蜡梅属(Chimonanthus)植物为我国所特有，在华东地区主要分布有蜡梅(Ch. praecox)、山蜡梅(Ch. nitens)、柳叶蜡梅(Ch. salicifolius)、浙江蜡梅(Ch. zhejiangensis)、突托蜡梅(Ch. grammatus)5个种(张若蕙等，1998)，主要用于园林景观绿化。在民间蜡梅花主要用来泡茶，可治疗风寒感冒、咳嗽、呕吐等疾病，目前已有关于蜡梅花挥发性成分研究和利用方面的报道(周明芹等，2009； 马雪梅等，2010)，且有蜡梅鲜切花、干花、精油及花茶等相关产品，而除蜡梅外，蜡梅属其他4种植物花的研究及利用方面的报道较少。

蜡梅花的精油成分多采用水蒸汽蒸馏法进行提取制备(Shen et al.，2014； 杜永芹等，2013)，但该方法需样品量大，且在加热过程中会导致挥发性成分的损耗。采用顶空固相微萃取技术(head space solid phase micro-extraction，HS-SPME)能够避免成分的损失，且具有样品量少、灵敏、操作方便的优点，在食品、环保及化工领域应用广泛(Cheng et al.，2015； Benyelles et al.，2014)。本研究采用顶空固相微萃取技术吸附样品，利用气质联用技术(GC-MS)分析和鉴定蜡梅属5种植物花中的挥发性成分，并进行主成分分析，探讨蜡梅属5种植物花是否具有相似的香气成分及开发利用价值，为蜡梅属植物的资源利用及理论研究提供参考。

蜡梅属5种植物花均采自浙江农林大学蜡梅属资源圃内，因蜡梅属5种植物的花期不同，所有花样品均在其相应开花期内采摘，其中柳叶蜡梅、山蜡梅及浙江蜡梅花采于2014年10月20日，突托蜡梅花采于2014年11月7日，蜡梅花采于2015年1月22日。5种花样品均在当天采摘后于60 ℃下烘干备用。

AB104-N电子分析天平(梅特勒托利多仪器上海有限公司)，Trace GC/ ISQ 气相色谱-质谱联用仪(美国Thermo Fisher公司)，手持固相微萃取设备(上海安谱科学仪器有限公司)，100 μm PDMS(聚二甲基硅氧烷)萃取纤维(上海安谱科学仪器有限公司)，DK-S24型电热恒温水浴锅(上海森信实验仪器有限公司)。

所有样品均采用顶空固相微萃取(HS-SPME)方式吸附处理(张丰等，2015； 解万翠等，2011)，再结合GC-MS分析挥发性成分。以柳叶蜡梅干花为样品，分别从样品用量、吸附时间、水浴温度、解吸时间4个方面优化固相微萃取的吸附条件。根据优化的萃取条件，分别称取5种蜡梅干花样品，揉碎，放入20 mL顶空瓶中，加入10 mL蒸馏水，再加入正己烷稀释过的香叶醇溶液(0.80 μg·g^-1)作为内标物，密封，萃取纤维(100 μm PDMS)插入瓶中距样品顶部1 cm处，水浴加热，吸附完成后，插入GC进样口解吸，进行GC-MS分析。

GC条件： 色谱柱TM-5MS石英毛细管柱(30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)； 载气为高纯氦气(99.999%)，流速为1.0 mL·min ^-1； 进样口温度250 ℃，升温程序： 起始柱温40 ℃，保持5 min，再以3 ℃·min^-1升温至170 ℃，保持5 min，再以10 ℃升温至280 ℃，保持 5 min； 样品采用不分流模式。

MS条件： 电离源为电子轰击(EI)，EI电离能量为70 eV。离子阱温度为200 ℃，歧管温度为40 ℃，传输线温度为250 ℃，质量扫描范围为40～500 m/z，扫描速度为3 scan·s ^-1。

