林业科学  2016, Vol. 52 Issue (1): 62-70   PDF    
DOI: 10.11707/j.1001-7488.20160108
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文章信息

李培, 阙青敏, 欧阳昆唏, 李俊成, 湛欣, 朱芹, 张俊杰, 邓小梅, 陈晓阳
Li Pei, Que Qingmin, Ouyang Kunxi, Li Juncheng, Zhan Xin, Zhu Qin, Zhang Junjie, Deng Xiaomei, Chen Xiaoyang
不同种源红椿SRAP标记的遗传多样性分析
Genetic Diversity of Toona ciliata from Different Provenances Based on Sequence-Related Amplified Polymorphism (SRAP) Markers
林业科学, 2016, 52(1): 62-70
Scientia Silvae Sinicae, 2016, 52(1): 62-70.
DOI: 10.11707/j.1001-7488.20160108

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收稿日期：2015-02-02
修回日期：2015-04-29

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李培
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湛欣
朱芹
张俊杰
邓小梅
陈晓阳

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李培, 阙青敏, 欧阳昆唏, 李俊成, 湛欣, 朱芹, 张俊杰, 邓小梅, 陈晓阳. 2016. 不同种源红椿SRAP标记的遗传多样性分析[J]. 林业科学, 52(1): 62-70.
Li Pei, Que Qingmin, Ouyang Kunxi, Li Juncheng, Zhan Xin, Zhu Qin, Zhang Junjie, Deng Xiaomei, Chen Xiaoyang. 2016. Genetic Diversity of Toona ciliata from Different Provenances Based on Sequence-Related Amplified Polymorphism (SRAP) Markers. Scientia Silvae Sinicae, 52(1): 62-70.  DOI: 10.11707/j.1001-7488.20160108
不同种源红椿SRAP标记的遗传多样性分析
李培1, 2, 阙青敏2, 欧阳昆唏2, 李俊成2, 湛欣2, 朱芹3, 张俊杰2, 邓小梅2, 陈晓阳2     
1. 北京林业大学生物科学与技术学院 北京 100083;
2. 华南农业大学林学与风景园林学院 广东省森林植物 种质创新与利用重点实验室 广州 510642;
3. 嘉应学院 梅州 514015
收稿日期：2015-02-02；修回日期：2015-04-29
基金项目：国家林业局林业公益性行业科研专项(201004020)。
通讯作者：华南农业大学林学与风景园林学院广东省森林植物种质创新与利用重点实验室广州510642
摘要：[目的] 由于过度采伐和天然更新能力较差等原因，红椿天然林分和林木的数量日益减少。深入研究红椿不同种源的遗传多样性，揭示其群体结构分布，可为其种质资源保护和选择育种提供理论依据。[方法] 利用相关序列多态性分子标记（SRAP）对来自中国的29个种源及1个澳大利亚种源进行遗传多样性分析。各种源地选取母树30株，株距50 m以上。澳大利亚种源取自华南农业大学红椿资源收集圃。利用POPGENE1.32，NTSYS-pc2.1，GenAIEx 6.5和STRUCTRUE 2.3进行遗传参数估计、聚类图构建、主坐标分析、地理隔离模式构建及遗传结构分析。[结果] 24对SRAP引物组合共扩增出505条多态性条带，引物的多态信息含量（PIC）均值为0.41； 30个红椿种源间的Nei's基因多样性指数平均为0.3770；种源内Shannon's信息指数（I）变动幅度为0.1575~0.4675，种源间均值为0.5569。分子方差分析（AMOVA）得出，在总的遗传变异中，79.26%的遗传分化存在于种源间，种源内分化仅占20.74%，表明红椿的遗传分化主要来源于种源间，红椿良种选育应首先开展种源选择。STRUCTURE分析将30个红椿种源分成2大组群，趋势呈现为华东与华中种源为一组，西南、华南与澳大利亚的种源为另一组； Mantel检测显示，中国红椿种源存在地理隔离模式（IBD）。非加权平均法（UPGMA）聚类分析将红椿30个种源划分为4大类：第Ⅰ类包括14个种源，主要是来自华中和华东地区的种源；广东乐昌种源独立成为一类，形成第Ⅱ类；第Ⅲ类包括13个种源，主要是来自西南和华南的种源；广东云浮种源和澳大利亚多瑞格的种源组成第Ⅳ类。主坐标分析（PCoA）得到的结果与聚类分析结果相似。[结论] 红椿分布地区生境片段化，使各群体在空间上相对隔离、基因交换频率低、流动程度小，从而导致地理变异。聚类分析与主坐标分析的结果与地理分布格局基本吻合。在红椿保护和管理的过程中，在对原有生境进行保护的同时，要加强人工繁育技术研究，并注意最大限度地保护红椿的遗传多样性。
关键词： 红椿    SRAP标记    遗传多样性    遗传结构    
Genetic Diversity of Toona ciliata from Different Provenances Based on Sequence-Related Amplified Polymorphism (SRAP) Markers
Li Pei1, 2, Que Qingmin2, Ouyang Kunxi2, Li Juncheng2, Zhan Xin2, Zhu Qin3, Zhang Junjie2, Deng Xiaomei2, Chen Xiaoyang2     
1. College of Biological Sciences and Technology, Beijing Forestry University Beijing 100083;
2. Guangdong Key Laboratory for Innovative Development and Utilization of Forest Plant Germplasm College of Forestry and Landscape Architecture, South China Agricultural University Guangzhou 510642;
3. Jiaying University Meizhou 514015
