橡胶树(Hevea brasiliensis)是天然橡胶最主要的来源，其乳管中的橡胶粒子是胶乳中最主要的成分(Moir，1959)。作为天然橡胶合成和贮存的特殊细胞器(Kush，1994; Cornish，2001)，橡胶粒子的研究一直都是人们关注的重点。通过解剖学、蛋白质研究手段对橡胶粒子的形态结构(吴继林等，1990；Siler et al., 1997；Wood et al., 2000)、膜蛋白组成及其功能(Dennis et al., 1989; Cornish，1993; Oh et al., 1999; Wititsuwannakul et al., 2008a；2008b；2008c; 段翠芳等，2006；Xiang et al., 2012; Dai et al., 2013; Berthelot et al., 2014a)等展开了广泛的研究，发现橡胶粒子是由单层生物膜即半个单位膜组成的球形结构(Cornish et al., 1999)，膜组分主要为脂类和其上结合的蛋白质(Dennis et al., 1989；Cornish，1993; Oh et al., 1999)，这些蛋白质中的橡胶延伸因子(rubber elongation factor，REF)(Dennis et al., 1989)、橡胶转移酶(Cornish，1993)、小橡胶粒子膜蛋白(small rubber particle protein，SRPP)(Oh et al., 1999)等与橡胶的生物合成密切相关。近年来，利用蛋白质组学研究技术较全面地获取了橡胶粒子上的蛋白质信息(Xiang et al., 2012; Dai et al., 2013)，开展了橡胶粒子膜蛋白复合体以及互作方面的研究(Berthelot et al., 2014b)，还对橡胶粒子上的一些膜蛋白进行了基因克隆、表达以及转录调控等分子生物学研究(彭世清等，2004；Wang et al., 2013；Guo et al., 2014)。这些研究为深入了解橡胶粒子的结构和功能奠定了基础。橡胶粒子的起源和发育与其功能息息相关，但目前对于橡胶粒子是如何产生的却知之甚少。当前关于橡胶粒子的起源主要有2种观点： 一种认为橡胶粒子是在胶乳中自由产生的(Dickenson，1969)；另一种认为该粒子可能起源于内质网(Southorn，1961)。结构复杂且数量庞大的橡胶粒子由细胞质自由产生比较难以想象，但起源于内质网却缺乏证据支持。本研究对不同发育时期的乳管细胞进行了超微结构的研究，探索不同的细胞器与橡胶粒子之间的联系，试图找到其起源之处。其结果将为研究橡胶粒子的功能提供新的思路，也为研究其他特殊细胞器的起源提供借鉴。

选取种植在中国热带农业科学院海南儋州试验农场9队的10年生橡胶树无性系GT1，用直径1.5 cm的打孔器采集健康树皮，包含周皮到形成层的全部组织。选取种植在儋州试验农场苗圃的无性系RRIM600芽接苗的健康萌条，用刀片采集幼嫩的顶芽和叶柄。所有样本立即浸泡到预冷的固定液中并迅速带回实验室，制备电镜超薄切片。

戊二醛、锇酸、环氧丙烷为 Sigma产品，乙醇、磷酸盐等为广州化学试剂厂国产分析纯，醋酸铀、柠檬酸铅、Epon 812等为上海生工生物工程有限公司产品。

参照吴继林等(1990)方法制备电镜超薄切片。材料分割成小块，4 ℃条件下，于4%戊二醛的0.1 mol·L^-1的磷酸盐缓冲液(pH7.2)中固定20 h，然后用同样缓冲液的2%锇酸于室温后固定6 h，乙醇系列梯度脱水，Epon 812包埋。LKB-V切片机制备超薄切片，经醋酸铀-柠檬酸铅染色后在JEM100-CX2电子显微镜下观察。

对萌条顶芽中刚分化的幼嫩初生乳管进行电镜观察(图 1A)，发现此时的乳管细胞原生质丰富，胞质浓厚，其中含有大量的线状内质网，核糖体丰富并常聚集形成聚核糖体。线粒体和将要发育成为Frey-Wyssling 复合体(F-W复合体)的原质体数量相对较少，分散在细胞中。作为乳管细胞特殊的细胞器——橡胶粒子，大部分处在发育的早期阶段，表现为电子致密的小球，直径小，分布在富含内质网和核糖体的细胞质中；少数橡胶粒子进一步发育，直径增大，中央区成为电子透明状态，周缘的界膜变得明显。因为乳管还处在最幼嫩的阶段，橡胶粒子总体数量很少。对这种幼嫩乳管进一步观察发现(图 1B，C)，在一些区域核糖体高度密集，并形成线状，电子致密的橡胶粒子与这些核糖体紧邻分布。

