土壤微生物是土壤生态系统的重要组成部分，其参与土壤有机质的分解和腐殖质的形成，是土壤养分转化和循环以及有机碳代谢的主要驱动力(Dick et al.，1997)。土壤微生物对外界条件如土地利用以及管理措施等变化十分敏感，能及时反映土壤状况(Bucher et al.，2005)，同时监测土壤微生物群落状态和功能也能够很好地评价植被恢复的效果(刘占锋等，2007)。反映土壤微生物群落状态和功能的指标通常包括土壤微生物量和微生物群落代谢多样性(Rogers et al.，2001)，其中土壤微生物群落多样性反映了群落总体的动态变化，它可以通过检测微生物碳源利用程度来反映。Biolog方法可测定土壤微生物对不同碳源的利用能力和代谢差异，在一定程度上能够反映土壤碳源转化和土壤微生物多样性情况(鲁顺保等，2012)。该方法由于简单、快速等优点已被广泛用于评价不同土壤类型、不同土地利用方式和不同植被恢复的土壤微生物群落多样性(Zheng et al.，2005； 张海涵等，2009； 张燕燕等，2010； 刘秉儒等，2013； 胡婵娟等，2014)。

黄土峁状丘陵区是我国生态脆弱、水土流失严重的区域。在近几年大规模的退耕还林工程中营造了大量的坡地人工林，使该地区保留了大量立地条件、树种迥然不同的植被类型。研究表明，植物对土壤环境的重要影响之一是改变土壤微生物群落特征，且不同恢复植被对土壤微生物的影响存在差异(Söderberg et al.，，2002)。因此， 研究植被、微生物和土壤环境之间关系能更好地了解植被与土壤微生物之间的相互作用及植被恢复对土壤环境生物学方面的改善状况(向泽宇等，2014)。近几年关于该地区的研究，主要集中在植被恢复后土壤理化性质的变化特征、营养状况(Zhu et al.，2010； 隋媛媛等，2011； 王凯博等，2012)以及微生物区系特征方面(张文婷等，2008； Zhang et al.，2012)，而关于土壤微生物对植被恢复的响应以及不同植被恢复的土壤微生物代谢活性的研究较少(Zhang et al.，2013)。本试验在陕西省米脂县境内选取退耕还林中的主栽树种柠条(Caragana korshinskii)、刺槐(Robinia pseudoacacia)、油松(Pinus tabulaeformis)、侧柏(Platycladus orientalis)、新疆杨(Populus alba var. pyramidalis)等植被类型下土壤微生物为研究对象，以撂荒坡地为对照。利用Biolog-ECO微平板培养法探讨不同类型林分下土壤微生物群落代谢多样性，旨在从微生物的角度对当地典型植被类型做出评价，为该地区植被恢复提供参考。

试验区位于陕西省米脂县泉家沟(37°46′—38°50′N，109°49′—110°18′E)，属黄土高原峁状丘陵区，平均海拔1 049 m。气候属半干旱大陆性季风气候，年平均气温8.3 ℃，≥10 ℃的年平均积温3 400 ℃，年日照时数2 716 h，无霜期165天，干燥度1.14，年降雨量450 mm左右，多集中在7—9月，占到年降雨量的70%以上，每年有相当一部分降水形成径流流失。土壤为黄绵土，土层深厚，坡地自然植被群落稀疏。

于2012年6月下旬选取5块生长状况和立地条件较为一致的造林树种样地，即柠条、刺槐、油松、侧柏和新疆杨人工林，林龄均为10年，同时选取撂荒坡地为对照。每块样地随机设置3个5 m×5 m样方，每个样方用梅花形布点法取5个样点，除去表面可见的动物和植物残体，采集0—20 cm深5个点的土壤混合样，将每块样地采集的15个样点，每5个样点的土壤混合均匀得到3个平行样，装入无菌袋中带回实验室，置于4 ℃冰箱保存，用于土壤微生物功能多样性的测定。样地基本情况见表 1。