Abstract: [Objective] Poor natural regeneration and over-exploitation have resulted in the continual decline of natural forests and trees of Toona ciliata. In depth studies of genetic diversity and structure of T. ciliata of different provenances are particularly important for conservation, utilization of genetic resources, and the development of future breeding programs for the species.[Method] Sequence-related amplified polymorphism (SRAP) markers were used to investigate genetic diversity of 29 provenances from China and one provenance from Australia of T. ciliata to define the level of genetic diversity and the relationships among different provenances. Samples from China were collected from natural stands. Each provenance was represented by 30 sample trees with a distance of at least 50 m among the sample trees. The Australian provenance was taken from the resources collection nursery of the South China Agricultural University. The POPGENE1.32 software was used for genetic diversity parameters calculation. The NTSYS-pc2.1 software was used for cluster analysis based on the matrix of Nei's genetic distances and the degree of genetic relatedness among provenances was assessed by principal coordinates analysis (PCoA) and MANTEL analysis with GenAIEx 6.5. STRUCTRUE 2.3 was used to analysis the genetic structure. [Result] A total of 505 polymorphic bands were amplified by 24 pairs of primers. The average value of polymorphism information content (PIC) was 0.41. The average value of Nei's gene diversity index (H) was 0.3770. Shannon's information index (I) within provenances ranged from 0.1575 to 0.467 5, the average value was 0.556 9 among provenances. The AMOVA indicated that 79.24% of the total variation was among provenances and 20.76% was within provenances, revealing that provenance selection is important for the breeding of T. ciliata. In STRUCTURE analysis, 30 provenances were divided into two groups. Group Ⅰ included the provenances from central and eastern China. The provenances of southwest and south China and the provenance of Australia formed Group Ⅱ. Isolation-by-distance (IBD) patterns were revealed in the provenances of China by Mantel test. The unweighted pair group method of arithmetic averages (UPGMA) cluster showed that the 30 provenances could be classified into four clusters. Cluster Ⅰ consisted of the 14 provenances from Central China and East China. Cluster Ⅱ consisted of only Lechang provenance. Cluster Ⅲ was composed of provenances mainly from South China and Southwest China, but the two provenances from Guangdong province were not classified into the same cluster. GroupⅣ was composed of provenances from Guangdong (YF) and the provenance of Australia. The result was consistent with biplot of PCoA analysis. [Conclusion] Habitat fragmentation of the natural distribution has led to spatial isolation among populations, low rate of gene exchange and limited gene flow, resulting in geographic variation among provenances. The UPGMA cluster analysis and PCoA analysis demonstrated a clear variation pattern consistent with the geographical trend of T. ciliata. Studies of artificial reproduction should be reinforced while carrying out protection of the original habitat, and collect all current genetic resources and expand the range of collection as far as possible.
Key words: Toona ciliata    SRAP markers    genetic diversity    genetic structure    

