常绿杨‘A-61/186’(Populus×euramericana cv.A-61/186)及‘A65/27’、‘A65/31’1987年从巴基斯坦引入中国，适合热带亚热带种植(郑世锴，2006)。引进初期在我国福建及西南部分地区进行了栽培试验，2001年重庆市科学技术委员会对3个无性系通过科技成果鉴定，鉴定为良种，但未形成大量的种植。随着经济社会的快速发展，一方面我国木材供给大幅度减少，木材供需矛盾不断加剧；另一方面以单一桉树(Eucalyptus)为主的南方速生林带来严重的生态问题，发展适合南方种植的树种，常绿杨开始重新进入林业种植领域。笔者于2006年从北京引入常绿杨3个品系，在福建福州、泉州及厦门进行了引种试验，对3个无性系的大田种植表现性状及部分抗逆性特征进行了研究(钱莲文等，2008；2009a；2009b；2010；2011)，结果表明：3个无性系在生长适应性状况上无明显差异，在福建3地均不会完全休眠，高度和地径年生长量大于北方落叶品种。但在种植2~3年后长势开始减缓，尤其表现在径向生长上，因而较难得到大径材。福建省位于我国东南沿海，位于亚热带，属海洋性季风气候，雨量充足，发展速丰林条件优越。但亚热带高温多雨、湿热同季的特点使土壤的风化和成土作用强烈，盐基高度不饱和，土壤pH4.5~6，同时铁铝氧化物有明显积聚，从而影响植物生长。许多亚热带重要的用材树种受铝毒害的影响已有诸多报道(Mukhopadyay et al., 2012；Chen et al., 2005；Masayuki et al., 2001)，但关于杨树对铝胁迫的响应研究较少，且主要集中在不同无性系之间耐铝性的对比上(Steiner et al., 1984；Ernest et al., 2011)。本课题组经过调查分析，结合杨树普遍适合中性偏碱性土壤的特点，提出了酸性土壤铝毒害可能是常绿杨不能持续高速生长的原因之一的假设，并初步开展了试验研究(钱莲文等，2014；2015；吴文杰等，2015)，研究结果显示酸铝胁迫会对常绿杨生理状况产生一定程度的影响。本研究选取‘A-61/186’为试验材料，对酸性条件下铝在常绿杨树体内积累和分布的规律，以及铝胁迫下常绿杨叶片超微结构与生长生理指标的响应变化进行研究，以揭示常绿杨对酸性土壤铝胁迫的响应机制，为常绿杨在亚热带地区的推广提供理论依据，同时为杨树响应铝胁迫的机制研究提供素材。

在福建泉州的实验苗圃地剪取常绿杨‘A-61/186’1年生插条，长度约15 cm，采用白色泡沫箱进行培养，每箱盛18 L全素培养液，将插条固定于一块泡沫板浮于培养液面，每箱扦插6株，一共24箱，采用空气泵昼夜持续通气；先用自来水培养直到生根，然后挑选生长性状(插条基部粗度、插条高、根系长度)一致的插条分装6箱，每箱3株，采用Hoagland全素营养液配方，pH值为4.8，参照对桉树(Eucalyptus)、龙眼(Dimocarpus longan)产生影响的铝浓度试验(杨梅等，2011；肖祥希，2005)，并结合本课题的预试验结果，溶液中的铝离子浓度通过AlCl₃·6H₂O的量来换算，依次为：0 (K₀)、0.074(K₁)、0.222(K₂)、0.370(K₃)、0.518(K₄)、0.666(K₅) mmol·L^-1。

在胁迫初始及结束时(90天)测定株高，株高生长量=胁迫结束高度-胁迫初始高度；胁迫结束时测得根的长度为根系生长量；胁迫结束时分根、茎、叶收获全株，在80 ℃杀青，60 ℃烘干至恒质量测定生物量。

在胁迫结束时(90天)称取0.5 g烘干至恒质量的细根、茎、叶研磨后过0.5 mm筛孔并充分混匀，置于25 mL瓷坩埚中，先在电炉上缓缓加热进行预灰化，待试样炭化后移入马弗炉内，于450 ℃灰化至灰分呈浅灰色或灰白色。用1 mol·L^-1 HNO₃溶解灰分，用羊毛铬菁R分光光度法测定组织中的铝(邱光葵等，1989)。

