青海高原的高寒沙区是全国土地沙漠化危害最严重的区域之一。该地区的海拔高度一般在2 800~3 400 m，与其他沙漠化区域相比，其最大的特点为海拔较高、气温较低、积温较少、无霜期较短，因此也是自然环境条件最严酷的沙区之一(张登山等，2007)。通过人工措施保护、恢复和建设植被是防治土地沙漠化最有效、最经济、最持久和最稳定的措施，也是改造利用沙漠化土地的重要途径(Su et al., 2005；Zhou et al., 2008)。受高海拔、积温少、气温低等自然气候条件的影响，该地区成为冻害较严重的地区之一，并对当地植被生长发育产生较严重影响(罗生洲等，2012；赵恒和等，2014)，而重复低温过程则会对植物造成更大伤害(陈芳等，2009)。通过研究不同沙区植物抗寒特性，筛选具有优良抗寒性的植物，对于当地退化土地植被恢复具有重要的指导意义。

叶绿素荧光的变化反映出植物光合作用实时信息，可用于探测植物叶片光合能力与热耗散情况(Bradbury et al., 1984)，同时环境的变化对植物光合过程产生的影响也能通过叶绿素荧光特性表现，因此叶绿素荧光参数常被作为研究植物在逆境胁迫下的抗逆性指标(刘泽彬等，2014；2015；任子蓓等，2015；谭晓红等，2010)，也有学者认为叶绿素荧光参数可作为抗冷性选择指标(Fracheboud et al., 1999)，且叶绿素荧光分析技术也越来越多地用于研究植物抗寒特性(吉春容等，2012)。有关植物抗寒性的研究多集中在不同温度低温胁迫对植物抗寒生理指标的影响(谢安强等，2012)、低温胁迫不同时间对植物抗寒生理指标的影响(邵怡若等，2013)以及低温胁迫恢复后抗寒植物生理指标的变化(武辉等，2014)，而关于植物对重复低温胁迫响应的研究较少(张毅龙等，2014)。锦鸡儿属(Caragana)植物广泛分布于我国干旱荒漠区，是当地植被的重要组成物种，其不仅具有抗旱、耐贫瘠等优良特性(方向文等，2011)，而且具有较高的经济和生态价值(闫志坚等，2006；Li et al., 2014；2015)，成为我国干旱荒漠地区植被恢复的优良植物种之一。本研究通过选取柠条锦鸡儿(C. korshinskii)、中间锦鸡儿(C. intermedia)、小叶锦鸡儿(C. microphylla)和川青锦鸡儿(C. tibetica)4种锦鸡儿属植物作为研究对象，测定重复低温胁迫条件下其叶绿素荧光参数的变化特征，分析对比4种锦鸡儿对重复低温胁迫的响应，为高寒沙地优良固沙植物筛选及植被恢复提供理论依据。

本研究所选用的柠条锦鸡儿、中间锦鸡儿、小叶锦鸡儿和川青锦鸡儿4种锦鸡儿属植物种子均来自青海共和荒漠生态系统定位观测研究站。

每种植物选取粒籽饱满的种子50个，分别放入5个培养杯(高12 cm，直径18 cm，底部有孔)，每个培养杯内种子数量为10个。分别将装有不同植物种子的培养杯放入培养箱培养(MGC-250)，培养箱设置条件为：白天(12 h)，饱和光照(12 000 LX)，温度为30 ℃；夜间(12 h)，零光照，温度为20 ℃。每天清晨给培养杯加水适量，为种子萌发创造湿度条件。待各植物种植株高度在15~20 cm，生产出≥10片叶子时，分别在每种植物的5盆幼苗中各选择3株生长良好的植株作为待测植株，即每种植物待测植株为15株。为保证测量结果准确可靠，待测植株在测量前经过12 h充分暗适应，使用Li-6400分别测定不同植物低温胁迫前的初始荧光(F_o)，最大荧光(F_m)，最大光化学效率(F_v/F_m)，PSⅡ电子传递速率(ETR)，光化学猝灭系数(q_P)和非光化学猝灭系数(NPQ)，每株待测植物测3片叶子，每个叶子测3~5个重复。测试结束后，将培养箱环境条件设置为零光照(充分暗适应)，温度为0 ℃，该环境条件胁迫12 h后(第1次低温胁迫)，按照胁迫前的方法测定各植物的叶绿素荧光参数。测试结束后，将培养箱设置条件恢复为：白天(12 h)，饱和光照，温度为30 ℃；夜间(12 h)，零光照，温度为20 ℃。将经过低温胁迫12 h后的不同植株，在上述条件下恢复5昼夜后，将培养箱环境条件设置成零光照(充分暗适应)，温度为0 ℃，该环境条件胁迫24 h后(第2次低温胁迫)，按照胁迫前的方法测定各植物的叶绿素荧光参数。