图1 电子显微镜照片，示初生乳管中橡胶粒子与其他细胞器的关系 Fig.1 The relationship of rubber particle with the other organelles in primary laticifer showed by transmitted electron microscope A. 萌条顶芽中刚分化的幼嫩初生乳管；B, C. 顶芽幼嫩初生乳管中核糖体和橡胶粒子的分布；D. 幼嫩叶柄中的初生乳管。 a-c. D图中的局部放大：a主要显示核糖体和橡胶粒子的分布；b主要显示核糖体和橡胶粒子以及内质网的分布；c主要显示乳管中的高尔基体，尤其是周缘的囊泡。RP: 橡胶粒子；Pp: 前质体；M:线粒体；G: 高尔基体。红色箭头示橡胶粒子；黄色箭头示内质网；蓝色箭头示核糖体；绿色箭头示高尔基体囊泡。 A. The young primary laticifer just differentiated from apical bud in shoot；B, C. The distribution of ribosomes and rubber particles in young primary laticifers in apical bud；D. The primary laticifer in tender petiole. a-c. The magnified local of figure D, therein, the figure a showing mainly the distribution of ribosomes and the rubber particles, the figure b showing the relationship of ribosome, rubber particle and endoplasmic reticulum, the figure c showing the Golgi body especially its vesicle. RP: Rubber particle; Pp: Proplastid; M: Mitochondria; G: Golgi body. Red arrow showing rubber particle; yellow arrow showing endoplasmic reticulum(ER); blue arrow showing ribosome; green arrow showing vesicle of Golgi body.

对幼嫩的叶柄中的初生乳管进行观察(图 1D)，其超微结构较顶芽中刚分化出的最初的乳管有所变化，主要表现为胞质变稀，细胞器逐渐发育完善，橡胶粒子数量增多。 对一些核糖体密集的区域进行放大，同样发现在一些呈线形分布的核糖体周围有电子致密的橡胶粒子(图 1a)。有的区域可以观察到这些核糖体与橡胶粒子是沿着内质网分布的(图 1b)。核糖体作为一种蛋白质生产机器，是由核糖体蛋白和核糖体RNA分子组成的，不存在生物膜结构，橡胶粒子不可能是由核糖体发育而来。大量电镜观察又发现最初形成的橡胶粒子常与排列成线形的核糖体分布在一起，根据核糖体常结合在内质网上以及内质网本身是脂质和蛋白质合成的主要场所的特征，推测橡胶粒子由内质网产生。

乳管细胞中高尔基体周围也常观察到球形结构(图 1c)，对高尔基体高倍放大观察后可知其扁平膜囊的周缘常呈泡状，但这些囊泡内部并非电子致密的均一物，与橡胶粒子明显不同。另外，高尔基体在乳管中的数量有限，很难形成数量巨大的橡胶粒子。

成龄橡胶树树皮中的次生乳管由维管形成层分化而来，生长发育中逐渐向树皮外层推移，从内到外可分为幼嫩乳管、成熟乳管和衰老乳管。对这些发育阶段不同的乳管进行超微结构观察，结果表明，幼嫩乳管中橡胶粒子尚未充满整个细胞(图 2A)，能够清晰地观察到其他的细胞器，如黄色体、F-W复合体、内质网、线粒体、高尔基体等；橡胶粒子的直径较小，主要处在发育的早期阶段，适合用来研究橡胶粒子与其他细胞器之间的联系。在内质网丰富的区域直径小的橡胶粒子数量较多，对该部分区域进行放大观察(图 2a，b)，发现在内质网上明显连接着一些球形的颗粒，这些颗粒内部呈现电子致密，直径大约为50 nm，颗粒外周有不明显的界膜，在稍大的颗粒中这种界膜变得清晰，并与游离在胞质中的橡胶粒子形态一致。这些颗粒应是处于最初发育阶段的橡胶粒子，由此可以认为，内质网是橡胶粒子的起源之一。

