林业科学  2016, Vol. 52 Issue (1): 143-149   PDF    
DOI: 10.11707/j.1001-7488.20160117
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文章信息

相昆, 徐颖, 李国田, 王晓芳, 张美勇
Xiang Kun, Xu Ying, Li Guotian, Wang Xiaofang, Zhang Meiyong
外源NO对低温胁迫下核桃幼苗活性氧代谢的影响
Effects of Exogenous Nitric Oxide on Reactive Oxygen Metabolism of Walnut Seedlings under Low Temperature Stress
林业科学, 2016, 52(1): 143-149
Scientia Silvae Sinicae, 2016, 52(1): 143-149.
DOI: 10.11707/j.1001-7488.20160117

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收稿日期：2014-10-20
修回日期：2015-11-01

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王晓芳
张美勇

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相昆, 徐颖, 李国田, 王晓芳, 张美勇. 2016. 外源NO对低温胁迫下核桃幼苗活性氧代谢的影响[J]. 林业科学, 52(1): 143-149.
Xiang Kun, Xu Ying, Li Guotian, Wang Xiaofang, Zhang Meiyong. 2016. Effects of Exogenous Nitric Oxide on Reactive Oxygen Metabolism of Walnut Seedlings under Low Temperature Stress. Scientia Silvae Sinicae, 52(1): 143-149.  DOI: 10.11707/j.1001-7488.20160117
外源NO对低温胁迫下核桃幼苗活性氧代谢的影响
相昆, 徐颖, 李国田, 王晓芳, 张美勇    
山东省果树研究所 泰安 271000
收稿日期：2014-10-20；修回日期：2015-11-01
基金项目："十二五"国家科技支撑计划项目(2013BAD14B0102);山东省果树研究所所长基金(2013KY05).
通讯作者：张美勇
摘要：【目的】 研究外源NO处理对低温胁迫下核桃幼苗活性氧代谢系统的影响，探讨其影响核桃抗寒性的可能作用机制，寻找通过施加外源NO提高果树抗逆性的新方法，为外源NO在未来核桃抗逆生产中的广泛应用提供理论基础。【方法】 以抗寒性不同的‘香玲’、‘鲁果12号’核桃品种为材料，采用人工气候室模拟低温处理与叶片喷施SNP相结合的方法，研究SNP（200μmol·L-1）对低温胁迫下核桃幼苗活性氧代谢的影响。【结果】 1）正常生长条件下，喷施SNP对核桃幼苗叶片质膜透性、叶绿素含量、超氧阴离子（O2·-）产生速率、过氧化氢（H2O2）含量、膜脂过氧化产物丙二醛（MDA）含量、脯氨酸（Pro）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性、过氧化氢酶（CAT）活性影响不大，显著提高了过氧化物酶（POD）、脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）、谷胱甘肽还原酶（GR）活性和抗坏血酸（AsA）、谷胱甘肽（GSH）含量以及AsA/DHA和GSH/GSSG比值，降低了氧化型抗坏血酸（DHA）和还原型谷胱甘肽（GSH）含量，但2个品种的各项指标变化程度不同。2）低温胁迫下，SNP处理可显著提高核桃幼苗叶片POD，SOD，CAT，APX和GR等抗氧化物酶活性，同时，提高叶绿素和Pro，AsA，DHA，GSH，GSSG含量，减少H2O2和MDA的积累，降低O2·-产生速率和细胞质膜相对透性，2个品种的变化幅度不同。【结论】 低温胁迫下，外源NO处理可增强核桃幼苗叶片抗氧化物酶活性，提高抗氧化剂含量，维持抗坏血酸-谷胱甘肽（AsA-GSH）循环系统的稳定性，降低H2O2、MDA的积累及O2·-的产生速率，从而减轻活性氧对核桃叶片的伤害，保护细胞膜结构的稳定性，增强抗寒性。
关键词： 核桃    一氧化氮    低温胁迫    活性氧代谢    
Effects of Exogenous Nitric Oxide on Reactive Oxygen Metabolism of Walnut Seedlings under Low Temperature Stress
Xiang Kun, Xu Ying, Li Guotian, Wang Xiaofang, Zhang Meiyong    
Shandong Institute of Pomology Tai'an 271000
Abstract: [Objective] Effects of exogenous nitric oxide(NO) on the active oxygen metabolism system of walnut seedlings under low temperature stress were studied, in order to investigate the possible mechanism of exogenous NO on the cold resistance of walnut.This study aimed at developing a new method for improving the resistance of fruit trees by applying exogenous NO and providing a theoretical basis for the wide application of NO on walnut in the future. [Method] The effects of sodium nitroprusside (SNP with 200 μmol·L-1), a NO donor, on the active oxygen metabolism of walnut varieties ‘Xiangling’ and ‘Luguo No. 12’,seedlings with different cold resistance were studied in a artificial climate chamber. The seedling were subjected to low temperature treatments and the leaves were sprayed with SNP. [Result] 1) Under normal growth conditions, the effects of spraying SNP on the membrane permeability, chlorophyll content, production rate of superoxide anion radical(O2·-), H2O2, MDA and Pro content, and SOD and CAT activity in walnut leaves were not obvious. POD, DHAR, APX and GR activity, AsA and GSH content, GSH/GSSG and AsA/DHA ratio were significantly increased, while DHA and GSH content were reduced. The variation ranges of the two walnut varieties were different.2) Under low temperature stress, SNP treatment significantly increased the activity of POD, CAT, SOD, APX and GR, increased the content of chlorophyll, Pro, AsA, DHA, GSH and GSSG, and decreased the accumulation of MDA and H2O2, production rate of superoxide anion radical(O2·-) and relative permeability of plasma membrane. The variation ranges of the two walnut varieties were different. [Conclusion] Under low temperature stress, exogenous NO treatment could maintain the stability of AsA-GSH circulation system, decrease the accumulation of MDA and H2O2, production rate of superoxide anion radical(O2·-) and protect the stability of cell membrane structure by promoting antioxidant enzyme activity and antioxidant content, and there by reduce the damage of the active oxygen to the walnut leaf and enhance the cold resistance.
Key words: walnut    nitric oxide(NO)    low temperature stress    active oxygen metabolism    