用PAM-2100叶绿素荧光仪在胁迫90天时进行叶绿素荧光参数的测定。每个处理测定3个植株；每个植株选择从梢部向下数的第6~8片功能叶，测定不同方位的3个叶片，每个处理测定9个叶片。主要获得以下荧光参数，F₀：在暗适应条件下测得，在叶片经过1个晚上的充分暗适应后的凌晨进行测定；F_v/F_m：光系统Ⅱ的最大光化学量子产量，用以反映光系统Ⅱ反应中心完全关闭时的实际原初光能捕获效率，可在叶片暗适应20 min后测得。Yield：叶片不经过暗适应在光下直接测得，以反映光系统Ⅱ在部分关闭情况下的实际原初光能捕获效率；非光化学猝灭系数NPQ：反映植物的光合系统的一种自我保护机制，是光系统Ⅱ吸收的光能以热的形式耗散掉的部分。

在铝胁迫60及90天采集植物叶片叶肉组织，将采集的组织快速放入5%戊二醛(0.1 mol·L^-1PBS配制，pH7.0)的固定液里，进行抽气以使材料沉到底部，将在4 ℃冰箱里固定24 h后的材料用0.1 mol·L^-1PBS冲洗，后用1%锇酸溶液固定4 h，反复用重蒸水冲洗，再经不同浓度的乙醇进行脱水，用Epon 812环氧树脂进行包埋，在LIMB V型超薄切片机上进行纵切，用醋酸双氧铀及柠檬酸铅对切片染色，在日立H-7650型透射电子显微镜下进行叶肉细胞组织的观测及拍片。

相比无铝处理，低浓度的铝(K₁)对常绿杨‘A-61/186’茎和根的生长有适当的促进作用(图 1)，当铝浓度持续增大时，根和茎生长量均开始下降，浓度K₂下茎相对生长量相比K₀下降不显著，浓度大于K₂后开始显著下降；根生长量在浓度达到K₂后即开始显著下降。可见根系对铝胁迫的响应更为敏感。

图 1 铝胁迫对常绿杨‘A-61/186’生长量的影响 Fig.1 Effects of aluminum stress on the growth of evergreen poplar clone 'A-61/186' 图中不同字母表示处理间差异显著(P < 0.05)。下同。 The different letters indicate significant difference at 0.05 level.The same below.

根、茎、叶生物量在铝胁迫下表现出与生长量相一致的趋势(表 1)，在低浓度(K₁)铝处理下生物量有所增加，浓度达到K₂后，根和茎的生物量相比K₀开始显著下降，叶的生物量在浓度达到K₃后开始显著下降，根冠比也随着胁迫浓度的升高而降低，反映出胁迫对根的影响较为明显。因铝胁迫下根生物量的下降幅度大于茎和叶，因此地上部分生物量/总生物量的值随着胁迫浓度的升高而升高，即铝胁迫浓度越高，总生物量越小，而地下部分生物量显著下降，使得地上部分生物量占总生物量的比例越高。

表 1 铝胁迫对常绿杨‘A-61/186’生物量的影响^① Tab.1 The biomass structure of evergreen poplar clone 'A-61/186' under aluminum stress

表 1 铝胁迫对常绿杨‘A-61/186’生物量的影响① Tab.1 The biomass structure of evergreen poplar clone 'A-61/186' under aluminum stress 处理Treatment 生物量Biomass/g 根冠比 Root/top ratio 地上部分生物量/ 总生物量 Ground/total ratio 根 Root 茎 Stem 叶 Leaf 总生物量 Total K0 55.64±1.63a 42.33±3.07a 13.24±3.48a 111.21a 1.00a 0.50a K1 63.63±4.08a 44.64±2.45a 15.27±2.96a 123.55a 1.06a 0.48a K2 27.25±1.71b 36.32±1.83b 9.62±3.05a 73.19b 0.59b 0.63ab K3 12.96±1.45b 23.79±2.49b 6.18±0.63b 42.93c 0.43c 0.70b K4 9.13±1.25c 25.45±4.51b 3.99±0.66b 38.57c 0.31c 0.76c K5 6.73±2.96c 17.91±1.58c 2.36±0.41c 27.00c 0.33c 0.75c ①同列数字后不同小写字母表示不同处理间差异显著(P < 0.05)。Different letters in the same column indicate statistically significant difference at 0.05 levels among treatments.