取0.1 μL正构烷烃混标(C₇-C₃₀)进样，运用线性升温公式算出每种烷烃化合物的保留指数(retention index，RI)值。公式如下： RI=100n + 100(t_x-t_n)/(t_n+1-t_n)，式中： t_x为分析组分出峰的保留时间，t_n和t_n+1是碳原子数为n和n + 1的正构烷烃的出峰保留时间。

样品中各未知挥发性物质的定性研究通过计算机检索与NIST08标准质谱库相匹配，选择较高匹配度(SI > 800)的检索结果，按照保留时间并结合文献进行人工解谱(刘文涵等，2013； 朱岳麟等，2009)，采用内标法(程焕等，2014； 张胜龙等，2015)求得各挥发性组分的含量。应用SIMCA-P + 11.0软件对蜡梅属5种植物干花挥发性成分进行主成分分析(PCA)，通过得分图(score plot)直观地表达蜡梅属5种植物间的关系。

以柳叶蜡梅干花为试验材料，采用单因子变量法，以样品用量、水浴加热温度、吸附时间及解吸时间为自变量，结合样品中3个峰面积较大的挥发性成分α-月桂烯、桉叶素和四甲基环癸二烯甲醇为因变量进行研究，从而得出干花固相微萃取的最佳萃取条件。

考察柳叶蜡梅干花取样量(0.4，0.8，1.2，1.6，2.0 g)对萃取效果的影响(图 1a)，结果表明，柳叶蜡梅干花取样量达到1.2 g后，峰面积基本趋于稳定，表明萃取处理时顶空浓度已基本饱和，故蜡梅属5种干花取样量为1.2 g。

图 1 不同处理因素对柳叶蜡梅花萃取效果的影响 Fig.1 Effects of different treated factors on extraction from Ch. salicifolius flower

设定样品吸附时的水浴温度分别为50，60，70，80，90 ℃，观察萃取纤维的吸附效果。结果(图 1b)表明，α-月桂烯、桉叶素和四甲基环癸二烯甲醇3种物质的峰面积随温度的升高而增大，在水浴温度为70 ℃时挥发性物质的萃取量达到最大，大于70 ℃时峰面积稍微下降，说明温度过高，可能会破坏自然香气成分(程焕等，2014)。为了获得待测挥发性组分较高的萃取量，选择70 ℃为最佳水浴温度。

固相微萃取纤维对样品的吸附时间决定了吸附的效果。本试验设置萃取吸附时间分别为15，30，45，60，75 min，从结果(图 1c)来看，桉叶素和四甲基环癸二烯甲醇在吸附30 min和60 min时无显著差异，说明萃取纤维对物质的吸附在某一时间内能达到饱合，而时间过长或过短都不利于待测挥发组分的顶空吸附，故萃取时间选择45 min。

SPME萃取后在气相色谱进样口解吸时，若解吸时间过短就有可能导致解吸不完全，会影响下一次的萃取量，出现误差(连宗衍等，2009)。因此本试验考察了在热解吸温度为250 ℃下，时间(1，2，3，4，5 min)对萃取效果的影响，结果(图 1d)表明，3 min可达到充分解吸。

通过以上4个单因素考察，采用固相微萃取进行蜡梅属植物干花样品吸附处理的最佳条件为： 样品用量1.2 g、吸附水浴温度70 ℃、吸附时间45 min及解吸时间3 min。

通过顶空固相微萃取处理样品和GC-MS分析，分别得到5种蜡梅花的总离子流图(图 2)。从蜡梅属5种植物干花中共鉴定了46种挥发性物质(组分含量见表 1)，其中蜡梅37种、突托蜡梅41种、山蜡梅41种、浙江蜡梅36种和柳叶蜡梅43种，5种植物花中的共有成分达到24种； 从所鉴定的成分来看，蜡梅属植物花的挥发性成分主要以萜类成分为主，按照结构类型可划分为萜烯、萜醇、萜酯等含氧衍生物及少数脂肪族化合物。

图 2 蜡梅属植物花挥发性成分的总离子流色谱 Fig.2 The volatile components chromatography of Chimonanthus flowers

