林业科学  2015, Vol. 51 Issue (9): 35-41   PDF    
DOI: 10.11707/j.1001-7488.20150905
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文章信息

李丹, 黄绢, 张伟溪, 丁昌俊, 苏晓华, 黄秦军
Li Dan, Huang Juan, Zhang Weixi, Ding Changjun, Su Xiaohua, Huang Qinjun
盐胁迫条件下转多基因库安托杨根尖离子流变化
Ion Fluxes of Multiple Transgenic Populus×euramericana‘Guariento’ under Salt Stress
林业科学, 2015, 51(9): 35-41
Scientia Silvae Sinicae, 2015, 51(9): 35-41.
DOI: 10.11707/j.1001-7488.20150905

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收稿日期:2015-02-02
修回日期:2015-03-20

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李丹
黄绢
张伟溪
丁昌俊
苏晓华
黄秦军

盐胁迫条件下转多基因库安托杨根尖离子流变化
李丹, 黄绢, 张伟溪, 丁昌俊, 苏晓华, 黄秦军     
林木遗传育种国家重点实验室 国家林业局林木培育重点实验室 中国林业科学研究院林业研究所 北京 100091
摘要【目的】细胞质内K+/Na+平衡对细胞的代谢起重要作用,同时也被认为是植物抵御盐胁迫的重要部分。【方法】以转多基因库安托杨株系D5-21、D5-20及非转基因受体D5-0为材料,研究100 mmol ·L-1 NaCl处理的不同时期(7,15,30天)各杨树株系的株高、根部干物质量、根尖离子流(Na+、K+、H+)的动态变化(利用非损伤微测技术)。【结果】生长数据表明:与正常供水条件相比,7天盐胁迫处理后,3个株系的株高降低,但不显著;15天处理后,D5-20,D5-0株高显著降低;30天处理后,3个株系株高和根部干物质量均显著降低,D5-0,D5-21的根干物质量只有正常供水条件下的一半,说明盐胁迫严重抑制杨树根的生长;但表型变化表明盐胁迫下D5-21,D5-20植株的受害程度更小,并且株高和根部干物质量均高于D5-0。Na+流测定结果表明:7天盐胁迫处理后,各株系根尖的Na+流虽与对照相比有显著变化,但变化幅度均较小;15天盐胁迫处理后,D5-21,D5-20根尖Na+外排能力均是D5-0的1.8倍;30天处理后,D5-21,D5-20根尖Na+外排能力均是D5-0的1.6倍。K+流测定结果表明:D5-0,D5-21根尖K+外流流速随着胁迫时间延长而增大,D5-20则是先增大后减小,但3个株系变化趋势差异较大,30天处理时,D5-0的流速已是D5-21,D5-20的1.7倍和2.1倍。H+流测定结果表明:虽然与D5-21,D5-20一样,D5-0的H+内流值随着胁迫时间延长而增大,但D5-21,D5-20的增幅明显大于D5-0,30天处理时,二者的H+流速是D5-0的1.6倍和1.2倍。因此,不论是短期(7天)、中期(15天)还是长期(30天)盐胁迫处理,与非转基因株系相比,转基因株系D5-21,D5-20都具有更强的Na+外排和H+内流能力,且K+的外流幅度远低于D5-0,说明转基因株系可通过将根尖细胞质中过多的Na+主动外排、并减少根尖细胞中K+的损失,维持胞质中的适宜的K+/Na+,转基因株系的耐盐性提高,从而有利于转基因株系的生长积累,这将为转基因林木的耐盐性筛选提供新的参考依据。【结论】 JERF36基因属于ERF类转录因子,它可激活植物中下游抗逆相关基因的表达,与植物的抗逆性密切相关,因此未来可研究盐胁迫下转多基因库安托杨中JERF36基因与Na+,K+,H+这3种重要离子的转运所涉及的相关基因表达的关系。
关键词库安托杨    JERF36    离子流    耐盐性    
Ion Fluxes of Multiple Transgenic Populus×euramericana‘Guariento’ under Salt Stress
Li Dan, Huang Juan, Zhang Weixi, Ding Changjun, Su Xiaohua, Huang Qinjun     
State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Key Laboratory of Tree Breeding and Cultivation of State Forestry Administration, Research Institute of Forestry Chinese Academy of Forestry Beijing 100091
Abstract: [Objective] Intracellular K +/Na + homeostasis is crucial for cell metabolism and is considered to be a key component of salinity tolerance in plants. [Method] The plant height,dry biomass of roots and net fluxes of Na+,K+,H+ from apex roots(using non-invasive micro-test technology) were investigated in the multiple transgenic Populus×euramericana ‘Guariento’(named D5-21,D5-20)and non-transgenic species(named D5-0)under 100 mmol·L-1 NaCl stress at three different period. [Result] Growth data indicated that: compared