表 1 试验林地概况 Tab.1 Introduction of artificial forests

表 1 试验林地概况 Tab.1 Introduction of artificial forests 林分 Stand 坡度 Gradient/(°) 坡向 Aspect 坡位 Position 林分密度 Density/ (Tree· hm-2) 郁闭度 Canopy degree 平均树高 Mean tree height/m 胸径 DBH/cm 植被覆盖度 Vegetation coverage (%) 有机质 Soil organic matter/ (g·kg-1) 全氮 Total nitrogen/ (g·kg-1) 柠条Caragana korshinskii 25 EN20° 中Middle 1 592 0.7 1.5 2.3 75 3.98 0.29 刺槐Robinia pseudoacacia 26 EN15° 中Middle 1 325 0.6 6.5 5.6 70 4.56 0.30 油松Pinus tabulaeformis 27 EN20° 中Middle 1 203 0.6 4.5 8.8 50 3.54 0.22 侧柏Platycladus orientalis 28 EN10° 中Middle 1 150 0.5 2.7 7.3 45 2.35 0.25 新疆杨Populus alba var. pyramidalis 27 EN15° 中Middle 1 201 0.5 7.3 10.5 40 2.87 0.30 对照CK 27 WN15° 中Middle — — — — 60 2.53 0.26

称取相当于5 g干质量的新鲜土样加入至装有45 mL、0.85%NaCl无菌溶液的150 mL三角瓶中，摇床振荡30 min，转速为180 r·min^-1。将得到的微生物悬浮液采用10倍稀释法稀释至浓度为10^-3。在超净工作台上，接种微生物悬浮液于生态测试板中，每孔150 μL，每样1板，每板3次重复。将接种后的测试板加盖在30 ℃生化培养箱中连续培养240 h，每隔24 h用Biolog自动读数装置在590 nm下读数(张卫娟等，2011)。

Biolog-ECO微平板孔中溶液吸光值平均颜色变化率(average well color development，AWCD)的计算公式如下：

式中，C_i为各反应孔在590 nm的吸光度值，R为Biolog-Eco板对照孔A1的吸光度值，n为反应孔数，Biolog-Eco板n值为31，C_i-R小于零的孔，计算中记为零，即C_i-R≥0。

Simpson指数D=1-∑ P_i²，

Shannon指数H=-∑ P_i ×(lnP_i )，

McIntosh 指数E=H/lnS。

式中，P_i为第i孔的相对吸光值与所有整个微平板的相对吸光值总和的比值 (C_i-R_i)/ ∑(C_i-R_i)； S为颜色发生变化的孔数(AWCD>0.2代表该孔碳源被利用)(徐万里等，2015)。

数据分析在 SPSS 21.0 中进行，采用方差分析和LSD 比较不同类型林分土壤微生物群落多样性的差异性，显著性水平设定为α=0.05，利用Pearson相关系数评价Shannon指数、Simpson指数和McIntosh指数与土壤理化性质(有机质和全氮)的相关关系，相关图表制作在 Excel 2010中完成。

AWCD值反映了微生物的代谢活性，是土壤微生物群落利用单一碳源能力的一个重要指标(Zabinski et al.，1997)。计算不同类型林分土壤AWCD值的3次重复平均值，绘制AWCD值随培养时间的动态变化曲线。由图 1可知，每隔24 h测定的AWCD值随着培养时间的延长均呈增大趋势，表明5种类型林分土壤微生物利用碳源的量随着培养时间的延长逐渐增大，且各类型林分土壤微生物利用碳源的量均大于对照。土壤微生物群落的AWCD值均在24～96 h内迅速升高，随后持续缓慢地升高直到培养时间结束。AWCD值的快速增加表明微生物进入指数生长期，碳源被大量利用。在整个培养过程中，不同类型林分土壤微生物群落的AWCD值存在明显差异，大小顺序依次为： 柠条林>刺槐林>油松林>侧柏林>新疆杨林>对照，即柠条林土壤微生物代谢活性最强，刺槐林次之，而油松林、侧柏林和新疆杨林土壤微生物代谢活性相对较弱。

