越南黄檀(Dalbergia tonkinensis)是蝶形花科(Papilionaceae)黄檀属(Dalbergia)的落叶乔木(吴师强等，2013)，是世界公认的3种香枝木之一，它与降香黄檀(D.odorifera)、印度黄檀(D.sissoo)同属一类，是世界珍稀名贵木材。在20世纪90年代，海南黄檀资源十分稀缺的情况下，人们开始引入越南黄檀作为其替代木材。我国正式引种栽培越南黄檀是在2002年，现已在广东、广西、福建和海南等地推广，海南是主要引种栽培区。目前，国内对该树种的研究多集中于种子萌发、育苗及材质辨别方面，对其病害研究甚少。

锈病是由担子菌门(Basidiomycota)锈菌目(Uredinales)的真菌引起的一类植物病害，通常为害植物的叶、茎和果实(方中达，1998)。锈病不仅分布广泛且危害性大，在禾谷类作物、豆科(Leguminosae)植物和梨(Pyrus)等多见报道。病菌夏孢子阶段，可随气流远距离传播，只要温度适宜，全年均可发生且重复侵染植物。该病发生严重时可导致嫩叶大量脱落，植物自身抵抗力减弱，更易遭受其他病原物侵染，从而遭受寒害，严重影响寄主生长发育。而黄檀属植物锈病在印度、尼泊尔、巴基斯坦等多个国家均有过较大的流行和危害(Harsh et al., 2006)。

越南黄檀锈病于2014年2月下旬在海南省澄迈县越南黄檀人工林调查时发现。近2年的调查检测结果表明，越南黄檀锈病在海南省澄迈县全年几乎均可发生，且2015年危害更为严重，在盛发期重病株率可达75%以上。为了明确海南省越南黄檀锈病病原菌的分类地位，采用单孢子堆分离法分离纯化，结合其林间发病症状、孢子形态特征及ITS序列分析结果进行鉴定，为开展该病害的防治及进一步研究奠定了基础。

1) 供试植株 供试越南黄檀健康实生苗(1年生)由海南省林业科学研究所提供。在锈病流行季接种(3月下旬)，接种前先置于自然条件下隔离培养1个月，确定没有感病。

2) 供试菌种 2014年5月在澄迈县太平乡越南黄檀发病人工林采集带有夏孢子堆的病叶，取病叶上新鲜的夏孢子制备浓度为1×10⁵个·mL^-1的夏孢子悬浮液，采用涂抹接种的方法接种在越南黄檀健康苗新生嫩叶上，自然条件下隔离培养，直到长出黄色夏孢子堆。采用单孢子堆分离方法(魏国荣等，2011)，获得越南黄檀锈病病原的纯培养物HNCM1，再将HNCM1接种在健康苗上。

1) 夏孢子和冬孢子形态观察 剪取新鲜病叶在体视显微镜下初步观察症状特征。用无菌解剖刀刮取菌株HNCM1接种产生的单孢子堆以无菌水作浮载剂，制成玻片观察。观察黄色夏孢子堆中夏孢子主要形态特征--形状、颜色、大小、孢子壁厚度、芽孔位置等，观察苍白色冬孢子堆中冬孢子的主要形态特征--形状、颜色、大小、孢子壁厚度、柄长等。分别测量50个夏孢子和冬孢子后，孢子尺寸取长与宽的范围，孢子壁尺寸取平均值，冬孢子柄长取其长的范围。

2) 越南黄檀锈病病原菌DNA提取 将HNCM1的夏孢子按照1.1 2)所述方法接种与培养，至叶片显症产孢后。用无菌解剖刀刮取0.1 g夏孢子堆，置于灭菌的2 mL离心管中，放入超低温冰箱保存备用。夏孢子DNA提取使用FastDNA Kit试剂盒，操作严格按照使用说明书进行。提取的DNA溶液保存于-20 ℃备用。