利用SPSS18.0软件对试验数据统计分析，使用Excel 2003软件作图。

初始荧光(F_o)由PSⅡ捕光叶绿素蛋白复合物发出，一般情况下，其值保持稳定，当光合机构受到破坏时则会升高(张守攻，1999)。由图 1可知，在第1次低温胁迫后，4种锦鸡儿的F_o较对照表现出增加的趋势，但是第1次低温胁迫前后不同锦鸡儿的F_o差异性不显著(P > 0.05)。第2次低温胁迫后，4种锦鸡儿的F_o较对照也表现出增加的趋势，柠条锦鸡儿、中间锦鸡儿和小叶锦鸡儿在经历重复低温胁迫前后F_o之间差异性不显著(P > 0.05)，而川青锦鸡儿经过重复低温胁迫后的F_o显著高于对照(CK)(P < 0.05)，说明不同锦鸡儿幼苗的叶片发生可逆或者不可逆的失活，并且重复低温胁迫后，川青锦鸡儿光合机构受到破坏程度较大。

图 1 不同锦鸡儿低温胁迫前后初始荧光变化 Fig.1 Initial fluorescence of different varieties of Caragana before low temperature stress and after low temperature stress 不同小写字母表示同一植物不同处理之间的叶绿素荧光参数差异显著(P < 0.05)。下同。Values followed by different lowercase letters mean the difference of chlorophyll fluorescence characteristics were significant in different treatments, according to Duncan’s test (P < 0.05)。The same below.

最大荧光(F_m)是PSⅡ反应中心处于完全关闭时的荧光产量。由图 2可知，4种锦鸡儿的F_m经过低温胁迫后均呈现降低的趋势。其中，柠条锦鸡儿第1次低温胁迫后和第2次低温胁迫后的F_m显著低于对照(P < 0.05)；中间锦鸡儿、川青锦鸡儿和小叶锦鸡儿在第1次低温胁迫前后的F_m无显著差异(P > 0.05)，但是经过第2次低温胁迫后，3种锦鸡儿的F_m显著低于对照(P < 0.05)。

图 2 不同锦鸡儿低温胁迫前后最大荧光 Fig.2 Maximum fluorescence of different varieties of Caragana before low temperature stress and after low temperature stress

最大光化学效率(F_v/F_m)反映PSⅡ反应中心内光能转化效率，是光抑制程度的可靠指标(赵丽英等，2005；Demmigadams et al., 1996)。由图 3可知，4种锦鸡儿的F_v/F_m均随着低温胁迫时间的增加而降低。第1次低温胁迫后，柠条锦鸡儿和小叶锦鸡儿的F_v/F_m显著低于对照(P < 0.05)，中间锦鸡儿和川青锦鸡儿的F_v/F_m也低于对照，但第1次胁迫前后差异不显著(P > 0.05)。第2次低温胁迫后，4种锦鸡儿的F_v/F_m均显著低于对照(P < 0.05)。

图 3 不同锦鸡儿低温胁迫前后最大光化学效率 Fig.3 Maximum photochemical efficiency of PSⅡ of different varieties of Caragana before low temperature stress and after low temperature stress

由图 4可知，低温胁迫后，4种锦鸡儿的PSⅡ电子传递速率(ETR)均呈现逐渐降低的趋势。柠条锦鸡儿和中间锦鸡儿低温胁迫后的ETR与对照之间差异性不显著(P > 0.05)；川青锦鸡儿第1次低温胁迫后的ETR与对照之间差异不显著(P > 0.05)，但是经历第2次低温胁迫后的ETR显著低于对照(P < 0.05)；小叶锦鸡儿在第1次低温胁迫和第2次低温胁迫后的ETR均显著降低(P < 0.05)。

图 4 不同锦鸡儿低温胁迫前后PSⅡ电子传递速率 Fig.4 PS Ⅱ electron transfer rate of different varieties of Caragana before low temperature stress and after low temperature stress