图 1 不同类型林分土壤微生物群落AWCD随培养时间的变化 Fig.1 Changes of soil AWCD in different forest types with incubation time

Shannon指数(H)、Simpson指数(D)和McIntosh指数(E)是表征群落多样性的常用指数，是研究群落物种数及其个体数和分布均匀程度的综合指标，是目前应用最为广泛的群落多样性指数(陈宏灏等，2011)。参考贾夏等(2013)的研究结果，本试验采用Biolog-ECO微平板培养96 h的数据进行微生物代谢多样性分析。由表 2可知，各类型林分土壤微生物多样性指数均较对照有所提高，但不同类型林分土壤微生物群落代谢多样性用不同指数表示时存在差异。柠条林土壤Shannon指数和Simpson指数显著高于刺槐林、油松林、新疆杨林和侧柏林(P＜0.05)，表明柠条林土壤微生物群落多样性以及种群丰富度较高。刺槐林土壤McIntosh指数显著高于其他4种类型林分(P＜0.05)，表明刺槐林土壤微生物分布相对均匀。

表 2 不同类型林分土壤微生物群落功能多样性指数^① Tab.2 Functional diversity indices of soil microbial communities in different forest types

表 2 不同类型林分土壤微生物群落功能多样性指数① Tab.2 Functional diversity indices of soil microbial communities in different forest types 林分 Stand Shannon(H) Simpson(D) McIntosh(E) 柠条C. korshinskii 2.96±0.02a 0.94±0.07a 1.10±0.02b 刺槐R. pseudoacacia 2.62±0.06b 0.91±0.01b 1.17±0.04a 油松Pinus tabulaeformis 2.60±0.06c 0.91±0.01b 1.03±0.03cd 侧柏Platycladus orientalis 2.12±0.04d 0.83±0.01c 1.03±0.03cd 新疆杨Populus alba var. pyramidalis 2.56±0.05bc 0.90±0.01b 1.07±0.04bc 对照CK 2.46±0.04c 0.90±0.01b 0.99±0.01d ①同列不同字母表示差异显著(P＜0.05)。Means in column followed by the different letters were significantly different at 0.05 level.

本研究中所用的Biolog-ECO板的31种碳源可以分为6类，包括糖类、氨基酸类、羧酸类、多聚物类、芳香化合物类和胺类。表 3为Biolog-ECO微平板培养96 h每类碳源的AWCD平均值。由表 3可知，5种类型林分土壤微生物对6类碳源的利用率均高于对照，而不同类型林分土壤微生物对6类碳源利用能力的大小差异显著。刺槐林土壤微生物对糖类利用率最高，柠条林次之，油松林、新疆杨林和侧柏林较低。土壤微生物对氨基酸类碳源利用率最大的为柠条林，刺槐林和油松林次之，侧柏林和新疆杨林较低。柠条林和刺槐林土壤微生物对羧酸类利用率最高，其次是油松林、侧柏林和新疆杨林。侧柏林土壤微生物对多聚物类利用率最高，柠条林次之。不同类型林分土壤微生物对多酚类和胺类的利用率均表现为柠条和刺槐林较高，其余林地之间差异不显著(P>0.05)。总体而言，在5种林分中柠条林和刺槐林土壤微生物对主要碳源利用率较高，油松林、侧柏林和新疆杨林土壤微生物对主要碳源利用率较低。糖类是5种林分土壤微生物的主要碳源，其次为氨基酸类、羧酸类和多聚物类，多酚类和胺类利用率最小。

表 3 不同类型林分土壤微生物对6类碳源的利用 Tab.3 Utilization of the six categories of carbon sources by soil microbes in different forest types