3) ITS序列扩增与序列分析 采用由铂尚生物技术有限公司真菌通用引物ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)、ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)扩增DNA。PCR反应体系(25 μL)：引物各2.0 μL，模板DNA 2.0 μL，Taq酶0.25 μL，Mix 12.5 μL，dNTPs 1 μL，ddH₂O 5.25 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性4 min；95 ℃变性1 min，52 ℃退火60 s，72 ℃延伸1 min，34个循环；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取5 μL PCR产物采用1.2%琼脂糖凝胶进行电泳检测(120 V电压，30 min，0.5 μg·mL^-1 EB染色)。PCR产物委托铂尚生物技术有限公司进行测序。使用BLAST工具软件，在GenBank进行序列同源性比对，从分子的角度进行分析，并向GenBank提交序列。

越南黄檀锈病主要危害越南黄檀叶片，在嫩枝上也有发生，在当年生的嫩梢上发生最为严重。前期，在夏孢子出现之前，嫩叶正面凹陷，背面形成近圆形突起，直径约0.2~2.5 mm，数日后凸起处长出黄色有光泽的夏孢子，夏孢子积聚形成黄色夏孢子堆(图 1A)，随着嫩叶上突起增多，黄色或橙黄色夏孢子堆几乎布满整个嫩梢，部分叶片在夏孢子时期就会发生卷曲甚至枯死，有些夏孢子直接从叶面长出，形成点状夏孢子堆。生长到后期夏孢子堆颜色由黄色变为锈褐色，并形成枯死斑(图 1B)，部分病叶提前脱落。随着夏孢子的反复侵染，病害在林间迅速扩展，病情指数持续增加。冬孢子堆较少出现，在天气转凉时偶见，其形成过程与夏孢子堆类似，形成初期埋在嫩叶表皮下面，在叶背面形成呈圆形或不规则形小突起，疱状(图 1C)，一般比夏孢子堆小，直径约0.1~1.0 mm，成熟时疱状突起顶部叶表皮发生纵裂，露出乳白色的胶质状物即为冬孢子。

图 1 越南黄檀锈病发病症状 Fig.1 Symptoms of the Dalbergia tonkinensis rust A：夏孢子堆Uredium；B：褐色枯死斑Brown dead spots；C：冬孢子堆Telium.

夏孢子堆生于叶面、叶柄或嫩枝上，散生或聚生，有时相互连合呈带状或块状，裸露，粉状，鲜黄色；夏孢子圆形、椭圆形，大小为(13~21)μm×(10~16) μm，壁薄，约1 μm，散生，芽孔不明显(图 2A)。

图 2 越南黄檀锈病病原菌形态 Fig.2 Characteristics of the pathogen of the D. tonkinensis rust A：夏孢子Urediospore；B：冬孢子Teliospore.

冬孢子堆较少出现，多生于叶背面，一般呈圆形或不规则形，裸露，常有破裂的寄主表皮围绕，隆起突出明显，坚实，苍白色；冬孢子椭圆形、棍棒形或近纺锤形，大小为(19~28) μm×(13~16) μm，无色，光滑单细胞，具柄，长约7~10 μm，壁薄，约1 μm (图 2B)，可出现在夏孢子堆中。

Ono (1984)指出无眠单胞锈菌属(Maravalia)主要特点在于冬孢子的形态特征，即冬孢子无明显的萌发孔，单细胞，壁薄、无色，有柄(1984)。Zhuang等(2012)指出紫檀无眠单胞锈菌(M. pterocarpi)的夏孢子堆散生或群生，新鲜夏孢子为黄色，球状或倒卵球形，(14~20)μm× (11~15) μm，壁较厚, 1~1.5 μm，萌发孔难发现。冬孢子堆类似夏孢子堆，紧凑；冬孢子长圆形，椭圆形或棒状，(17~30) μm× (9~15) μm，单细胞，壁厚约1 μm，无色，光滑，具柄。本研究结果与上述研究在孢子主要特征方面均完全一致，因此越南黄檀锈病病原菌为紫檀无眠单胞锈菌。

采用通用引物ITS4/ITS5对病原纯化菌株HNCM1菌株的rDNA-ITS序列进行PCR扩增，扩增出1条约700 bp的清晰条带，将条带切胶回收纯化进行双向测序及拼接后得到640 bp的ITS序列。将所得到的ITS序列进行校正后与GenBank中已有序列进行比较发现，无同源性较高的序列，与柄锈菌属的Diorchidium polyalthiae(JF263493)，Puccinia popowiae(KM217353，JF263495)同源性最高，仅为90%。序列已提交GenBank并获取登录号为KU301795。