植物在低温胁迫下生理功能会发生显著变化，如细胞结构(倪郁等，2014)、膜脂过氧化(岳海等，2010; 刘慧英等，2003)、细胞膜透性(刘慧英等，2003; 邓化冰等，2011)、 渗透调节物质(可溶性糖、可溶性蛋白和游离脯氨酸)(邓化冰等，2011; 许楠等，2009)及保护酶活性(SOD、CAT和POD等)(李轶冰等，2009)等的变化。一氧化氮(nitric oxide，NO)是植物体内一种重要的氧化还原信号分子，属于活性氮。近年来，NO与环境胁迫条件下植物抗性的关系受到研究者的广泛关注。研究发现，0.1 mmol ·L-1 SNP处理能显著提高小麦(Triticum aestivum)幼苗的SOD和CAT活性，降低由NaCl处理引起的小麦叶片氧化损伤(Singh et al.，2008); 适宜浓度的外源NO能够通过提高平邑甜茶(Malus hupehensis)体内的SOD，POD，CAT，APX活性和AsA含量，有效缓解20%PEG渗透胁迫对其造成的过氧化伤害(曹慧等，2015); SNP处理可以进一步提高Cu胁迫下番茄(Solanum lycopersicum)体内γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-ECS)、谷胱甘肽合成酶(GS)活性，促进GSH，PCs的合成，增强清除过氧化物的能力，并螯合过多的Cu2+，降低其生物毒性(王建等，2014); 外源NO供体SNP可以通过保护蝴蝶兰(Phalaenopsis spp.)幼苗的细胞膜系统、增加渗透调节物质含量、提高保护酶活性来减轻低温胁迫对蝴蝶兰幼苗的伤害，提高其抗低温胁迫的能力(牟雪姣等，2015); NO可提高黑暗诱导的拟南芥(Arabidopsis thaliana)叶片衰老过程中叶绿体和类囊体膜结构的稳定性，并抑制叶绿素降解(Liu et al., 2013); 低浓度外源NO能够有效缓解镉胁迫对长春花(Catharanthus roseus)产生的毒害作用(刘柿良等，2014)。目前有关外源NO提高植物抗逆性的研究，主要集中在水分胁迫、盐胁迫和金属离子胁迫等方面，研究对象也主要为小麦、玉米(Zea mays)等草本植物，外源NO对低温胁迫下核桃(Juglans regia)幼苗活性氧代谢机制影响的研究鲜见报道。