with control, all of the three lines had a lower height after 7 days of salt stress treatment, but no significant declined; But after 15 days treatment, the plant height of D5-20, D5-0 was declined significantly;when the treatment extended to 30 days, the height of three poplar lines and their amount of dry matter in root were significantly reduced, the D5-0 and D5-21 remained only 50% of dry matter compare with normal water supply conditions, these data showed that salt stress inhibited the growth of poplar roots seriously; meanwhile, the phenotypic changes showed that, compare to D5-0, D5-21,D5-20 were under lower danger level, had higher height and more dry matter in root after treatment. Na+ fluxes results showed that: there is a significant change of each line roots' Na+ fluxes after 7 days of stress treatment, but the magnitude is too small; D5-21,D5-20 roots' Na+ extruding capacity is 1.8 times of D5-0 after 15 days of stress treatment; D5-21,D5-20 roots' Na+ extruding capacity is 1.6 times of D5-0 after 30 days of stress treatment.K+ fluxes results showed that as stress time continues, D5-0, D5-21 roots' K+ effluxing increased,D5-20 is then decreased,but the trends are quite different, D5-0 roots' K+ effluxing capacity is 1.7 times of D5-21 and 2.1times of D5-20 after 30 days of stress treatment. H+ fluxes results showed: as stress time continues,all the three lines roots' H+ influxing increased, but the increasing of D5-21、D5-20 is significantly greater than D5-0; D5-21,D5-20 roots' H+ influxing capacity is 1.6 times and 1.2 times of D5-0 after 30 days of stress treatment.So, whether it is short-term (7 days), medium-term (15 days) or long term (30 days) salt stress treatment,transgenic lines D5-21, D5-20 exhibited a higher capacity to extrude Na+ ,meanwhile,the influx of H+ had a significant increasing, and a less reduction of K+ versus D5-0, Thus, the transgenic poplar species can avoid excessive cytoplasmic Na+ accumulation by extruding Na+ ,and decreased the K+ leakage from cytoplasmic,and these two measuremtnts are helpful to maintain K+/Na+ homeostasis. Therefore, transgenic poplar species implied an increased salt tolerance and growth accumulation,this will provide a new evidence for salt tolerance screening of transgenic trees. [Conclusion] JERF36 gene is a ERF transcription factor that can activates the expression of downstream stress resistance genes, and is closely related with plants resistance.So the relationship between JERF36 gene and the gene expression involving in the transport of Na +, H +, K + ions deserves to take a further study.
Key words: Populus×euramericana 'Guariento'    JERF36    ion fluxes    salt tolerance    