表 3 不同类型林分土壤微生物对6类碳源的利用 Tab.3 Utilization of the six categories of carbon sources by soil microbes in different forest types 树种 Tree species 糖类 Carbohydrates 氨基酸类 Amino acids 羧酸类 Carboxylic acids 多聚物类 Polymers 多酚类 Polyphenols 胺类 Amines 柠条C. korshinskii 0.81±0.02b 1.17±0.04a 0.65±0.03a 0.67±0.04b 0.04±0.01b 0.53±0.03a 刺槐R. pseudoacacia 1.11±0.09a 0.87±0.07b 0.58±0.05a 0.30±0.05c 0.08±0.00a 0.21±0.00b 油松Pinus tabulaeformis 0.57±0.14c 0.40±0.11c 0.31±0.02b 0.21±0.09c 0.01±0.00c 0.02±0.02c 侧柏Platycladus orientalis 0.32±0.02d 0.14±0.02d 0.29±0.01b 0.86±0.03a 0.02±0.01bc 0.15±0.01c 新疆杨Populus alba var. pyramidalis 0.49±0.07c 0.12±0.05d 0.23±0.10b 0.15±0.04c 0.02±0.01bc 0.01±0.00c 对照CK 0.21±0.02d 0.13±0.01d 0.12±0.01c 0.20±0.04c 0.01±0.00c 0.01±0.00c

Biolog-ECO微平板中含有31种碳源，31种碳源的测定结果形成了描述微生物群落代谢特性的多元向量，不易直接比较。通过主成分分析可以用点的位置直观地反映出不同微生物群落的代谢特征。利用培养96 h的AWCD值，对不同类型林分土壤微生物利用单一碳源特性进行主成分分析，同时提取特征值大于1的主成分的特征根及方差贡献率。本研究共提取出4个主成分，累计贡献率达97.8%。其中第1主成分(PC1)的特征根为13.32，方差贡献率为43.0%； 第2主成分(PC2)的特征根为8.23，方差贡献率为26.5%； 第3主成分(PC3)的特征根为3.96，方差贡献率为12.8%； 其余2个主成分贡献率小于10%。从中提取可以聚集单一碳源变量的数据变异(累计方差贡献率)为69.5%的前2个主成分PC1和PC2进行分析，以PC1为横轴，PC2为纵轴，以不同类型林分31种碳源底物利用情况在2个主成分上的得分值为坐标作图，得到土壤微生物碳源利用主成分分析图(图 2)。由图 2可见，在PC1轴上，刺槐林和柠条林分布在正方向，油松林、新疆杨林、侧柏林和撂荒地分布在负方向； 在PC2轴上，柠条林和侧柏林分布在正方向，而刺槐林、油松林、新疆杨林和对照分布在负方向。由此表明柠条林、刺槐林和侧柏林的土壤微生物群落有各自独特的碳源利用模式，且柠条林土壤微生物群落对碳源的利用能力最强，而油松林、新疆杨林和对照的土壤微生物群落具有相似的碳源利用特征。

图 2 不同类型林分土壤微生物群落对碳源代谢的主成分分析 Fig.2 Principal components analysis(PCA)of soil microbial metabolic profiles in different forest types

初始载荷因子反映主成分与碳源利用的相关系数，载荷因子越高，表示该碳源对主成分的影响越大。由表 4可知，对PC1贡献较大的碳源有20种，其中糖类占7种，氨基酸类占4种，羧酸类和多聚物类各占3种，胺类占2种，多酚类占1种，可见影响PC1的主要为糖类和氨基酸类； 对PC2贡献大的碳源有17种，其中糖类占5种，羧酸类占4种，多聚物类占3种，氨基酸类和多酚类各占2种，胺类占1种，表明影响PC2的碳源主要为是糖类和羧酸类。

表 4 代谢多样性的主成分分析中PC1和PC2中较高相关系数碳源利用 Tab.4 Carbon resources with high correlation coefficients for PC1 and PC2 in principal components analysis of metabolic diversity patterns for soils