蜡梅属5种植物花中含有大量的萜烯类化合物，种类达到22种，其中单萜烯类为6种，倍半萜类有16种，共有的萜烯类物质10种。在5种植物干花中，山蜡梅、浙江蜡梅和柳叶蜡梅花中萜烯类化合物含量较高，分别为48.17，45.06，37.46 μg·g^-1，而蜡梅和突托蜡梅花的萜烯化合物含量相对较少，仅有17.83，23.95 μg·g^-1。在所有检测到的萜烯类物质中，α-月桂烯、β-榄香烯、石竹烯、葎草烯、大根香叶烯D及杜松-1(10)，4-二烯是蜡梅属植物花中的主要共有萜烯类物质。山蜡梅、柳叶蜡梅和浙江蜡梅花中α-月桂烯、杜松-1(10)，4-二烯的相对含量较大，远远大于蜡梅和突托蜡梅花中的含量。

蜡梅属植物花中含有较多的萜烯类含氧衍生物，包括萜醇、萜酯等，萜烯类含氧衍生物沸点较高，多数具有较强的香气和生理活性，是化妆品工业的重要原料。在蜡梅属5种植物花中共检测到12种萜醇类物质，主要包括桉叶素、四甲基环癸二烯甲醇、大根香叶烯D-4-醇、斯巴醇及β-桉叶醇等成分。其中山蜡梅、浙江蜡梅和柳叶蜡梅花中桉叶素和四甲基环癸二烯甲醇的含量明显高于蜡梅和突托蜡梅，并且萜醇的含量均大于35 μg·g^-1，而突托蜡梅花中萜醇类成分含量相对较低(10.51 μg·g^-1)。

在蜡梅属5种植物花中共检测到乙酸芳樟酯、乙酸龙脑酯、乙酸松油酯及α-乙酸松油酯4种萜酯类成分。蜡梅花中的酯类化合物含量远高于其他4种植物，达到41.75 μg·g^-1，尤其乙酸芳樟酯的含量高达35.20 μg·g^-1； 其他4种植物花中乙酸芳樟酯、乙酸龙脑酯、乙酸松油酯及α-乙酸松油酯的含量较低。

在其他的萜烯类含氧衍生物中，(-)-樟脑是一种烯萜酮类，有刺激性芳香味，在蜡梅属5种植物花中含量均较小。黑蚁素是一种萜烯醚类，是突托蜡梅花中含量最高的化合物(49.87 μg·g^-1)，且在蜡梅花中含量也较高，而在浙江蜡梅、山蜡梅和柳叶蜡梅花中含量相对较低。突托蜡梅花中异香橙烯环氧化物的含量较大(19.92 μg·g^-1)，而蜡梅花中石竹烯氧化物含量相对较高(8.23 μg·g^-1)。

从蜡梅属植物花中共检测到3种脂肪族化合物，且含量较低。

表 1 蜡梅属5种植物干花的挥发性组分^① Tab.1 The volatile components from dry flowers of five species in Chimonanthus