红椿(Toona ciliata)是楝科(Meliaceae)香椿属(Toona)树种，属落叶或半落叶乔木。该树种主干通直，树姿挺秀，木材纹理优美，材质呈红色，有"中国桃花心木"之称，是我国珍贵用材树种之一(程冬生等，2010)，在我国南方地区已成为重点开发利用的速生、优质用材树种(邹高顺，1994; Liu et al., 2014; 黄红兰等，2012)。红椿在我国主要分布在华南、华中、华东及西南地区，天然居群具有零星分布特点(汪洋等，2014; 邹高顺，1994)。除中国外，其天然分布范围也涉及喜马拉雅西北坡，包括印度、老挝、缅甸、巴基斯坦至澳大利亚(孔超，2012; 汪洋等，2014)。由于环境的变化、天然更新能力较差及过度采伐破坏等原因，目前红椿已成为濒危树种，被列为国家Ⅱ级重点保护野生植物，并列入《中国主要栽培珍贵树种参考名录》(文卫华等，2012; 陈丽文等，2014; Liu et al., 2012)。目前国内外对红椿的研究主要集中在生态学、生理生化、引种和繁育方面(邹高顺，1994; 吴际友等，2011; Malairajan et al., 2007; Duan et al., 2015)，对遗传多样性研究尚未系统展开，研究材料也仅局限在个别省份。作为珍稀濒危物种，研究其遗传多样性对种质资源保护和遗传育种等方面具有重要的理论和实践意义。本文利用相关序列多态性分子标记(SRAP)的对来自我国29个种源及1个澳大利亚种源的红椿种质从DNA水平上进行系统的遗传多样性分析，旨在明确不同种源红椿的遗传多样性水平及其遗传分化程度，为红椿种质资源保护和良种选育提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 试验材料

从我国自然地理分布区收集29个种源，采种范围覆盖云南、四川、贵州、广西、广东、江西、浙江、福建、湖南、湖北及安徽11个省区，基本涵盖了红椿在我国的全分布区。在各采种林分随机选取无病虫害、生长良好的植株30株左右，作为采集叶片的母树，母树间相距50 m以上。从树冠上部采集新鲜幼嫩叶片，用硅胶迅速干燥，硅胶与叶片的比例为10∶1，后置于-80 ℃低温冰箱保存，用于DNA提取。澳大利亚种源的试验材料采自华南农业大学红椿资源收集圃。供试材料信息见表 1。

表1 30 个种源红椿地理位置分布 Tab.1 Location of 30 provenances of T． ciliata used in this study
1.2 DNA 提取

采用EZNA* High-Performance DNA Mini Ki 试剂盒，取100 mg干燥叶片做样品，提取红椿基因组DNA。使用0.8%琼脂糖凝胶电泳及超微量紫外分光光度计(Thermo NanoDrop 1000)进行检测。稀释至50 ng·μL-1，样品-20 ℃下保存备用。

1.3 SRAP 扩增体系及程序

根据SRAP分子标记在各物种研究中所发表的引物序列，筛选引物(黄勇，2013; 赵秀娟等，2013; Feng et al., 2009; Youssef et al., 2011; Ren et al., 2012; Jing et al., 2013; Huang et al., 2014; Alghamdi et al., 2012; Aneja et al.，2012; Mokhtari et al., 2013)。先用8个种源的材料进行引物初筛，后选用16个样本进行复筛，最终从1 505对引物组合中选定24对扩增条带清晰稳定、多态性丰富、重复性好的引物组合，包括14个正向引物和15个反向引物(表 2)。SRAP引物由深圳华大公司合成。试验采用25 μL扩增体系，10×Buffer 2.5 μL(100 mmol·L-1 Tris-HCl，pH 8.3，500 mmol·L-1 KCl)，模板DNA 50 ng，10 μmol·L-1上下游引物浓度各0.75 μL，Taq DNA聚合酶(TaKaRa)2 U，2.5 μL 25 mmol·L-1 MgCl2，2 μL 2.5 mmol·L-1 dNTP。反应程序为94 ℃ 5 min; 94 ℃ 1 min，35 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，5个循环; 94 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35个循环; 72 ℃延伸10 min; 4 ℃保存。产物在6％变性聚丙烯酰胺凝胶上进行分离，并通过银染染色检测。保鲜膜封胶，照相或制干胶保存。

表 2 红椿SRAP 分子标记引物序列 Tab.2 Primer sequences used in SRAP analysis of T． ciliata
1.4 数据分析

在100~1 500 bp之间，将具有相同迁移率的扩增片段按照0/1系统记录，即有带记为1，无带记为0，组成0/1矩阵。将SRAP谱带统计结果转换为POPGENE1.32软件适用文件，计算遗传多样性参数(Yu et al., 2014; Shen et al.，2010; 张富民等，2002)，包括多态位点百分率(percentage of polymorphic b and s，PPB)、Shannon’s 信息指数(Shannon’s information index，I)、Nei’s 基因多样性指数(Nei’s gene diversity，H)、种群间的Nei’s 遗传距离(genetic distance，D)和遗传一致度(genetic identity，I)。