表 4 代谢多样性的主成分分析中PC1和PC2中较高相关系数碳源利用 Tab.4 Carbon resources with high correlation coefficients for PC1 and PC2 in principal components analysis of metabolic diversity patterns for soils 主成分 Principal components 底物 Substate r PC1(43.0%) 糖类 Carbohydrates D2 D-甘露醇 D-Mannitol 0.924 E2 N-乙酰-D-葡萄糖胺 N-Acetyl-D-Glucosamine 0.920 A3 D-半乳糖酸内脂 D-Galactonic acid lactone 0.876 H1 α-D-乳糖 α-D-Lactose 0.812 B2 D-木糖 D-Xylose 0.699 G1 D-纤维二糖 D-Cellobiose -0.661 G2 葡萄糖-1-磷酸 Glucose-1-Phosphate 0.516 氨基酸类 Amino acids F4 甘氨酰基-L-谷氨酸 Glycyl-L-Glutamic acid 0.903 C4 L-苯基丙氨酸 L-Phenylalanine 0.907 A4 L-精氨酸L-Arginine 0.770 D4 L-丝氨酸 L-Serine 0.577 羧酸类 Carboxylic acids B3 D-半乳糖醛酸 D-Galacturonic acid 0.818 H3 D-苹果酸 D-Malic Acid 0.710 B1 丙酮酸甲酯 Pyruvic Acid Methyl Ester 多聚物类 Polymer E1 α-环糊精 α-Cyclodextrin 0.820 F1 肝糖 Glycogen 0.819 C1 吐温40 Tween 40 -0.550 胺类 Amines H4 腐胺 Putrescine 0.940 G4 苯乙胺Phenylethylamine 0.634 PC1(43.0%) 多酚类 Polyphenols D3 4-羟基苯甲酸 4-Hydroxybenzoic Acid 0.530 PC2(26.5%) 糖类 Carbohydrates A2 β-甲基-D-葡萄糖苷 β-Methyl-D-Glucoside -0.845 B2 D-木糖 D-Xylose 0.646 G1 D-纤维二糖 D-Cellobiose 0.587 G2 葡萄糖-1-磷酸 Glucose-1-Phpsphate -0.731 H2 D,L-α-磷酸甘油 D,L-α-Glycerol phosphate -0.659 羧酸类 Carboxylic acids B3 D-半乳糖醛酸 D-Galacturonic acid 0.525 H3 D-苹果酸 D-Malic acid -0.615 F2 D-葡萄糖胺酸 D-Glucosaminic acid -0.692 G3 α-丁酮酸 α-Ketobutyric acid 0.504 多聚物类 Polymer E1 α-环糊精 α-Cyclodextrin 0.542 F1 肝糖 Glycogen 0.559 D1 吐温80 Tween 80 -0.613 氨基酸类 Amino acids B4 L-天冬酰胺酸 L-Asparagine 0.755 A4 L-精氨酸 L-Arginine -0.564 多酚类 Polyphenols D3 4-羟基苯甲酸 4-Hydroxybenzoic acid -0.660 C3 2-羟基苯甲酸 2-Hydroxybenzoic acid 0.535 胺类 Amines G4 苯乙胺 Phenylethylamine 0.700

Biolog-ECO微平板中共有31种碳源，碳源每孔AWCD值的变化可反映土壤微生物群落代谢活性和碳源利用能力。AWCD值越大，表明土壤微生物群落代谢活性越强(Konopka et al.，1998)。研究表明不同的植被对土壤生态系统特别是土壤微生物有着显著的影响，植被的类型、数量和化学组成可能是土壤微生物多样性变化的主要推动力(Waid，1999)。本研究发现黄土峁状丘陵区5种类型林分土壤微生物群落的碳源利用量以及代谢活性均较对照显著提高，这是因为种植人工林后植物根际释放了大量的碳源，同时植被凋落物的分解增加了土壤中的有机质以及C、N、P等养分的含量，继而影响了土壤微生物群落的分布以及代谢活性。此外不同类型林分土壤微生物代谢活性不同，这一发现与Zhang等(2013)研究结果一致。Grayston等(2004)研究表明不同类型草原的土壤微生物群落结构以及活性不同，主要与提供给土壤的碳源类型以及含量的不同有关。植物根系对土壤微生物有显著影响，且根系分泌物对土壤微生物的分布有重要作用(Nayyar et al.，2009)。此外，土壤理化性质的改变可能导致土壤微生境的变化，因此土壤微生物的分布以及活性和多样性均受到影响(Pengthamkeerat et al.，2011)。