核桃是喜温树种，为我国重要木本粮油战略树种之一，是丘陵山区农民的重要经济来源。但是在北方，核桃产区易遭受冻害和早春晚霜危害，核桃产量降低，同时也影响核桃幼树期的整形修剪，制约了核桃产业的健康、快速、可持续发展。因此，研究核桃对低温的响应机制以及开展抗寒新品种选育，对于保障核桃安全越冬、预防"倒春寒"都具有重要意义。鉴于此，本研究针对核桃生产实践中存在的低温逆境胁迫问题，在前期研究基础上，以抗寒性不同的'香玲’和'鲁果12号’核桃品种为试材(相昆等，2011)，研究外源NO处理对低温胁迫下核桃幼苗活性氧代谢系统的影响，探讨对核桃抗寒性的可能作用机制，以期找到通过施加外源NO提高果树抗逆性的新方法，为外源NO在未来核桃抗逆生产中的广泛应用提供理论基础。

1 材料与方法 1.1 试验材料与处理

供试核桃品种为'香玲’和'鲁果12号’，砧木为实生核桃苗。试验在山东农业大学重点实验室进行。2013年3月中旬，将2个核桃品种试材移栽到盆中，每盆栽植1株，正常管理。2014年5月，选取生长一致的2个品种盆栽苗，分成4组，每组5株，移至人工气候室(昼/夜温度为25 ℃)。先预培养15天，然后2组喷蒸馏水、2组喷SNP，再用薄膜覆盖整个植株，保湿1 h，连续喷3天，每天1次。

在预试验基础上，筛选出SNP 的最适处理浓度为200 μmol ·L-1。试验设4个处理:1)正常生长条件+喷蒸馏水作为对照(Control)，昼/夜温度均为25 ℃; 2)低温处理+喷施蒸馏水(Cold)，昼/夜温度为8 ℃; 3)正常生长条件+喷施200 μmol ·L-1 SNP(SNP); 4)低温处理+喷施200 μmol ·L-1SNP(Cold+SNP)。连续处理3天后，采取幼苗每枝条的第3片叶片测定各项生理指标，每处理3次重复。

1.2 测定指标及方法

质膜相对透性测定参照张宪政等(1994)方法; O2·-产生速率测定采用羟胺氧化法(王爱国等，1990); H2O2，MDA含量测定参照Kramer等(1991)方法; SOD活性测定采用氯化硝基四氮唑蓝(NBT)光化还原法(Beauchamp et al., 1971); CAT活性测定参照Cakmak等(1992)方法; APX和GR酶活性测定参照Pinheiro等(2004)方法; DHAR活性测定参照Nakano等(1981)方法; POD活性测定参照张志良等(2009)方法; AsA含量测定参照Law等(1983)方法; GSH和GSSG含量测定参照Anderson等(1992)方法; 脯氨酸测定采用茚三酮比色法(Bates et al., 1973); 酶提取液中可溶性蛋白含量测定采用(Bradford，1976)。

1.3 数据处理

采用Microsoft Excel软件进行数据统计，通过DPS进行差异显著性分析。表中数值为平均值±标准差(mead±SD)。

2 结果与分析 2.1 外源NO对低温胁迫下核桃幼苗叶片叶绿素含量的影响

低温胁迫处理降低了核桃幼苗叶片Chla，Chlb，Chl(a+b)和Chla/b含量; SNP处理显著提高了低温胁迫下核桃幼苗叶片Chla，Chlb，Chl(a+b)和Chla/b含量(P＜0.05)。由此可见，喷施 SNP处理可减缓低温胁迫下核桃幼苗叶片叶绿素含量的降低，保护光合色素免受胁迫的伤害，有利于维持光合作用，促进幼苗生长;正常生长条件下，SNP处理对叶绿素含量无显著影响(表 1)。

表1 SNP对低温胁迫下核桃幼苗叶片叶绿素含量的影响① Tab. 1 Effect of SNP on chlorophyll contents in walnut seedlings leaves under low temperature stress
2.2 外源NO对低温胁迫下核桃幼苗叶片质膜相对透性的影响