2014年2月调查时发现在海南省澄迈县种植的越南黄檀有锈病感染，经过近2年监测发现该病每年暴发2次，4月上旬-6月上旬与9月中旬-11月上旬为2个盛发期，重病株发病率可达75%以上，嫩叶卷曲或畸形，锈斑被满叶片引起叶片早落，严重影响越南黄檀的生长发育。因越南黄檀属于黄檀属，近而查阅参考了Arthur等(1936)报道的黄檀锈病，Thirumalachar (1947)和Ramakrishnan等(1947)分别在印度的奇诺紫檀(Pterocarpus marsupium)和锥序黄檀(Dalbergia paniculata)上发现的Scopellopsis dalbergice和Mainsia pterocarpi，Thirumalachar (1949)关于Scopellopsis和Maravalia的分析报告，Ono (1984)对于Maravalia主要特征描述，及Zhuang等(2012)确定的中国新记录种紫檀无眠单胞锈菌形态特征，从形态学上确定了该菌为无眠单胞锈菌。由于锈菌是专性寄生菌，但寄主范围并非很狭窄，且一个锈菌的种往往可以寄生在同科不同属的植物上，印度黄檀、越南黄檀、滇黔黄檀(D.yunnanensis)、奇诺紫檀均属于黄檀族Dalbergieae紫檀亚族Pterocarpinae，所以经过比较分析可以确定该病原菌为紫檀无眠单胞锈菌Maravalia pterocarpi。

黄檀属植物锈病最早在印度黄檀上发现并报道(Arthur et al., 1936)，此后有报道称在印度的马哈拉施特拉(Maharashtra) (Patil et al., 1971)、德拉敦(Dehradun) (Harsh et al., 2006)等地的黄檀上也有锈病发生。Harsh等(2006)通过人工接种锈菌成功筛选出了抗锈病的印度黄檀品系，据称现锈病已经扩展到印度以外的尼泊尔、巴基斯坦等地的黄檀上。可见黄檀锈病由来已久，在国外已大面积发生，且研究较为深入。比较而言，国内黄檀锈病的研究少、起步晚，仅有滇黔黄檀锈病的报道，且是从形态学上对该锈病的病原进行了描述(Zhuang et al., 2012)。本研究对发生在越南黄檀上的紫檀无眠单胞锈菌进行了形态学描述，同时还对其林间发病症状及夏孢子ITS序列进行了分析。ITS序列Blast比对分析结果表明，病原菌ITS序列与GenBank中已有的序列同源性较低，与柄锈菌同源性最高，但最高仅为90%，且GenBank中没有紫檀无眠单胞锈菌的基因序列，这与该锈菌的研究进展相符，因为关于黄檀锈病的报道均发生在1980年前后，且2012年发生在滇黔黄檀上的紫檀无眠单胞锈菌也是从形态学的角度进行鉴定的，故无法在GenBank中比对出结果，更无法进行ITS序列系统发育分析。

2014年调查中发现越南黄檀上有锈病，2015年该病发生更为严重，且在同为黄檀属的奥氏黄檀(D.oliveri)上也有轻微类似的症状，该症状是否由同一病原菌引起的，需要进一步研究，该病原菌的寄主范围是否会扩大造成乡土树种降香黄檀发病有待进一步观察。现既已在越南黄檀上发现锈病，且锈病已严重影响越南黄檀的生长发育，因而寻找抗锈病品种可从根本上减轻锈病危害(沈瑞祥等，1989；李万英等，1965；王永民等，1998)。此外，在锈菌中重寄生现象普遍存在(黄云等，2005；叶利芹等，2011)，越南黄檀锈菌有无重寄生现象有待研究。

本研究利用孢子形态观察结合ITS序列分析的方法对越南黄檀锈病病原菌进行鉴定，并经夏孢子、冬孢子形态学分析，确定引起海南省澄迈县越南黄檀锈病的病原菌为紫檀无眠单胞锈菌。病原纯化菌株HNCM1(登录号：KU301795) rDNA-ITS序列Blast比对分析结果表明GenBank中尚无同源性较高序列，与柄锈菌同源性最高，但仅为90%。本研究为越南黄檀锈病的防治和进一步研究奠定了基础。