采用遗传多样性信息含量(PIC)评价试验所选用的24对引物组合在评价红椿遗传多样性中的能力。PICi=2fi(1-fi)，式中:PICi 为标记i的遗传多样性信息含量，fi 为标记i出现条带的频率，1－fi 是缺失条带的频率。1对引物的PIC为各个条带的平均值(Shen et al., 2010)。

运用NTSYS-pc2.1软件按照UPGMA法根据遗传一致度(I)进行种源聚类分析(Rohlf，2000);利用GenAIEx 6.5 进行种群间遗传相关性的主坐标分析(PCoA)(Peakall et al., 2012)。

利用STRUCTURE 2.3分析红椿遗传结构(Pritchard et al., 2000)。假设群体数目(K)值为1~15，20次独立运行软件，利用估算值(ΔK)确定最终群体个数; 软件运算得出似然值L(K)，通过下列公式计算出ΔK，根据ΔK 最大的原则，选择合适的K值为最佳的群体数: \[\Delta K = \frac{{m\left[ {\left| {L\left( {K + 1} \right) - 2L\left( K \right) + L\left( {K - 1} \right)} \right|} \right]}}{{S\left[ {L\left( K \right)} \right]}}。\] 式中:m 表示取平均值(mean);S［L (K)］ 为 L(K)的标准差(Evanno et al., 2005)。

利用GenAIEx 6.5 进行分子方差分析(AMOVA)，分析种源间遗传分化。

计算中国红椿29个种源采样点的地理距离，并针对中国地区种源间的遗传距离和地理距离进行Mantel检验(Mantel，1967)，分析其是否存在地理距离隔离模式(IBD)。

2 结果与分析 2.1 红椿SRAP扩增片段多态性分析

通过初筛和复筛，从1 505对引物组合中选取电泳条带清晰、稳定性高、多态性高的引物组合24对，对全部样品进行扩增分析。共扩增出656条带，其中505条为多态性条带，占总条带数的77.10%。每条引物扩增出19~36条DNA片段，平均27条; 多态性片段14~29条，平均21条。各引物组合所扩增出的条带、多态性条带、多态位点百分率和每对引物的PIC值见表 3。由表 3可以看出，多态性最好的为引物组合Me39Em32，多态位点百分率达到94.74%; 多态性最差的为Me35Em32组合，多态位点百分率仅51.85%。引物组合Me35Em32的PIC值最高，达到0.45，其次是Me23Em22及Me27Em7，为0.44; Me31Em24，Me32Em17，Me39Em32和Me43Em19组合的PIC值也分别达到0.43。由此看出，以上引物组合可作为红椿SRAP分子标记的骨干引物，能有效揭示红椿的遗传多样性。

表 3 24 对SRAP 引物的总条带数、多态 性条带数、多态位点百分率及PIC 值 Tab.3 Total number of bands，polymorphic bands， percentage of polymorphic bands and polymorphic information content (PIC) obtained from 24 SRAP primer combinations
2.2 红椿种源内遗传多样性分析

Nei’s 基因多样性指数(H)及Shannon’s 信息指数(I)可以有效反映各种源的遗传多样性(黄勇，2013)。基于SRAP结果分析，红椿30个种源的各参数存在差异。如表 4所示，P2种源Nei’s 基因多样性指数(H)及Shannon’s 信息指数(I)分别为0.313 5和0.467 5，在30个种源中为最大值，遗传多样性最高;而P19种源的2个参数均最小，分别为0.098 6及0.157 5，遗传多样性最低。

表 4 红椿30 个种源遗传多样性参数 Tab.4 Genetic diversity parameters of 30 T． ciliata provenances
2.3 红椿种源间遗传多样性分析

红椿SRAP分子标记的多态位点百分率平均为77.10%(表 3)。种源间Nei’s 基因多样性指数为0.377 0，Shannon’s 信息指数(I)为0.556 9，这表明红椿种源具较丰富的遗传多样性。

根据红椿的遗传距离，利用UPGMA法对种源进行聚类(图 1)。结果表明，在阈值为0.72时，30个种源可以分成4大类:第Ⅰ类包括14个种源，分别是湖北、湖南、江西、福建、浙江和安徽6省的全部种源，为华东、华中区; 第Ⅱ类仅有广东乐昌1个种源; 第Ⅲ类包括云南、贵州、四川和广西4省的种源，为华南、西南区; 第Ⅳ类包括广东云浮、澳大利亚多瑞格种源。4大类遗传距离见表 5。各类Nei’s 基因多样性指数与Shannon’s 信息指数的排列都呈现为第Ⅰ类>第Ⅲ类>第Ⅳ类>第Ⅱ类。利用GenAIEx 6.5 进行种群间遗传相关性的主坐标分析(PCoA)(图 2)，结果与种源聚类结果基本保持一致。