低温胁迫下2个核桃品种幼苗叶片的相对电导率均上升，与正常生长条件差异显著(P＜0.05)。SNP 处理能够缓解低温胁迫对细胞膜的伤害作用。正常生长条件下，SNP处理对质膜相对透性的缓解作用不明显(图 1)。

图1 SNP对低温胁迫下核桃幼苗叶片相对电导率的影响 Fig.1 Effect of SNP on relative electrical conductivity in walnut seedlings leaves under low temperature stress
2.3 外源NO对低温胁迫下核桃幼苗叶片活性氧水平及MDA含量的影响

由表 2可知，正常生长条件下，SNP处理对核桃幼苗叶片的O2·-产生速率、H2O2及MDA含量均无明显影响。低温胁迫处理后，2个核桃品种叶片的O2·-产生速率、H2O2及MDA含量分别较对照提高了102.9％，211.2％，82.6％和68.4％，274.0％，52.1％; SNP处理显著降低了O2·-产生速率和H2O2含量，抑制了膜脂过氧化产物MDA含量的积累，从而缓解了低温胁迫对核桃幼苗叶片细胞膜的伤害。

表2 SNP对低温胁迫下核桃叶片O2·-产生速率及H2O2、MDA含量的影响 Tab. 2 Effect of SNP on O2·- producing rate and contents of H2O2，MDA in walnut leaves under low temperature stress
2.4 外源NO对低温胁迫下核桃幼苗叶片抗氧化物酶的影响

低温胁迫下，核桃幼苗叶片SOD和GR活性升高，POD，APX和DHAR活性下降，CAT活性变化在2个品种中表现不一致，'香玲’叶片CAT活性下降，'鲁果12号’叶片CAT活性上升; SNP处理显著提高了SOD，POD，CAT，APX，DHAR和GR活性。 正常生长条件下，SNP处理可显著提高POD，APX，DHAR和GR活性，而对SOD和CAT活性无显著影响(表 3)。

表3 SNP对低温胁迫下核桃叶片SOD，POD，CAT，APX，DHAR和GR活性的影响 Tab. 3 Effect of SNP on activities of SOD，POD，CAT，APX，DHAR and GR in walnut leaves under low temperature stress
2.5 外源NO对低温胁迫下核桃幼苗叶片抗坏血酸循环的影响

与对照相比，正常生长条件下，SNP处理显著提高了核桃幼苗叶片AsA含量及AsA/DHA比值，降低了DHA含量。低温胁迫下，AsA含量下降，DHA含量升高，AsA/DHA降低，SNP处理后，2个品种的AsA、DHA含量及AsA/DHA分别提高了58.7％，10.4％，30.8％和52.6％，13.3％，34.6％，达显著水平(图 2)。

图2 SNP对低温胁迫下核桃幼苗叶片抗坏血酸循环的影响 Fig.2 Effect of SNP on ascorbic acid cycle in walnut seedlmgs leaves under low temperature stress
2.6 外源NO对低温胁迫下核桃幼苗叶片谷胱甘肽循环的影响

与对照相比，正常生长条件下，SNP处理的核桃叶片GSH含量及GSH/GSSG显著增加。低温胁迫下，GSH含量下降，GSSG含量升高，GSH/GSSG降低，SNP处理后，2个品种的GSH、GSSG含量及GSH/GSSG分别提高了39.8％，3.6％，40.2％和55.6％，7.0％，39.8％，达显著水平(图 3)。

图3 SNP对低温胁迫下核桃叶片谷胱甘肽循环的影响 Fig.3 Effect of SNP on glutathione cycle in walnut leaves under low temperature stress
2.7 外源NO对低温胁迫下核桃幼苗叶片脯氨酸含量的影响

低温胁迫下，2个品种核桃幼苗叶片的Pro含量显著高于对照; SNP处理促进了Pro的积累，表明外源NO处理对低温胁迫下核桃幼苗叶片游离Pro积累量的增加具有促进作用;正常生长条件下，喷施SNP对Pro含量无明显影响(图 4)。

图4 SNP对低温胁迫下核桃叶片脯氨酸含量的影响 Fig.4 Effect of SNP on contents of Pro in walnut leaves under low temperature stress
3 结论与讨论