光化学猝灭系数(q_P)是PSⅡ天线色素吸收光能用于光化学电子传递的份额，其值越大，PSⅡ的电子传递活性越大(赵会杰等，2000)。由图 5可知，不同锦鸡儿植物种在重复低温胁迫后q_P均呈现不同程度的降低。柠条锦鸡儿和小叶锦鸡儿在重复低温胁迫后的q_P显著降低(P < 0.05)，但是中间锦鸡儿的q_P降低不显著(P > 0.05)，川青锦鸡儿的q_P在第1次低温胁迫后和第2次低温胁迫后均显著低于对照(P < 0.05)。

图 5 不同锦鸡儿低温胁迫前后光化学猝灭系数 Fig.5 PSⅡ photochemical fluorescence quenching coefficient of different varieties of Caragana before low temperature stress and after low temperature stress

非光化学猝灭系数(NPQ)是反应PSⅡ反应中心通过热的形式耗散掉过剩光能的比例，热耗散有利于植物光合机构免受破坏，NPQ值增加说明植物以增加热耗散的方式消耗过剩的激发能来避免光抑制产生的伤害，因此非光化学猝灭是植物的一种自我保护机制(Demmig-Adams，1990)。由图 6可知，柠条锦鸡儿在重复低温胁迫后的NPQ值显著高于对照(P < 0.05)，说明柠条锦鸡儿在重复低温胁迫后，以增加热耗散的方式消耗过剩的激发能来避免光抑制产生的伤害。中间锦鸡儿和川青锦鸡儿的NPQ在第1次低温胁迫后显著增加(P < 0.05)，说明中间锦鸡儿和川青锦鸡儿在第1次低温胁迫处理后，均以增加热耗散的方式消耗过剩的激发能来避免光抑制产生的伤害，但经过重复低温胁迫处理后，中间锦鸡儿和川青锦鸡儿的NPQ较对照没有显著差异(P > 0.05)，说明重复低温胁迫后其保护机制消失。小叶锦鸡儿的NPQ在低温胁迫过程中呈现逐渐降低的趋势，重复低温胁迫后小叶锦鸡儿的NPQ显著低于对照(P < 0.05)。

图 6 不同锦鸡儿低温胁迫前后非光化学猝灭系数 Fig.6 PSⅡ non-photochemical fluorescence quenching coefficient of different varieties of Caragana before low temperature stress and after low temperature stress

低温胁迫对植物生理过程的影响是多方面的，一定程度的低温胁迫，可引起植物叶片光合机构受到损伤，影响到PSⅡ反应中心的光合电子传递和光合磷酸化过程，引起暗反应的相关酶的变化(温国胜等，2006)，因此叶绿素荧光参数极易受逆境的影响，是快速、灵敏无损伤的研究和探测低温对植物光合生理影响的方法(张静等，2011)，已被应用于紫花苜蓿(Medicago sativa)、巴旦杏(Amygdalus communis)等植物的抗寒性研究中(陈世茹等，2011；吉春容等，2012)。

本研究中，在重复低温胁迫后4种锦鸡儿植物均表现出初始荧光(F_o)增加，最大荧光(F_m)、最大光化学效率(F_v /F_m)、PSⅡ电子传递速率(ETR)和光化学猝灭系数(q_P)降低的趋势，说明低温胁迫对不同锦鸡儿植物光合机构产生影响，这与陈世茹等(2011)研究结果类似，但是不同锦鸡儿植物的荧光参数对重复低温胁迫的响应程度有所不同。

低温条件下，F_o的降低是PSⅡ的热耗散增加所致，F_o的增加表明PSⅡ反应中心已受到不可逆转的失活或破坏(张守攻，1999)。本研究中川青锦鸡儿在重复低温胁迫后的初始荧光(F_o)与对照相比显著增加(P < 0.05)，说明低温胁迫降低了其原初光能转化效率，引起了光抑制造成PSⅡ反应中心失活或伤害，而其他锦鸡儿在重复低温胁迫后的初始荧光虽然增加，但是与对照相比差异性没有达到显著水平(P > 0.05)，说明其受低温胁迫影响较小，这与张毅龙等(2014)对6种珍贵树种在低温胁迫条件下苗木光合荧光特性的响应机理的研究结果一致。