本文采用Shannon指数(H)、Simpson指数(D)和McIntosh指数(E)研究了不同类型林分土壤微生物群落对31种碳源利用的多样性。多样性指数值越大表明土壤微生物群落功能多样性越高，反之亦然。结果表明5种类型林分土壤Shannon指数(H)、Simpson指数(D)和McIntosh指数(E)均较对照有所提高，表明种植人工林增加了土壤微生物种群多样性以及种群丰富度和均匀度。Zhang等(2013)研究也发现植被群落能显著提高土壤微生物群落功能多样性。5种类型林分中柠条林和刺槐林土壤Shannon指数、Simpson指数和McIntosh指数值较大，表明柠条林和刺槐林土壤微生物功能多样性较高，可能与柠条林和刺槐林土壤有机质含量较高有关。因为由3种指数与有机质和全氮的相关性分析(表 5)可以看出，3种指数与土壤有机质均极显著相关，由此说明丰富的碳源为微生物提供了大量的营养来源，从而提高了微生物的多样性以及对碳源的利用能力。此外，柠条和刺槐属于豆科植物，有研究表明豆科植物可显著增进微生物群落规模和功能(Han et al.，2007)。

表 5 土壤性质与土壤微生物多样性的相关性 Tab.5 Relationships of soil properties with soil microbial diversity

表 5 土壤性质与土壤微生物多样性的相关性 Tab.5 Relationships of soil properties with soil microbial diversity Shannon (H) Simpson (D) McIntosh (E) 有机质 SOM 0.60** 0.649** -0.716** 全氮Total N 0.303 0.348 0.076

研究不同类型林分土壤微生物对不同碳源利用能力的差异，可深入了解微生物群落的结构组成(郑华等，2007)。本研究结果表明，5种类型林分土壤微生物对糖类、氨基酸类、羧酸类、多聚物类、多酚类以及胺类等6种碳源的利用率均高于对照，而不同类型林分土壤微生物对不同碳源的利用率不同，说明各类型林分的土壤微生物对糖类、氨基酸类、羧酸类、多聚物类、多酚类以及胺类的利用具有选择性。胡婵娟等(2009)研究也发现了类似的现象，其原因可能与植物的生理特性、光合产物以及根系分泌物等有关(Ladygina et al.，2010)。PCA分析表明，不同类型林分土壤微生物碳源利用特征出现分异，在主成分分离中起主要贡献作用的是糖类、氨基酸类和羧酸类。Peter等(2001)的研究也发现，葡萄糖和氨基酸是细菌和真菌等土壤微生物代谢利用的主要碳源。植被类型的不同导致植物群落结构发生了变化，而植物种类又影响了微生物多样性及土壤中的碳分配(Pignataro et al.，2012)。

本研究利用Biolog方法分析了黄土高原峁状丘陵区不同类型林分土壤微生物群落特征，但是Biolog方法主要针对可培养的细菌类群，对于不可培养的且具有特殊功能的微生物无法检测(张超等，2015)。尽管Biolog分析法存在一定缺陷，但它仍然是研究土壤微生物代谢功能的一种快速有效方法。由于土壤微生物的复杂性和土壤中绝大多数微生物不可培养，仍需结合其他检测方法开展土壤微生物群落功能类群研究。