盐胁迫是限制全世界农林业生产和生态环境建设的一个重要因素,如何提高植物在盐碱地的生产力已经成为农林业生产中急需解决的问题,因此培育耐盐的林木新品种具有重要意义。相对于常规育种途径,基因工程育种不仅缩短了育种周期,更能在基因水平上改造林木抗性遗传物质,提高育种的目的性和可操作性(苏晓华等,2003)。盐胁迫下Na+会在植物细胞中大量积累,造成植物器官和细胞中水分亏缺、各种酶活性受影响,从而使细胞代谢活动减弱并扰乱细胞内的离子平衡;同时由于Na+会竞争K+的转运吸收位点,造成植物难以吸收K+,因此维持植物胞质内的高K+低Na+平衡对提高植物的耐盐性至关重要(Zhu 2003Hasegawa et al.,2000Chen et al.,2007吴运荣,2014)。

库安托杨(Populus×euramericana ‘Guariento’)是1984年从意大利年引进的速生欧美杨,已在我国华北地区表现出良好的前景,但在生产上面临蛀干害虫天牛的危害、干旱胁迫及盐碱等主要问题。2001年中国林业科学研究院林业研究所把SacB,JERF36,vgb以及BtCry3A+OC-I双价基因转入库安托杨。经分子生物学检测、温室盐胁迫和大田试验的结果表明,目的基因插入并稳定表达,转多基因库安托杨具有更强的耐盐性(纪丽丽,2004王建革,2006侯英杰,2008李环,2008;李义良,2007;Li et al.,2008Su et al.,2011)。JERF36属于ERF(ethylene resopnsive factor,乙烯反应因子)类转录因子,它通过激活植物中下游与抗逆境相关基因的表达,来提高转基因植物的抗逆性。关于JERF36基因导入后如何提高转基因杨树的耐盐性相关研究还未见报道。因此,本研究将利用非损伤微测系统(non-invasive micro-test technology,NMT)研究盐胁迫下转基因库安托多抗杨株系和非转基因株系间的根尖的Na+,K+和H+离子流动力学,检测JERF36基因通过调控下游相关基因的表达,改变Na+,K+和H+等离子的吸收和转运平衡,以揭示根尖离子流变化与转基因杨树耐盐性的关系及生理机制,为转基因杨树的推广应用提供更加科学、合理的参考,并为转基因林木的耐盐性筛选提供新的参考依据。

1 材料与方法 1.1 试验材料

以前期获得的转基因株系D5-21,D5-20和未转化株系D5-0试试验材料。扦插穗条来自于1年生扦插苗,长15 cm,直径1.3~1.5 cm。2014年3月15日将穗条扦插于温室塑料小盆中(10 cm×10 cm),基质为草炭土和珍珠岩,每盆1株,每株系50盆,在正常供水条件下培养。2014年4月21日将生长状况良好且一致的植株移栽至塑料大盆中,盆高19 cm,直径17 cm,基质由沙土、草炭土、珍珠岩以6 :10 :1比例混合配制,每盆1.8 kg,正常供水。

处理试验在中国林业科学研究院现代化温室内进行,6—9月份平均温度控制在25~30 ℃,平均相对湿度为55%。

1.2 盐处理方法

待苗高达到40 cm左右时,每个株系各选择18株大小一致的苗木采用100 mmol ·L-1 NaCl盐溶液处理,每次浇灌200 mL NaCl盐溶液,2天浇灌1次,对照组浇灌与胁迫组等体积的水。处理每株系3次重复,在盐处理第7,15和30天分别取样。在盐处理开始之前和结束后对转基因株系和对照植株的表型变化、高生长和根干质量进行观察并测量记录。根干质量测定方法为:胁迫试验结束后各株系选取苗木3株,拔出,洗净根,放入烘箱105 ℃杀青15 min,然后75 ℃烘至恒质量,用电子天平称量。

1.3 离子流测定方法

Na+,K+,H+ 离子流的测定采用美国扬格公司的非损伤微测系统。Na+的测试液成分为:0.1 mmol ·L-1 CaCl2,0.5 mmol ·L-1 KCl,1.0 mmol ·L-1 NaCl,0.3 mmol ·L-1 MES,pH6.0;K+和H+的测试液成分为0.1 mmol ·L-1 CaCl2,0.5 mmol ·L-1 KCl,0.3 mmol ·L-1 MES,pH6.0。