表 1 蜡梅属5种植物干花的挥发性组分① Tab.1 The volatile components from dry flowers of five species in Chimonanthus 化合物 类别 Compound class 组分 编码 No. 保留 时间 Retention time/min 保留 指数 Retention index 匹配度 Similarity index 化合物 Compounds 化合物含量 Compound content/(μg·g-1) 蜡梅 Ch. praecox 突托 蜡梅 Ch. gramma-tus 山蜡梅 Ch. nitens 浙江 蜡梅 Ch. zhejiang- ensis 柳叶 蜡梅 Ch. salici- folius 萜烯类 A1 12.44 963 918 α-蒎烯α-Pinene — 0.30 1.68 1.73 0.84 Terpenes A2 13.34 979 947 莰烯Camphene — 1.40 0.20 — — A3 15.49 1 022 947 α-月桂烯α-Myrcene 0.92 1.24 18.87 14.47 14.22 A4 16.45 1 038 915 α-水芹烯α-Phellandrene — 0.06 4.01 0.25 — A5 17.57 1 059 816 柠檬烯Limonene 0.16 0.20 — — — A6 18.57 1 078 826 顺式-α-罗勒烯 cis-α-Ocimene 0.32 0.40 0.78 0.46 0.49 A7 32.81 1 392 854 α-荜澄茄油烯α-Cubebene — 0.94 0.16 — 0.17 A8 34.12 1 425 885 古巴烯Copaene 0.18 0.25 0.55 0.42 0.49 A9 34.76 1 441 891 β-榄香烯 β-Elemene 1.72 0.52 1.14 0.86 1.04 A10 35.39 1 458 827 异石竹烯 Isocaryophillene — 1.25 0.59 0.41 0.32 A11 36.04 1 475 909 石竹烯 Caryophyllene 3.25 3.67 2.92 4.27 3.05 A12 37.42 1 510 839 顺-α-金合欢烯 cis-α-farnesene 0.20 0.17 0.56 0.46 0.24 A13 37.60 1 515 876 葎草烯Humulene 1.09 2.57 4.64 6.52 1.57 A14 38.41 1 536 828 -木罗烯-Muurolene 0.11 0.22 0.58 — 0.28 A15 38.69 1 543 936 大根香叶烯D Germacrene D 3.36 3.96 1.84 3.20 2.05 A16 39.06 1 551 847 (Z,E)-α-金合欢烯 (Z,E)-α-Farnesene 0.55 0.43 0.88 0.62 0.80 A17 39.69 1 567 849 α-金合欢烯α-Farnesene — 0.19 — 0.20 0.18 A18 40.20 1 580 835 δ-杜松烯 δ-Cadinene — 0.38 0.20 0.37 0.31 A19 40.41 1 585 917 杜松-1(10),4-二烯 Cadina-1(10),4-diene 4.66 2.60 8.36 9.98 9.86 A20 40.69 1 592 853 顺-菖蒲烯cis-Calamenene 0.72 2.87 — 0.83 1.18 A21 41.78 1 616 847 α-白菖烯α-Calacorene 0.59 0.34 0.22 — 0.36 总和 Total 17.83 23.95 48.17 45.06 37.46 萜醇类 B1 17.82 1 062 947 桉叶素Eucalyptol 3.78 5.30 11.78 13.87 11.58 Terpene B2 21.58 1 135 853 α-芳樟醇α-Linalool 1.32 — 0.44 0.34 0.19 alcohols B3 26.48 1 239 927 α-松油醇α-Terpineol 0.34 0.56 0.31 — 0.34 B4 42.36 1 625 928 四甲基环癸二烯甲醇Hedycaryol 4.90 0.20 30.68 27.68 29.95 B5 42.84 1 638 823 橙花叔醇Nerolidol 0.89 — — 0.30 0.72 B6 43.86 1 653 858 大根香叶烯D-4-醇 Germacrene D-4-ol 0.41 1.56 1.22 3.36 2.10 B7 44.00 1 662 895 斯巴醇 (-)-Spathulenol 5.03 0.90 0.20 1.30 3.18 B8 44.77 1 677 832 (-)-蓝桉醇 (-)-Globulol 0.74 0.12 0.11 — 0.47 B9 45.72 1 697 836 荜澄茄油烯醇Cubenol — — 0.42 1.62 0.90 B10 47.20 1 739 817 τ-杜松醇τ-Cadinol 0.92 — 0.18 0.30 0.23 B11 47.66 1 752 879 β-桉叶醇β-Eudesmol 1.20 1.61 2.83 2.38 2.68 B12 49.65 1 810 838 顺-α-檀香醇cis-α-Santalol 0.14 0.25 0.20 — 0.12 总和 Total 19.67 10.51 48.39 51.14 52.45 萜烯酯类 C1 28.61 1 291 947 乙酸芳樟酯 Acetic acid linalool ester 35.20 1.88 1.48 0.25 1.20 Terpene C2 30.28 1 331 924 乙酸龙脑酯 Borneol acetate 4.13 1.49 2.56 2.33 2.51 esters C3 31.62 1 363 815 乙酸松油酯Terpinyl acetate 0.60 0.64 0.58 0.43 0.73 C4 33.11 1 399 823 α-乙酸松油酯 α-Terpinyl acetate 1.82 0.55 1.75 0.42 1.98 总和 Total 41.75 4.56 6.37 3.43 6.42 萜烯酮类 Terpene ketones D1 24 1 186 824 (-)-樟脑 (-)-Alcanfor 0.30 — 0.64 0.56 0.16 萜烯醚类 Terpene ethers E1 43.24 1 645 935 黑蚁素Dendrolasin 14.24 49.87 2.48 4.68 5.95 其他 Others F1 44.18 1 665 915 石竹烯氧化物 Caryophyllene oxide 8.23 1.66 3.89 2.52 4.50 F2 47.42 1 745 894 异香橙烯环氧化物 Isoaromadendrene epoxide 2.89 19.92 1.27 1.66 1.62 F3 48.36 1 772 835 喇叭烯氧化物Ledene oxide 1.64 0.55 — 0.53 0.48 总和 Total 12.76 22.13 5.16 4.71 6.60 脂肪族 化合物 Aliphatic compounds G1 34.66 1 439 846 (1R,2S,6S,7S,8S)-8-异丙 基-1-甲基-3-三环亚甲基[4.4.0.02.7] 癸烷 (1R,2S,6S,7S,8S) -8-Isopropyl-1-methyl-3-methylenetricyclo[4.4.0.02.7]decane — 1.81 0.92 0.65 0.31 G2 45.62 1 695 946 (1R,3E,7E,11R)-1,5,5,8-四甲基-12-环己烷[9.1.0] 十二-3,7-二烯 (1R,3E,7E,11R)-1,5,5,8-Tetramethyl-12-oxabicyclo [9.1.0]dodeca-3,7-diene 2.41 0.29 2.04 1.76 1.80 G3 48.91 1 788 879 6-异丙烯基-4,8a-二甲基-1,2,3,5,6,7,8,8a-八氢-2-萘酚6-Isopropenyl- 4,8a-dimethyl-1,2,3,5,6,7,8,8a-octahydro-2-naphthalenol 0.54 0.19 3.18 3.52 3.40 总和 Total 2.95 2.29 6.14 5.93 5.51 ① —: 未检出 Not detected.

