分离鉴定,将有利于发现一些新的安全性较高的天然抗氧化剂,同时也有助于新疆药桑这一特殊桑树资源的开发利用。

1 材料与方法 1.1 试验材料

试验材料: 秋季剪伐的新疆药桑枝条,由新疆维吾尔自治区和田蚕桑科学研究所提供。

分离填充材料: 柱层析硅胶(80~100目、200~300目、H硅胶,青岛海洋化工有限公司),薄层层析硅胶板(0.15~0.2 mm,HSGF254,烟台江友硅胶开发有限公司),Sephadex LH-20(sigma)。

试剂: 乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇(工业级,重庆市钛新化工有限公司),氯仿、甲醇、无水乙醇(AR级,成都市科龙化工试剂厂),DPPH(Sigma-Aldrich)。

试验仪器: DLSB型低温冷却液循环泵(巩义市予华仪器有限责任公司),BUCHI R-210旋转蒸发仪(瑞士Buchi公司),SHZ型循环水真空泵(河南省予华仪器有限公司),20 L旋转蒸发仪(巩义市予华仪器有限责任公司),ARX-600、AV-600核磁共振仪(Bruker公司),Auto Spec3000质谱仪(VG公司),iMark酶标仪(BIO-RAD公司),定制层析柱(重庆渝北亚新玻璃厂)。

1.2 试验方法 1.2.1 化合物的分离纯化及结构鉴定

将新疆药桑枝条风干粉碎,70%乙醇提取3次,过滤,滤液合并,低温减压浓缩至浸膏,分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取并低温低压浓缩。将乙酸乙酯部分上80~100目的硅胶柱,用石油醚: 乙酸乙酯=2:1进行洗脱,洗脱部分通过TLC(薄层层析)与DPPH活性检测相结合的分析方式,再辅以紫外显色、10%硫酸乙醇显色等,根据相同或相近合并的原则进行归类合并。将第1部分(活性好)用200~300目硅胶柱,以石油醚:乙酸乙酯(80:20—65:35—50:50—35:65—20:80—0:100)进行梯度洗脱,利用如上的合并方法和原则得到9个部分,将活性好的第7部分通过多次Sephadex LH-20、H硅胶、制备TLC分离,最终得到化合物M。以氘代氯仿为溶剂,TMS(四甲基硅烷)为内标,利用600 MHz谱仪对化合物M进行波谱测定及结构解析。

1.2.2 化合物清除DPPH自由基活性

清除DPPH自由基活性测定参考周玮婧等(2012)的方法,取不同浓度样液2 mL同2×10-4 mmol·L-1的DPPH甲醇溶液2 mL混合,37 ℃水浴30 min后于515 nm下测定其吸光值,对照组以等体积ddH2O代替样液,空白以等体积甲醇代替DPPH溶液。以人工合成抗氧化剂BHT(2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚)为对照,设置3个重复。

清除率(%)=1-(A1-A2)/A3 ×100%,其中: A1为样品组吸光值; A2为空白组吸光值; A3为对照组吸光值。

1.2.3 化合物清除OH自由基的活性

清除OH自由基活性参考王传宏等(2014)的方法,取1.5 mmol·L-1 FeSO4 1.5 mL同6 mmol·L-1 H2O2 1 mL混合,37 ℃水浴30 min后,加入20 mmol·L-1水杨酸0.5 mL,同时加不同浓度样液并用70%乙醇补齐至4 mL,37 ℃水浴30 min,于562 nm下测定吸光值。以人工合成抗氧化剂BHT(2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚)为对照,设置3个重复。计算清除率。

1.2.4 化合物总还原力测定

总还原力的测定参考刘静等(2013)的方法,取100 μL样品液,依次加入pH6.6的磷酸盐缓冲液和10 g·L-1的K3Fe(CN)6各1.0 mL,于50 ℃水浴20 min,快速冷却并依次加入10%三氯乙酸、蒸馏水和1 g·L-1的三氯化铁各1.0 mL,每次添加后混匀,静置10 min后于700 nm下测定其吸光值。以人工合成抗氧化剂BHT(2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚)为对照,设置3个重复。

2 结果与分析 2.1 化合物M的理化性质

该化合物为深黄色粉末,易溶于甲醇及乙酸乙酯,在GF-254硅胶板上用石油醚: 乙酸乙酯=5:1进行TLC分析,Rf=0.75处有一圆形斑点,该斑点在自然光下呈黄色,在254,365 nm下为黑色暗斑,用10%硫酸乙醇溶液喷洒,高温烘烤后显红棕色斑,初步判断该化合物可能为黄酮类化合物。