图 1 基于遗传距离的红椿种源UPGMA 聚类 Fig.1 Phylogenetic dendrogram based on the geneticdistance by the UPGMA cluster in the 30 provenances P1 － P30 为种源编号，具体见表1。下同。P1 to P30 are the codes of provenances of T. ciliata listed in Tab. 1． The same below.

表 5 红椿4 类区组的遗传距离① Tab.5 The genetic distances among the four clusters of T． ciliata

图2 30 个种源基于主坐标分析的聚类 Fig.2 Biplot of the principal coordinate analysis of 30 T． ciliata provenances
2.4 红椿遗传结构分析

基于模型STRUCTURE运算的结果分析红椿的遗传结构，待定群体数K与估算值ΔK的关系如图 3所示。由图 3可以看出，当K=2时，ΔK出现峰值，因此，30个红椿种源可以分为2组，即中国华东、华中地区及乐昌种源为一组，西南、华南、广东云浮和澳大利亚种源为一组(图 4)。

图3 待定群体数K 与估算值ΔK 的关系 Fig.3 Relations between the number of determined group K and estimated value ΔK

图4 利用STRUCTURE 软件获得的30 个种源红椿遗传结构 Fig.4 Structure analysis of 30 T． ciliata provenances by STRUCTURE software
2.5 红椿种源的遗传分化

利用GenAIEx 6.5 对红椿种源进行AMOVA变异分析，结果表明:在红椿总的遗传变异中，79.26%的遗传分化存在于种源间，而红椿种源内的遗传变异远远小于种源间，仅占总遗传变异的20.74%(表 6)。由此可以说明，红椿的遗传变异主要来自种源间。经Mantel检测，中国地区种源呈显著地理隔离模式(IBD)(r=0.36，P<0.05)。

表 6 红椿30 个种源的AMOVA 分析① Tab.6 Analysis of molecular variance (AMOVA) of 30 T． ciliata provenances
3 结论与讨论 3.1 结论

24对SRAP引物共扩增出656条带，其中505条为多态性条带。多态性最好的为引物组合Me39Em32，多态位点百分率达到94.74%，引物组合多态位点百分率平均值为77.10%。30个红椿种源的Shannon’s 信息指数(I)变动幅度为 0.157 5~0.467 5，种源间的Shannon’s 信息指数(I)为0.556 9，红椿不同种源林分内遗传多样性水平高低不同，种源间的遗传多样性较高，遗传变异主要存在于种源间。30个红椿种源遗传结构可分为华东与华中区、西南与华南区，东西部地理趋势明显。

3.2 讨论

多态位点百分率(PPB)是衡量遗传多样性参数水平的一个重要指标。一般来说，种源PPB高，遗传多样性高，适应环境能力强;反之，遗传多样性低，适应环境能力弱，在长期进化过程中有被淘汰的可能(何小勇，2007)。红椿种源PPB较高，平均为77.10%。红椿种源内存在一定的遗传变异。在进行引物能力评估时，当PIC > 0.5时，引物贡献率较高，多态性最好，选取的引物可以最大程度地反映遗传多样性;当0.25 < PIC < 0.5或者PIC< 0.25时，则分别说明多态位点处于中等或较低水平(Wang et al.，2014; Xie et al.，2010)。本研究中24对SRAP引物组合的PIC平均值为0.41，说明SRAP分子标记的引物组合可以很好地反映引物的区分能力，能有效准确地揭示红椿不同种源的遗传多样性。

本研究利用不同分析方法对30个红椿种源进行遗传结构的分析，Nei’s 基因多样性指数、Shannon’s 信息指数及分子方差分析(AMOVA)的分析结果相似。79.26%的遗传分化存在于种源间，种源内分化仅占20.74%，表明红椿的遗传变异主要来源于种源间。因此，在红椿的育种工作中需要侧重于种源的选择，个体选择和改良同时兼顾。群体分化的主要动力来源于自然选择(李康琴，2013)，红椿的种源间分化程度高，原因可能是红椿自然分布范围较广，经纬度跨度大(孔超，2012)，经过长期的自然选择，形成了对局部环境高度适应的生存能力，并为不断积累和保存遗传多样性奠定基础。花期不同就是其中一个重要的适应能力表现。由于气温、雨水及光照的影响，靠近中国西南地区的红椿种源一般花期在3—4月，而其他地区的花期一般在5—6月，从而使花粉的扩散受到了阻碍和限制，加之地理隔离阻碍了种群间基因交流，因此遗传分化明显。此外，由于过度采伐，红椿野生资源已处于濒危状态，造成红椿分布地区生境的片段化，使各群体在空间上相对隔离，从而加剧了种群间的遗传分化。