采用SIMCA-P + 11.0软件对蜡梅属植物花的挥发性成分进行PCA分析，结果表明，蜡梅属5种植物可明显被划分为3类(图 3)。浙江蜡梅、山蜡梅和柳叶蜡梅3种植物花的挥发性组分比较相似，聚为一类； 而蜡梅和突托蜡梅显著不同于另外3种植物，各自单独聚为一类。PCA分析结果与课题组前期研究成果及已报道的研究结果(张若蕙等，1998； 刘洪涛等，2013)相一致。

图 3 蜡梅属植物花中挥发性组分的PCA分析 Fig.3 The principal component analysis(PCA)diagram of volatile compounds from Chimonanthus flowers

本研究从蜡梅属植物花的GC-MS分析结果来看，主要的挥发性成分如桉叶素、樟脑、乙酸芳樟酯、乙酸龙脑酯、乙酸松油酯、β-榄香烯、α-石竹烯、大根香叶烯D等单萜和倍半萜类成分都可以检测出来，说明采用顶空固相微萃取方法能够吸附较多的挥发性物质，该方法也能减少样品前处理的时间和步骤，因此具有较高的可行性。

本研究在预试验中采用鲜花作样品，但萃取纤维对鲜花中易挥发的头香成分吸附易达到饱和，在总离子流图中色谱峰多集中在30 min以前，而高沸点的倍半萜类成分检出较少。而采用烘干处理后的花作为样品材料，虽然低沸点的单萜烯类成分在加热过程中会有小部分损耗，但大多数的挥发性物质能够被检测出来，因此在本研究中选用干花作为检测样本。