2.2 化合物的波谱数据及结构解析

通过EI-MS分析,得到该化合物的分子质量为436,结合其NMR谱可推断出分子式为C25H24O7,根据其理化性质及1H-NMR,13C-NMR,DEPT谱进行结构解析: 化合物的理化性质及δH 11.49(1H,s,H-5)表明其为C5位有OH的黄烷酮衍生物。δH 1.38(3H,s,H-17)、1.42(3H,s,H-18),6.57(1H,d,J=12.0 Hz,H-14),5.48(1H,d,J=12.0 Hz,H-15)信号为一组二甲基苯并吡喃环,其中前2个为端甲基信号,后2个1H、d峰提示为双键所在位置,且此环为二元取代。δH1.60(3H,s,H-12),1.52(3H,s,H-13),2.75(1H,dd,J=12.0,6.0 Hz,H-9)、3.06(1H,dd,J=12.0,6.0,H-9)、5.06(1H,m,H-10)为一组二甲基烯丙基信号,其中前2个为2个端甲基信号,9号位上亚甲基2个质子信号2.75与3.06并不相等,这表明此二甲基烯丙基连接在不对称结构中。δH 5.76(1H,s,H-8)的黄酮A环信号只能位于8号位环上6,7号位为二甲基苯并吡喃环。δH 6.43(1H,d,J=3.0,H-3')、6.49(1H,dd,J=6.0,3.0 Hz,H-5')、7.31(1H,d,J=6.0 Hz,H-6')为黄酮B环上3个H信号,根据其耦合裂分分别归属到3',5',6'位,B环在2'跟4'被取代。其波谱数据与文献报道(Hano et al.,1997)的基本一致,故最终确定其为sanggenon A(桑根酮A),其波谱数据归属和结构分别如表 1图 1所示。

表 1 化合物M的13C-和1H-NMR谱 Tab.1 13C-and 1H-NMR spectral data of compound M
图 1 化合物M的化学结构式 Fig. 1 Chemical structure of compound M
2.3 化合物清除DPPH活性

对sanggenon A进行清除DPPH自由基的活性测定(图 2),在低浓度时sanggenon A的清除能力略低于BHT,随着浓度的升高,其清除DPPH的能力显著增强并逐渐超过BHT,通过统计学软件SPSS 19.0,求出其IC50为sanggenon A: 50.3 mg·L-1(对照BHT为64.2 mg·L-1)。

图 2 sanggenon A清除DPPH自由基的能力 Fig. 2 DPPH radical scavenging capacity of sanggenon A
2.4 化合物清除OH自由基的活性

sanggenon A清除能力显著高于对照组BHT,但在80 mg·L-1(此时其清除率为50%左右)以后,其清除能力随浓度的增大变化明显减缓,通过统计学软件SPSS 19.0求出sanggenon A的IC50值为96.5 mg·L-1(对照BHT为231.6 mg·L-1)(图 3)。

图 3 sanggenon A清除OH自由基的能力 Fig. 3 Scavenging hydroxyl radical activity of sanggenon A
2.5 化合物的总还原力

还原力是化合物抗氧化能力的重要指标,其700 nm下吸光值的大小反映了化合物的还原力大小,sanggenon A的总还原力明显强于对照BHT,并且其总还原力随浓度的增大而不断增加(图 4)。

图 4 sanggenon A的还原力 Fig. 4 Reducing power of sanggenon A
3 结论与讨论 3.1 讨论

Sanggenon(桑根酮)是桑树中存在的一类黄酮类化合物,前人分离得到的sanggenon类化合物均来自于桑根(Nomura et al.,1983; Nomura et al.,1980; Shi et al.,2001; Zelova et al.,2014),但根是桑树不可或缺的营养器官,这极大地限制了对其进行开发利用。前人研究发现,此类化合物具有很好的生物活性: Cui等(2006)发现桑根酮C和G在分子水平上具有很好的降血糖作用; Rollinger等(2006)发现此类化合物在体外有很好的抗苹果黑星病(Venturia inaequalis)病原菌作用; Li等(2002)发现桑根酮C能抑制人外周多形核白细胞(PMN)于人滑膜细胞(HSC)的粘附,可作为有效的人PMN与HSC粘附抑制剂; Huang等(2011)亦发现桑根酮C具有一定的抗肿瘤活性; Dat等(2012)发现桑根酮C,O在分子水平上有很好的抗炎活性; Zelova等(2014)从桑根、黑桑根中分离得到的桑根酮H和E,前者通过极显著的抑制TNF-α的表达而抗炎,后者亦有一定的抗炎效果,笔者首次从桑枝当中分离得到的sanggenon A表现出很好的抗氧化活性,其还具有很好的抗癌、抗菌、降血压等活性(Nomura et al.,1983; 周德文等,1997),关于其更多的生物活性还有待于进一步研究。目前,药桑枝条尚未被利用,作为来源丰富的林木资源、药桑椹生产中的副产物,充分发掘枝条中的活性成分,并对其进行开发利用具有重要的现实意义。

新疆药桑生长地属于干燥性的沙漠气候,土地荒漠,全年干旱少雨,有研究表明渗透调节和抗氧化保护同植物的抗旱性有着密切联系(Liu et al.,2011; Xu et al.,2011; 荣智媛等,2012; Wang et al.,2012)。sanggenon A的酚羟基能与糖类结合成糖苷类化合物,从而进行渗透压的调节,来抵御沙漠地区的干旱环境,并且其具有良好的抗氧化活性,在其他桑树根中发现的此化合物存在于新疆药桑枝条中,这些是否同药桑抗旱性有关还有待进一步研究。

3.2 结论

从新疆药桑枝条中分离得到的sanggenon A具有很好的抗氧化活性,其清除DPPH自由基、OH自由基的能力以及总还原力均强于对照BHT,具有开发成天然抗氧化食品添加剂及保健品的前景。

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