铝胁迫下常绿杨“A-61/186”根、茎、叶中的铝含量随着铝胁迫浓度的增加而增加(图 3)。各器官中根的含铝量最高，从无铝处理K₀到最高浓度K₅，根中铝的含量是茎的6.61~28.17倍，是叶的1.85~11.42倍。在供试的铝浓度范围内，与无铝处理的K₀相比较，从K₁到K₅铝含量增加幅度根为86.11%~1 522.88%，茎为87.44%~280.68%，叶为96.61%~163.41%。随介质铝浓度的提高根中的铝含量大幅度增加，叶和茎中的铝含量随着胁迫浓度的增加增大到一定程度后趋于平缓，在高浓度胁迫下无显著差异。

图 3 铝胁迫下常绿杨‘A-61/186’叶绿素荧光参数Yield和Fv/Fm的变化 Fig.3 Yield and Fv/Fm of evergreen poplar clone 'A-61/186' under aluminum stress

一般情况下，没有遭受环境胁迫而且进行了充分暗适应的植物叶片F_v/F_m值在0.8~0.85之间，受到胁迫植株F_v/F_m值在0.3~0.7之间(Odasz-Albrigtsen et al., 2000；Oquist et al., 1998)。没有铝胁迫(K₀)时，‘A-61/186’杨叶片F_v/F_m为0.814，在铝最小胁迫浓度K₁下F_v/F_m值为0.832，比起无铝胁迫下有了一定的上升，铝胁迫浓度超过0.222 mmol·L^-1(K₂)后，F_v/F_m值都低于无铝处理(K₀)，且K₃、K₄、K₅与K₀差异显著(图 3)。Yield用以反映叶片所吸收光能中进行光合电子传递的能量所占的比例。从Yield值来看，K₃、K₄及K₅与K₀相比显著降低，这一变化趋势与F_v/F_m基本一致。

F₀降低反映出叶片非辐射能量的耗散增加，F₀的升高则表明反应中心失活或受到破坏(Odasz-Albrigtsen et al., 2000)。无铝胁迫(K₀)下F₀值与低铝胁迫(K₁)下相比没有明显变化，当胁迫浓度大于K₂后，F₀值均大于无铝处理K₀，且K₃, K₄及K₅与K₀差异显著(图 4)，说明铝胁迫下的叶片光合结构存在可逆失活的现象。

图 4 铝胁迫下常绿杨‘A-61/186’叶绿素荧光参数F0和NPQ的变化 Fig.4 F0 and NPQ of evergreen poplar clone 'A-61/186' under aluminum stress

铝胁迫浓度为K₃、K₄及K₅时的NPQ值均显著大于无铝处理K₀(图 4)。‘A-61/186’杨在遭受铝胁迫时把更多的吸收光能以热能的形式进行耗散，导致植物光合效能下降，与F₀及F_v/F_m反应的趋势相一致。

图 2 铝胁迫下常绿杨‘A-61/186’体内铝含量的变化 Fig.2 Al content of evergreen poplar clone 'A-61/186' under aluminum stress

从铝胁迫时间和胁迫浓度来看，胁迫30天(图 5)从铝浓度K₄开始，叶肉细胞核膜变厚；叶绿体肿胀，外膜局部肿胀突出，淀粉粒急剧减小，基粒片层和基质片层间隙明显，与核膜及线粒体之间分离。在胁迫60天(图 6)后，当铝浓度达到K₃，叶肉细胞细胞壁变窄，细胞核收缩；线粒体脊可见局部溶解；叶绿体明显膨胀，外膜突起而增厚，基粒和基质片层扭曲而蓬松，无淀粉粒；质膜、线粒体、叶绿体和核依次呈贴靠状态。当胁迫时间达到90天(图 7)，铝浓度K₂胁迫下，叶肉细胞核收缩且核膜变厚，核仁变小；叶绿体膨胀，膜增厚隆起，无淀粉粒，基粒和基质片层排列蓬松；质膜、叶绿体、核和线粒体呈相依偎状态。