蜡梅属植物花中有部分挥发性组成成分与叶相同，如蜡梅属花和叶中都含有桉叶素、石竹烯、月桂烯、大根香叶烯D、α-芳樟醇、β-荜澄茄油烯、葎草烯等成分(史小娟等，2011； 杨成梓等，2013； 欧阳婷等，2010； 连宗衍等，2009)，只是含量有所不同，如桉叶素在芳香型蜡梅属植物叶中含量较高，因此叶比花具有更浓郁的清凉芳香性气味。

蜡梅属5种植物花中含有较多相似的挥发性成分，顺式-α-罗勒烯、古巴烯、石竹烯、顺-α-金合欢烯、大根香叶烯D、(Z，E)-α-金合欢烯、杜松-1(10)，4-二烯、β-桉叶醇、乙酸龙脑酯、乙酸松油酯、α-乙酸松油酯这些成分在5种植物花中的含量非常接近。而有些成分在5种植物间也有明显的差异： 山蜡梅、浙江蜡梅和柳叶蜡梅花中α-月桂烯、桉叶素和四甲基环癸二烯甲醇的含量明显大于蜡梅和突托蜡梅，这3种物质中，桉叶素有樟脑和清凉的气味，而其他2种成分没有明显的气味，因此这3种植物花的气味比较清淡； 突托蜡梅中黑蚁素含量最高(49.87 μg·g^-1)，其次是异香橙烯环氧化物，含量都明显高于其他植物，由于异香橙烯环氧化物具有芳香性气味，因此突托蜡梅花的香气比较明显； 蜡梅花中乙酸芳樟酯的含量(35.20 μg·g^-1)远大于其他植物，这很可能是蜡梅花盛开时香气浓郁的主要原因，乙酸芳樟酯是制备高级香精不可缺少的香料成分，广泛用于化妆品领域，因此市场上对蜡梅花精油方面的利用率远高于其他4种植物的花。

舒任庚等(2010)报道了山蜡梅花的挥发油成分大约有20种，本研究检测到山蜡梅花中的挥发性成分有41种，包括已报道的桉叶素、石竹烯、β-蒎烯、α-水芹烯、α-月桂烯、异香橙烯环氧化物、石竹烯氧化物等化合物，还检测到了没有报道的葎草烯、大根香叶烯D、杜松-1(10)，4-二烯、四甲基环癸二烯甲醇、乙酸龙脑酯、6-异丙烯基-4，8a-二甲基-1，2，3，5，6，7，8，8a-八氢-2-萘酚这些含量高于1.0 μg·g^-1的化合物。熊敏等(2012)和杜永芹等(2013)都报道了蜡梅花的挥发性成分，本研究检测到了没有报道过的葎草烯、大根香叶烯D、杜松-1(10)，4-二烯、四甲基环癸二烯甲醇、斯巴醇、α-乙酸松油酯、黑蚁素这些含量大于1.0 μg·g^-1的化合物。以往报道中有关化合物的定量分析用相对含量表示，而本研究采用的内标法定量更加合理准确。另外，前人报道的有关蜡梅属植物花的挥发性成分研究，大都是研究单个种，尤其是对蜡梅花的报道较多，而对其他种的研究很少，本研究在相同条件下分析了蜡梅属5种植物花的挥发性成分差异，在此基础上揭示了蜡梅属花香味、市场利用率差异的原因，比以往的研究更加全面系统。

本研究对蜡梅属5种植物干花中已鉴定的挥发性成分进行主成分分析可将5种植物划分为3类，其中山蜡梅、浙江蜡梅和柳叶蜡梅之间芳香性物质组成相似且含量相近，具有相同的资源利用性； 而蜡梅、突托蜡梅与上述3种植物主要挥发性物质差异比较明显，因此在资源利用上可区别对待。本研究为蜡梅属植物分类学的争议提供一定的理论参考，也为蜡梅属植物花的资源利用，尤其是香料产业的开发利用提供理论依据。