一般认为，冷害胁迫可改变植物叶绿体类囊体膜的膜质组分和膜蛋白，破坏类囊体内膜的超微结构，引起膜质过氧化，进一步影响光能的吸收和传递，引起光合速率下降(许楠等，2009)。本研究发现，低温胁迫降低了核桃幼苗叶片色素含量，但外源NO处理可维持色素含量在较高水平，参与调节植物的光合作用，缓解低温胁迫对核桃幼苗叶片光合作用的破坏。同时，NO是具有强氧化性的活性氮，可作为抗氧化剂直接与O2·-反应，清除活性氧(Laspina et al., 2005)。本研究的低温胁迫下，细胞自身的活性氧清除系统遭受破坏，不能清除过量的活性氧，O2·-和H2O2含量升高，加速了MDA的积累; 外源NO处理降低了核桃幼苗叶片的活性氧水平，减少了膜脂过氧化产物MDA的积累，降低了与膜结合的酶的结构改变，保护膜结构免遭破坏，提高了核桃幼苗抗低温能力，维持了植物细胞内的正常代谢。

SOD，POD，CAT，APX，DHAR和GR 等抗氧化酶构成植物体内主要的活性氧清除系统(杨美森等，2012; 李凯龙等，2013)。本研究的低温胁迫下，SOD和GR活性升高，POD，DHAR和APX活性下降，而'香玲’的CAT活性下降，'鲁果12号’的CAT活性升高。虽然SOD，GR活性有一定的提高，但POD，DHAR和APX活性下降，细胞内活性氧自由基的产生与清除之间失衡，体内H2O2含量和O2·-产生速率显著上升，细胞自身清除活性氧自由基的能力降低，导致ROS积累，活性氧代谢严重失衡，加速了膜脂过氧化作用，致使机体受到伤害。'香玲’CAT活性下降而'鲁果12号’CAT活性升高，可能是因为'鲁果12号’更抗寒的原因，与笔者前期研究结果一致(相昆等，2011)。

大量研究表明，低浓度NO不仅可作为抗氧化剂迅速清除活性氧，而且能诱导抗氧化酶基因的表达，提高酶活性(杨美森等，2012; Uchida et al., 2002)。本研究中，SNP处理显著提高了低温胁迫下核桃幼苗叶片SOD活性，有利于促进O2·-歧化生成H2O2，而H2O2主要通过POD，CAT和APX得以清除。本研究结果亦表明，正常生长条件下，外源NO处理提高了APX和POD活性，抑制了低温胁迫对APX，POD和CAT活性的破坏作用，维持SOD，POD，CAT，APX，DHAR和GR等抗氧化物酶活性在较高水平，减轻了活性氧自由基的破坏作用。 AsA和GSH是植物细胞内主要的抗氧化剂，可直接与活性氧反应，生成氧化态的DHA和GSSG，DHA和GSSG再在DHAR和GR的还原作用下生成AsA和GSH(李秀等，2014)。但是，低温胁迫使核桃幼苗叶片细胞活性氧自由基的产生与清除系统遭受破坏，活性氧积累导致叶绿体膜结构损伤，破坏AsA-GSH循环系统，阻碍AsA和GSH的再生。外源NO处理可维持低温胁迫下核桃幼苗叶片的AsA-GSH循环，提高循环中GR，DHAR酶活性，增强抗氧化物酶活性，促进抗氧化剂AsA和GSH的再生，提高其还原态/氧化态比例，降低O2·-产生速率和H2O2含量，抑制膜脂过氧化产物MDA的积累，缓解低温胁迫对核桃幼苗细胞膜的伤害，从而维护细胞结构的稳定性。

脯氨酸不仅可以作为生物体内有效的渗透调节物质，而且在消除ROS、提高抗氧化能力、稳定大分子结构、降低细胞酸性以及解除氨毒等方面也具有重要作用(Hayat et al.，2012; Szabados et al., 2010)。研究表明，植物抗逆性与Pro含量呈正相关(Hayat et al., 2012)。杨美森等(2012)研究发现，外源NO处理能够提高冷害胁迫下棉花(Gossypium hirsutum)幼苗植株体内Pro含量，保护细胞结构的完整性; 马金虎等(2015)研究发现，外源NO可提高玉米种胚中Pro含量。与其他植物相同，本研究中，外源NO可显著提高低温胁迫下核桃幼苗叶片Pro含量，参与渗透调节，维持细胞正常代谢，使植物具有一定抗寒性。

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