图 5 铝胁迫30天常绿杨‘A-61/186’叶肉细胞超微结构 Fig.5 Ultrastructure of poplar mesophyll cells in evergreen poplar clone under aluminum stress for 30 d A-F分别是胁迫30天的对照试验(K0)及铝浓度0.074(K1), 0.222(K2)，0.370(K3)，0.518(K4)及0.666 mmol·L -1(K5)铝胁迫下的杨树叶肉细胞超微结构。下同。A to F, respectively, are mesophyll cells ultrastructure figures of evergreen poplar under control experiment (K0) and aluminum concentrations of 0.074 (K1), 0.222 (K2), 0.370 (K3), 0.518 (K4), and 0.666 (K5) mmol·L-1.The same below.Cw:细胞壁Cell wall；Cp:叶绿体Chloroplast；Ce:叶绿体膜Chloroplast membrane；Mi:线粒体Mitochondria；Gl:基粒片层Grana lamella；Sl:基质片层Stroma lamella；N:细胞核Nucleus；Nm:核膜Nuclear membrane；Nu:核仁Nucleolus；Pl:质膜Plasmalemma；Sg:淀粉粒Starch granules；Os:嗜锇体颗粒Osmiophilic globules.

图 6 铝胁迫60天常绿杨‘A-61/186’叶肉细胞超微结构 Fig.6 Ultrastructure of poplar mesophyll cells in evergreen poplar clone 'A-61/186' under aluminum stress for 60 d

图 7 铝胁迫90天常绿杨‘A-61/186’叶肉细胞超微结构 Fig.7 Ultrastructure of poplar mesophyll cells in evergreen poplar clone 'A-61/186' under aluminum stress for 90 d

铝是酸性土壤上植物的主要胁迫因素，近年来，植物对铝毒胁迫响应机制的研究多集中在草本植物上，尤其是一些粮食作物，如水稻(Oryza sativa)、玉米(Zea mays)、大麦(Hordeum vulgare)及豆类作物等(Baligar et al., 1989；Samac et al., 2003；Shen et al., 2005)，木本植物的研究主要集中在一些较喜酸土壤的植物上，如桉树、龙眼、柑橘类、茶树(Camellia sinensis)等，这些植物的适生区位于富铝化酸性土壤(肖祥希，2005；Silva et al., 2004；Chen et al., 2005；Mukhopadyay et al., 2012)。杨树是一种普遍适合种植在中性偏碱性土壤的植物(郑世锴，2006)，但发展快速的新品种的选育也使杨树的种植范围不断扩展，全球土壤酸化程度的加深和酸性土壤面积的扩展，杨树也要应对铝毒的胁迫。本研究中，当溶液铝浓度达到0.222 mmol·L^-1后，铝胁迫对常绿杨‘A-61/186’的生长开始产生抑制作用。叶肉细胞超微结构损伤程度的变化与生长量及叶绿素荧光参数的变化趋势相一致，是造成铝胁迫下光合效能下降的主要原因。植物的耐铝性存在较大差异，在铝浓度0.740 mmol·L^-1处理下，龙眼叶绿体超微结构受到破坏(肖祥希，2005)；部分茶树可以忍耐3 200 mol·L^-1的铝浓度(Li et al., 2011)；火炬松(Pinus taeda)在铝浓度0.580 mmol·L^-1时，其生长受到抑制(Mover-Henry et al., 2005)。由此可知，与喜酸性树种龙眼、茶树以及火炬松等相比，‘A-61/186’杨对酸性土壤铝胁迫敏感。