在盐处理的第7,15,30天从杨树根中切取约20 mm的新鲜幼嫩根段,每处理取3个样株,每株取2~3个根段,用蒸馏水冲洗干净并在测试液中平衡25~30 min,平衡之后将根段浸于10 mL新鲜测试液中,并固定于培养皿(直径为35 mm)底部,用相应的离子选择微电极沿着根轴测量根尖(距根顶端600~1 800 μm,每600 μm作为1个测量点,共3个测量点)区域的离子流变化,,每个测量点实时记录离子流时间为5 min,直至获得稳定的离子流速。采样规则为X-30,电极运动的频率为0.15 Hz。

离子流速根据旭月科技有限公司开发的Mageflux软件进行计算。计算出的值为负值表示离子内流,正值表示离子外排。

2 结果与分析 2.1 盐胁迫条件下植株的生长及根干质量分析

盐处理的第7,15,30天观察并测定了3个株系的生长情况。正常供水条件下3个株系生长正常,外部形态无明显差异,D5-21,D5-20的株高高于D5-0(表 1)(30天时D5-21株高值例外)。盐胁迫15天处理后,D5-20,D5-0株高显著降低,30天处理后,3个株系的株高和根干质量均显著降低,D5-0和D5-21的根干质量只有正常供水条件下的一半干质量,说明盐胁迫严重抑制了杨树根的生长;表型变化表明D5-21和D5-20植株受害程度均小于D5-0,D5-21,D5-20的株高和根干质量均高于D5-0。

表 1 盐胁迫处理的不同时期各株系的株高和根干质量 Tab.1 The height and root dry biomass of the 3 poplar lines at different salt stress period
2.2 盐胁迫条件下Na+流的变化

Na+的流速测定显示(图 1),正常供水条件下,在3个时间点上3个株系根尖测定区域Na+流速比较平稳,流速值较低,均低于50 pmol ·cm-2 s-1。7天流速测定结果表明,D5-21,D5-20均呈现微量内流趋势,D5-0呈现微量外流趋势;15天和30天测定结果表明,D5-21,D5-20均呈微量外流,流速值略微有所增加,D5-0继续保持微量外流。

图 1 盐胁迫对杨树根尖Na+流的影响 Fig.1 Effection of salt on net Na+fluxes in apex roots of transgenic and non-transgenic lines D5-0为非转基因植株,D5-21,D5-20为转多基因植株;正值表示外排,负值表示内流;*表示与对照相比显著性差异P < 0.05;图中每个值代表根尖3个测量点(600,1 200,1 800 μm)离子流速的均值。下同
D5-0:Non-transgenic plant,D5-21,D5-20:Transgenic plants;Positive value indicates efflux,negative value indicates influx;*:Significant difference from control,P<0.05;Every value represents the mean fluxes of the 3 measuring sites in apex roots.The same as below.

盐胁迫处理后,3个株系的Na+的流速变化剧烈,显著性检验结果表明7,15,30天处理使D5-21,D5-20,D5-0(7天除外)根尖Na+的外流流速显著增大。7天处理后,D5-21(141.91 pmol ·cm-2 s-1)和D5-20(121.23 pmol ·cm-2s-1)根尖Na+由轻微内流变为显著外流,D5-0根尖Na+外流趋势增大(102.87 pmol ·cm-2 s-1)。与7天处理相比,15天处理后D5-21(354.14 pmol ·cm-2 s-1),D5-20(346.89 pmol ·cm-2s-1)和D5-0(188.79 pmol ·cm-2 s-1)的根尖Na+外流流速进一步增大,D5-21的Na+外流外流流速增加约1.5倍,D5-20的外流流速增加约2倍,远大于D5-0的外流流速增加量。长期盐胁迫后(30天),与15天处理相比,D5-21,D5-20的Na+外流流速无明显变化,维持在较稳定的水平,而D5-0的Na+外流流速略微有所增加,但其值依然远小于D5-21,D5-20的外流流速值。