图2 电子显微镜照片，示次生乳管中橡胶粒子与其他细胞器的关系 Fig.2 The relationship of rubber particles with the other organelles in secondary laticifer showed by transmitted electron microscope A. 橡胶粒子较少的成龄橡胶树幼嫩乳管; a, b. 幼嫩乳管中局部放大，显示刚发育的橡胶粒子与内质网的关联; B. 幼嫩乳管中高尔基体与周边的橡胶粒子; C. 充满橡胶粒子的成龄橡胶树成熟乳管; D. 胶乳凝固的成龄橡胶树衰老乳管。ＲP: 橡胶粒子; EＲ: 内质网; G: 高尔基体。红色箭头示橡胶粒子; 绿色箭头示高尔基体囊泡; 黄色箭头示凝固的橡胶粒子。 A． The tender secondary laticifer contained sparse rubber particles near cambium in bark of mature rubber tree; a, b. The magnified local of tender secondary laticifer, showing the connection of developing rubber particles with the EＲ; B. Golgi body and peripheral rubber particle in tender secondary laticifer; C. The mature secondary laticifer filled with rubber particles; D. The ageing secondary laticifer within coagulated latex． ＲP: Ｒubber particle; EＲ: Endoplasmic reticulum; G: Golgi body. Ｒed arrow showing rubber particle; green arrow showing vesicle of Golgi body; yellow arrow showing coagulated rubber particles.

幼嫩乳管中高尔基体具有明显的扁平膜囊结构(图 2B)，膜囊周缘具有囊泡，这些囊泡内部存在一些分布并不均匀的颗粒物质，这与橡胶粒子内部为均一的电子致密物质明显不同，可见橡胶粒子起源于高尔基体的可能性不大。

在成熟乳管中(图 2C)，整个细胞几乎被橡胶粒子充满，很难观察到其他的细胞器。衰老乳管中(图 2D)直径较大的橡胶粒子多，并且这些橡胶粒子开始出现融合发生凝固，其他的细胞器膜结构模糊，开始衰老退化。

巴西橡胶树胶乳中存在3种特殊的细胞器，即橡胶粒子、黄色体和F-W复合体，其中橡胶粒子约占胶乳体积的30%～45%(Cook et al., 1953; Moir，1959)，是胶乳最主要的成分。橡胶粒子中合成和贮存的橡胶烃是重要的工业原料，这也是人们种植橡胶树获取胶乳的主要目的。目前已经对橡胶粒子的形态结构、蛋白质组成以及基因表达等多方面展开了研究，取得了很多重要的成果，但是橡胶粒子合成橡胶烃的本质或者说这种消耗巨大的次生代谢对于植物本身的意义何在目前尚不清楚，虽然提出了多种假说(Bonner et al., 1947; Kush，1994; Tangpakdee et al., 1998; 肖再云等，2009)，但都证据不足。割胶后在同一乳管中胶乳会再生，即重新合成胶乳组分，这就意味着大量的橡胶粒子需要再生成，这一过程是如何发生的，就必须要研究橡胶粒子的起源。橡胶粒子的起源不仅直接关系到胶乳的再生，而且有助于从根源上了解其功能，最终涉及到橡胶粒子合成橡胶的品质。

目前，关于橡胶粒子起源的研究较少，主要有2种观点： 其一是自由产生(Dickenson，1969); 其二是由一种线性结构的细胞器产生，推测为内质网(Southorn，1961)。但二者都没有获取直接有力的证据。与橡胶粒子类似，油体也是一种半单位膜组成的细胞器，大量研究表明油体主要是由内质网以出芽的方式形成的(Murphy et al., 1999; Hsieh et al., 2004;王晓茹等，2011)。油体的起源为研究橡胶粒子的起源提供了重要启示。

内质网在乳管中的分布广泛，从数量上完全可以实现大量的橡胶粒子再生；从功能上，内质网具有合成蛋白质以及膜脂的功能，而这些组分是形成橡胶粒子必须的。结合油体的起源，橡胶粒子起源于内质网的可能性非常大。

通过透射电镜观察橡胶粒子与其他细胞器之间的联系，首次发现内质网与最早期发育的橡胶粒子紧密连接在一起，而其他的细胞器与橡胶粒子没有直接的关系。由此提出内质网是橡胶粒子的重要起源之一的结论。另外，靠近形成层的幼嫩次生乳管细胞是研究橡胶粒子起源的最佳材料。本研究对深入阐释橡胶粒子的结构以及功能具有重要意义。同时也为其他特殊细胞器起源的研究提供了借鉴。

橡胶粒子可分为大橡胶粒子和小橡胶粒子(Moir，1959)，二者的膜蛋白质组分显著不同(Xiang et al., 2012; Dai et al., 2013)，合成的橡胶烃，分子质量也具有很大的差异(Yeang et al., 1995)。这2种不同类型的橡胶粒子是起源于内质网上不同特性的区域还是起源相同但在后来的发育中发生了改变目前尚不清楚。利用改进的胶体金标记免疫技术(Singh et al., 2003a；2003b)等手段，对大、小橡胶粒子上的标志性蛋白进行标记，有望探索不同类型橡胶粒子的起源，并进一步证明橡胶粒子和内质网之间的关系。