植物的根尖部分极易富集铝，因而铝对植物根系生长的抑制作用也较地上部分大(Samuelse et al., 1997)。通过对铝胁迫下常绿杨‘A-61/186’各组织中铝含量的分析发现，铝胁迫下，‘A-61/186’杨幼苗体内的铝也主要集中于根系，根的铝含量是茎的6.56~28.17倍，是叶的1.75~11.42倍。根中的铝含量随介质铝浓度的提高大幅度增加，在铝胁迫浓度达到K₃后，尽管根系的铝含量仍在持续增加，叶和茎中的铝含量逐渐趋于稳定，在高浓度(K₃、K₄、K₅)胁迫下无显著差异。且‘A-61/186’杨组织中的铝含量显著低于相近铝浓度胁迫的茶树、龙眼及桉树(肖祥希，2005；Silva et al., 2004；Mukhopadyay et al., 2012)，这说明‘A-61/186’杨为非铝富集植物。从铝胁迫对‘A-61/186’杨生物量的影响来看，与对照相比根的生长量下降幅度最大，其次是茎和叶，说明铝首先对‘A-61/186’杨根系产生危害，大量的铝积累在根系组织中，从而对根系细胞的结构和功能造成破坏，最终影响到根系的生长。而茎生长量的减小还在于过量的铝影响了其他养分的运转和吸收(Baligar et al., 1989)。但根系对铝的富集也可能是植物的一种自我保护的机制，通过根系的富集减少铝输送到地上部分，避免引起更大的毒害。

叶绿素荧光参数用以反映植物光合作用机制和光合生理状况，能够较为精确地揭示植物光合作用对环境变化的动态响应，在环境胁迫对植物光合作用影响的研究中得到了广泛应用。‘A-61/186’杨叶绿素荧光参数在不同浓度铝胁迫下产生了不同的变化。F_v/F_m值在K₁胁迫下相比K₀有所上升，可能是光系统Ⅱ向光系统Ⅰ传递的激发能减少的原因(许大全，2002)，在胁迫浓度高于0.222 mmol·L^-1(K₂)后均低于无铝胁迫，Yield的变化趋势与F_v/F_m相一致。铝胁迫下F₀和NPQ相比无铝处理均有升高，‘A-61/186’杨在遭受铝胁迫时把更多的吸收光能以热能的形式进行耗散, 因而使得光合效率下降, 这与生长量生物量降低的趋势相一致。铝胁迫下其他植物叶绿素荧光也表现出同样的趋势(Chen et al., 2005；2010；Masayuki et al., 2001)。

叶绿体是植物进行光合作用和能量转化的重要细胞器。叶绿体基质中悬浮由膜囊构成的类囊体，光合作用主要在基粒膜和基质膜上进行，类囊体正常的排列方式是保证其有最大的光面积和光合速率(Trebst，1974)。常绿杨叶绿体在铝胁迫下受到破坏，其中的类囊体结构膨胀扭曲，基粒和基质片层变得蓬松并且扭曲，这种结构会减少光能的吸收，影响光合作用效率。线粒体是细胞进行有氧呼吸制造能量的主要场所(许大全，2002)。铝胁迫下，常绿杨叶片细胞线粒体结构受到破坏，这必将影响细胞的呼吸作用，因而影响到植物的有氧糖代谢过程，使以ATP形式提供的能量减少，从而影响到植物生长。但铝胁迫对杨树光合活性酶及ATP合成机制的影响还需要进一步研究探讨。

铝胁迫会对常绿杨‘A-61/186’生理生态特性产生影响。本研究中，当溶液铝浓度达到0.222 mmol·L^-1后，铝胁迫对常绿杨的生长开始产生抑制作用。相比较茎、叶组织，铝胁迫下大量的铝积累在常绿杨根系，对根系细胞的结构和功能造成破坏，影响了根系生长。生物量分配结构上也表现出铝对‘A-61/186’杨地下部分的影响大于地上。叶片叶绿素荧光显示铝胁迫下‘A-61/186’杨把更多的吸收光能通过热能进行耗散, 因而光合效率下降，影响生长量和生物量。叶肉细胞超微结构损伤程度的变化与生长量及叶绿素荧光参数的变化相一致，说明铝胁迫下‘A-61/186’杨生长量和生物量的降低与铝对光合系统的直接损伤有关。因此，在‘A-61/186’杨栽培生产实践中要适当进行铝毒害的防治。