2.3 盐胁迫条件下K+流的变化

K+的流速测定显示(图 2):正常供水条件下,3个株系K+均呈现微量外流趋势,在3个处理时间点上其流速值无明显变化,且流速相对较低。3个株系在7天时的流速值略微高于15天和30天的流速值。

图 2 盐胁迫对杨树根尖K+流的影响 Fig.2 Effection of salt on net K+fluxes in apex roots of transgenic and non-transgenic lines

盐胁迫处理后,3个株系根尖K+外流流速变化明显,显著性检验结果表明,7,15,30天处理使D5-21,D5-20(7天除外)、D5-0根尖K+的外流流速显著增大。7天处理后D5-0,D5-21根尖K+外流流速显著增大,D5-20增加不显著,但3个株系外流流速值较低,均低于100 pmol ·cm-2 s-1。随着盐胁迫时间的延长,D5-0的外流流速均增大,15天处理时,其值为317.15 pmol ·cm-2 s-1,30天处理后,其外流流速已达到525.58 pmol ·cm-2 s-1。 与D5-0类似,D5-21根尖K+外流流速也随着盐胁迫时间的延长而增加,15天处理时,其值为250.64 pmol ·cm-2 s-1,30天处理后,其外流流速达到311.74 pmol ·cm-2 s-1。D5-20根尖K+外流流速随着胁迫时间的延长先增加后降低,15天处理后流速值达到最大(272.55 pmol ·cm-2 s-1),30天处理后下将至252.77 pmol ·cm-2 s-1。从以上分析结果看,盐胁迫下D5-21,D5-20远小于D5-0的根尖K+外流流速。

2.4 盐胁迫条件下H+流的变化

H+的流速测定显示(图 3):正常供水条件下,3个株系在3个时间点上根尖H+均呈现外流趋势。D5-0的根尖区域H+外流流速随着时间点的延长而增大,且增加较显著;D5-20在30天测定时流速值增加较显著,D5-21在3个时间点上流速值较稳定,变化不显著。

图 3 盐胁迫对杨树根尖H+流的影响 Fig.3 Effection of salt on net H+fluxes in apex roots of transgenic and non-transgenic lines

盐胁迫处理后,3个株系根尖H+流均由外流变为内流,显著性检验结果表明这种变化差异显著,且随着盐胁迫时间的延长流速值增大。与7天处理相比,15天处理后D5-0根尖H+流速略有增加(由-2.16到-2.79 pmol ·cm-2 s-1),与D5-0不同,15天处理后,D5-21,D5-20根尖H+流速变化显著,已达到-10.19 pmol ·cm-2 s-1和-6.32 pmol ·cm-2 s-1,远高于D5-0的根尖H+流速。长期盐胁迫(30天)后,D5-21(-15.70 pmol ·cm-2 s-1)和D5-20(-11.97 pmol ·cm-2 s-1)的根尖H+流速幅度进一步增大,而D5-0为-9.85 pmol ·cm-2 s-1。从以上分析结果看,盐胁迫下D5-21,D5-20远大于D5-0的根尖H+内流流速。