利用STRUCTURE模型进行遗传结构分析时，将30个红椿种源分成2大部分，基本上华东、华中地区与乐昌种源为一组，西南地区、广东云浮种源与澳大利亚种源为一组，P1，P2，P14和P30为过渡种源。通过UPGMA法根据红椿的遗传距离进行聚类，本研究中红椿的30个种源被分为4大类: 第Ⅰ大类主要包括来自华中和华东地区的红椿种源，第Ⅱ类仅包括广东乐昌种源，第Ⅲ类包括的是西南和华南的种源，广东云浮种源和澳大利亚多瑞格种源组成了第Ⅳ类。在采种调查过程中得知，广东云浮的红椿是由旅居南洋的华人在19世纪带进的，根据SRAP分子标记聚类分析，云浮的种源与澳大利亚的种源聚为一类，由此推测，广东云浮红椿的原产地可能是澳大利亚或与澳大利亚红椿的来源相同。广东乐昌种源在以上2种分析中，处于遗传结构分析中的过渡种源，根据遗传距离聚类单独成为一类，并且乐昌在30个种源内遗传多样性最高，这可能是由于该种源地处广东省最北端，多丘陵、山地，处于华南与华中种源分界线处，靠近江西省的龙南，气候过渡明显，自然生存环境复杂，人为干扰较少，基因流动受多方面影响造成的。对比遗传距离(表 5)，乐昌种源与西南地区的大类相比，与华东及华中的种源较近，进一步证明了其地理位置效应的影响。遗传距离聚类与STRUCTURE分析属于2种不同的运算模式，前者在聚类中由于是根据遗传距离及遗传相似性进行划分，所以通常会受到一定程度的人为操作影响，而后者可将划分不明的群体划分到相应的群体中，表现形式更加明确(赖恭梯等，2014)。在本研究中，2种分析方法在聚类结果上基本可以保持一致。分析4大类内部的Nei’s 基因多样性指数与Shannon’s 信息指数，第Ⅰ类都为最大，其次为第Ⅲ类，最小的为第Ⅱ类。第Ⅰ类所包含的种源来自华东和华中地区，这个区域的试验材料来自保护区或国有林场，遭到人为破坏的程度较低，保持了原有的遗传多样性。乐昌种源在聚类时没有被分到大类群中，单独划分成为一类，由于种源独特，应在杂交育种中注意考虑作为亲本。当然还要根据其他参考性状，如木材质量、抗逆性等性状来考虑是否用于杂交育种的亲本材料。

遗传距离与地理距离的相关性分析表明，二者具有相关性，表明相距较近的种源间遗传相似性较高。由此可以推测，地理隔离是红椿种源间产生遗传分化的另一个很重要的原因。细分各亚类，存在交叉分类。地理相距较近的种源并没有完全被分在同一亚类，如云南的P9与P11、浙江的P24与P25，这表明红椿在大尺度上存在地理趋势，而在小分区存在随机性。

目前，部分红椿的天然分布区域内已经建立了自然保护区，为红椿的就地保护提供了条件;但是，由于红椿自身的天然更新能力较弱，加之过度采伐，使其天然分布和单株数量越来越少。为了使其能够可持续利用，必须加强对红椿的保护和管理。根据本研究的结果，红椿在中国呈现零星分布，地理隔离造成基因很难交流，种群内遗传多样性较低，现存的天然林中很多数量红椿都是以古树的形式存在的，所以应尽量保存现有的所有种群并维持其原有生存环境，减轻生境片段化的加剧。红椿种子活力维持时间短、成苗率低、天然更新能力较差，因此在对原有生境进行保护的同时，要加强人工繁殖技术研究，并注意最大限度地保护红椿的遗传多样性，特别是遗传多样性较低的种群，如本研究中的P19(湖南城步)，要尽可能地将遗传资源收集完整，并通过建立母树林、基因库和种子园形式进行异地保存。

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