重复低温胁迫后，4种锦鸡儿的最大荧光(F_m)显著低于对照，说明4种锦鸡儿光合机构的非光化学过程增大，电子传递潜力降低。最大光化学效率(F_v/F_m)反映PSⅡ反应中心内光能转化效率，是研究植物对逆境响应的重要生理指标，4种锦鸡儿的最大光化学效率(F_v/F_m)值均显著低于对照(P < 0.05)，说明4种锦鸡儿在重复低温胁迫下，光能转换效率受到了抑制，这与莫亿伟等(2011)对柱花草(Stylosanthes guianensis)的研究结果一致。除柠条锦鸡儿和中间锦鸡儿的PSⅡ电子传递速率(ETR)降低不显著(P > 0.05)外，川青锦鸡儿和小叶锦鸡儿的PSⅡ电子传递速率(ETR)显著低于对照(P < 0.05)，说明重复低温胁迫损害了川青锦鸡儿和小叶锦鸡儿光合机构，导致光合电子传递效率下降，这与吕晓菡等(2013)的研究结果一致。除了中间锦鸡儿的光化学猝灭系数(q_P)降低不显著(P > 0.05)外，其他3种锦鸡儿的光化学猝灭系数(q_P)显著低于对照(P < 0.05)，说明除了中间锦鸡儿外的3种锦鸡儿幼苗在重复低温胁迫下光合同化能力均受到影响，这与陈世茹等(2011)的研究结果一致。综上所述，重复低温胁迫后，川青锦鸡儿的F_o，F_m，F_v/F_m，ETR和q_P均表现出显著变化(P < 0.05)；小叶锦鸡儿的F_m，F_v/F_m，ETR和q_P均表现出显著变化(P < 0.05)，F_o变化不显著(P > 0.05)；柠条锦鸡儿的F_m，F_v/F_m和q_P均表现出显著变化(P < 0.05)，F_o和ETR变化不显著(P > 0.05)；中间锦鸡儿仅有F_m和F_v/F_m显著降低(P < 0.05)，其他参数变化不显著(P > 0.05)，因此重复低温胁迫对4种锦鸡儿叶绿素荧光参数影响程度的大小排序为：川青锦鸡儿 > 小叶锦鸡儿 > 柠条锦鸡儿 > 中间锦鸡儿。

非光化学猝灭系数(NPQ)是反应PSⅡ反应中心通过热的形式耗散掉过剩光能的比例，热耗散有利于植物光合机构免受破坏，因此非光化学猝灭是植物的一种自我保护机制(Demmig-Adams，1990)。在本试验中也产生相同的结果，其中川青锦鸡儿和中间锦鸡儿均在第1次低温胁迫后，其NPQ显著升高(P < 0.05)，说明在这个处理水平下两种植物通过增加热耗散以消耗过剩的激发能，减轻对光合机构的损害；柠条锦鸡儿在第1次低温胁迫后，其NPQ没有发生显著变化(P > 0.05)，但在第2次低温胁迫后，其NPQ显著升高(P < 0.05)，说明在重复低温胁迫后，柠条锦鸡儿开始通过增加热耗散以消耗过剩的激发能，减轻对光合机构的损害；小叶锦鸡儿的NPQ随着胁迫时间的增加，呈现逐渐降低的趋势，说明在低温胁迫下未产生通过增加热耗散以消耗过剩的激发能保护光合机构的机制。因此，在低温胁迫过程中，中间锦鸡儿、柠条锦鸡儿和川青锦鸡均表现出不同程度的通过增加热耗散以消耗过剩的激发能，减少低温胁迫对光合机构的损害的能力，研究表明，即使是同属植物，其NPQ对低温胁迫的响应机制也存在差异性，这与陈世茹等(2011)对紫花苜蓿的研究结果一致。

重复低温胁迫对4种锦鸡儿光合荧光参数均产生不同程度的影响，川青锦鸡儿受重复低温胁迫的影响较大，其次为小叶锦鸡儿，再次为柠条锦鸡儿，中间锦鸡儿受重复低温胁迫的影响相对较小。在低温胁迫过程中，中间锦鸡儿、柠条锦鸡儿和川青锦鸡可通过增加热耗散以消耗过剩的激发能，保护光合机构免受损害。综合分析表明，中间锦鸡儿和柠条锦鸡儿对重复低温胁迫具有较强的适应性，小叶锦鸡儿和川青锦鸡儿对重复低温胁迫的适应性稍差。