3 结论与讨论

细胞质内K+/Na+平衡对细胞的代谢起重要作用,同时也被认为是植物抵御盐胁迫的重要部分(Hasegawa et al.,2000Zhu,2003Chen et al.,2007),Na+主动外排、Na+区隔化至液泡以及减少胞质中K+损失是植物有效维持K+/Na+平衡的重要措施。本研究测定的100 mmol ·L-1 NaCl下不同处理时期杨树根尖(600~1 800 μm,3个测量点)离子流的动态变化结果显示,随着胁迫时间延长,D5-21,D5-20根尖Na+的外流流速先显著升高而后维持在较高水平,而D5-0流速虽也有所增加,但仍较低,15天和30天处理时,D5-21,D5-20的流速均已是D5-0的1.8倍和1.6倍。K+流速分析发现:D5-0,D5-21根尖K+外流流速随着胁迫时间延长而增大,D5-20则是先增大后减小,但3个株系变化趋势差异较大,30天处理时,D5-0的流速已是D5-21,D5-20的约1.7,2.1倍。H+流速分析发现:虽然与D5-21,D5-20一样,D5-0的H+内流值随着胁迫时间延长而增大,但D5-21,D5-20的增幅明显大于D5-0,30天处理时,二者的H+流速是D5-0的1.6倍和1.2倍。因此,不论是短期(7天)、中期(15天)还是长期(30天)盐胁迫处理,与非转基因株系相比,转基因株系D5-21、D5-20都具有更强的Na+外排和H+内流能力。在胡杨的耐盐性机理研究中,也发现其具有对这2种离子更好的外排或内流调控能力,同时发现外源Ca2+有助于盐敏感的杨树品种维持K+/Na+平衡(Sun et al.,2009a2009b孙健,2011),本研究中未涉及外源Ca2+对库安托杨的K+/Na+平衡影响研究。此外研究发现NaCl胁迫也会造成大豆(glycine max)叶肉组织Na+的迅速外流,野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)根细胞H+内流增强(Shabala,2000Shabala,2005)。另外本研究中,盐胁迫条件下,D5-21,D5-20和D5-0根尖K+显著外排,但与D5-0相比,D5-21,D5-0根尖K+外流幅度更小,说明转基因株系根尖K+损失更少,这与在耐盐大麦(Hordeum vulgare)(Chen et al,2007)及小麦(Triticum asetivum)(Cuin et al.,2008)根尖K+在盐胁迫下外流的研究结果相似,但是上述大麦和小麦的K+流显著性区域均为成熟根区域(距根尖10 000 μm处),而本研究中测定的为杨树根尖区域(600~1 800 μm),关于胡杨的研究也是在其根尖区域(200~2 000 μm)K+流的变化幅度较大,而成熟区域(10 000~12 000 μm)K+流变化幅度不大(Sun et al.,2009b)。

本研究中胁迫30天处理后,虽然转基因株系的株高和根干质量高于非转基因株系,但差异不显著,这可能是由于杨树的生长周期长,对盐胁迫环境的适应是一个相对漫长的过程;另外为取根方便,采用的土壤基质透水性相对较强,盐溶液浇灌后可能有一部分损失,造成土壤中的实际含盐量更低,因此,短期内转基因和非转基因株系之间并未显现出明显的差异。

JERF36属于ERF类转录因子,该类转录因子涉及细胞发育中的信号转导、激素合成、逆境胁迫等过程,它的表达能够激活植物中下游与抗逆境相关基因的表达(Gilmour et al.,2000; 杨宇红,2007; Wang et al.,2004)。另外,大量研究表明,盐胁迫下植物中的SOS(salt overly sensitive)信号途径发挥着重要的作用,参与的基因有SOS1,SOS2,SOS3,AKT1,NHX1,HKT1等,SOS1编码质膜Na+/H+逆向转运体,主要负责盐胁迫下Na+的主动外排,SOS2-SOS3复合体可调控SOS1的表达;NHX1编码液泡膜定位的Na+/H+逆向转运体,可将Na+运入液泡,形成区隔化,降低胞质中Na+的浓度,AKT1和HKT1介导植物中K+的长距离的运输(吴运荣等,2014雷志等,2014Apse et al.,1999; Ding et al.,2010; Mahajan et al.,2008; Rus et al.,2001; Tang et al.,2010;Zhu,2002;2003)。因此下一步笔者将研究盐胁迫下转多基因库安托杨中JERF36基因与Na+,K+,H+这3种重要离子的转运所涉及的SOS途径中相关基因表达的关系,以期了解JERF36基因与下游抗逆相关基因表达的关系。

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