马尾松(Pinus massoniana)是我国亚热带荒山造林的先锋树种人工林。在全国水土流失与生态安全综合科学考察中，赵其国(2006)发现南方红壤区林下水土流失十分严重，“远看青山在，近看水土流”的现象普遍存在，而其中马尾松林是南方红壤区退化面积最大的森林类型(莫江明等，2004)。

何圣嘉等(2011)研究指出，林下植物种类(尤其是草本植物)极少，是造成马尾松林下水土流失的最主要和最直接原因。马尾松林下草本层主要是由芒萁(Dicranopteris dichotoma)、白茅(Imperata cylindrica)和狗尾草(Setaria viridis)等植物簇生而成的，其盖度在30%以下，且主要零星簇状分布在相对坑洼的区域(马志阳等，2008)。以往针对马尾松林下植被及其恢复措施的研究大多数是从植物生长规律(何友均等，2013)、土壤环境(林德喜等，2004;康冰等，2009)等方面考虑，然而植物群落结构组成及分布，不仅与植物的生物学特性和生境条件相关，而且与其化感作用存在密切联系(Bais et al.， 2006;Zhang et al.， 2014;彭少麟等，2001；马越强等，1998;陈龙池等，2002)。植物根系分泌是土壤环境中化感物质来源的最主要途径(Rovira，1969;孙婧珏等，2013)，为整个林地土壤环境提供了碳源，对土壤环境和林木生长具有重要影响。段剑等(2015)研究表明，马尾松根际土壤浸提物对狗牙根(Cynodon dactylon)、白三叶(Trifolium repens)、巴哈雀稗(Paspalum notatum)和早熟禾(Poa annua)4种南方典型水土保持草本植物具有明显的化感作用，且与枫香(Liquidambar formosana)根际土壤的化感作用类型存在显著差异。而根际土壤浸提物的化学成分鉴定是研究马尾松化感物质种类及其化感作用机制的基础性工作。

鉴于此，本研究在南方红壤侵蚀区，以马尾松和枫香为对象，对其根际土壤进行提取、分离与鉴定，探明并比较马尾松和枫香根际土壤浸提物的化学组成及含量差异，以期阐述2种林木根际土壤浸提物的化感作用机制，为进一步研究其化学生态学提供基础数据。

研究区老虎山小流域(114°52′—114°54′E，26°50′—26°51′N)位于江西省泰和县，地处吉泰盆地。地貌类型属低丘岗地，海拔80～200 m，境内丘坡平缓，坡度多在5°左右。土壤为第四纪红色黏土发育而来的红壤，厚度3～40 m。流域地处亚热带湿润季风气候区，气候温和、雨量充沛，但四季降雨不均，4—6月为雨季，占全年降水的50%。多年平均降水量1 336 mm，≥10 ℃年积温5 918 ℃，平均气温18.6 ℃，极端最高、最低气温40.4和-6 ℃，全年无霜期288天。丘陵区原有常绿阔叶林被破坏后，取而代之的是针阔叶次生林。

在研究区内选择立地条件一致的马尾松纯林和枫香—木荷(Schima superba)混交林，林分概况见表 1。分别在每种林分内随机设置3块20 m×20 m样地，在每块样地内进行每木检尺，获取样地内植株的平均地径、胸径、高度、冠幅，并以此为依据，选取3 株标准木作为研究对象。

表 1 林分概况 Tab.1 Survey of pure forest of Pinus massoniana， mixed forest of Liquidambar formosana and Schima superba

表 1 林分概况 Tab.1 Survey of pure forest of Pinus massoniana， mixed forest of Liquidambar formosana and Schima superba 项目Item 马尾松纯林Pure forest of P. massoniana 枫香—木荷混交林Mixed forest of L. formosana and S. superba 海拔Altitude /m 130 127 林分密度Stand density /(individual·hm-2) 1 500 3 000 林龄Stand age/a 13 10 郁闭度Canopy density 0.7 0.9 坡度Slope/(°) 10 8 坡向Slope aspect 西北330° Northwest 330° 西北292°Northwest 292° 前期土地利用类型Land use type before forestation 灌木林Shrubbery 灌木林Shrubbery 平均胸径Mean DBH/cm 10.8 13.4 平均树高Mean tree height/m 6.7 10 土壤密度Soil density/(g·cm-3) 1.34±0.21 1.27±0.24 土壤含水率Soil moisture content (%) 14.25±1.08 15.53±8.85 土壤pH值Soil pH 4.60±0.08 5.07±0.04 土壤有机质含量Soli organic matter content /(g·kg-1) 16.96±0.24 36.15±1.43 土壤全氮含量Soil total nitrogen content /(g·kg-1) 0.06±0.02 0.25±0.06 土壤全磷Soil total phosphorus content /(g·kg-1) 0.35±0.02 0.41±0.03 土壤全钾含量Soil total potassium content /(g·kg-1) 6.74±1.10 5.73±0.83 土壤碱解氮含量Soil available nitrogen content /(mg·kg-1) 33.85±8.55 168.61±30.36 土壤速效磷含量Soil available phosphorus content /(mg·kg-1) 0.32±0.01 2.73±0.10 土壤速效钾含量Soil available potassium content /(mg·kg-1) 12.50±1.34 10.99±1.00

以样地内马尾松和枫香单木为研究对象，于生长季节4 月17 日采集其根际土壤。具体方法为： 先去除样本下表层枯落物，沿植株的东、南、西、北4个方向，以距离植株1 m处为外边界，挖取50 cm(长)×30 cm(宽)×40 cm(高)的土壤剖面，将直径＜2 mm的细根带土取出，轻抖根系，将细根表面附着的土壤作为根际土壤，每个剖面采集50 g土样，分样地进行土样混合，2种林木共6块样地，混合后共6个混合土样。混合土样装入无菌保鲜袋，带回实验室，4 ℃下保存，供测试分析。

采用2种方法进行根际土壤浸提物的提取。方法一(乙醇浸提)： 分别取马尾松、枫香根际土壤于有盖玻璃瓶中，按1:3的体积比加入85%的乙醇，置于20 ℃磁力搅拌器中，2 600 r·min^-1浸提24 h；再置于20 ℃高速离心仪中，3 500 r·min^-1旋转15 min。离心后的上清液置于旋转蒸发仪中脱去浸提剂，首先用乙酸乙酯(1:1)萃取2 次，乙酸乙酯相为中性组分； 然后用1 mol·L^-1的HCl将水相pH调至3.0后，再用等量的乙酸乙酯萃取2 次，乙酸乙酯相为酸性组分； 接着用1 mol·L^-1的NaOH将水相pH调至8.0，再用等量的乙酸乙酯萃取2 次，乙酸乙酯相为碱性组分。合并酸、中、碱性乙酸乙酯相，即为根际土壤浸提物。方法二(乙酸乙酯浸提)： 分别取马尾松、枫香根际土壤置于有盖玻璃瓶中，按1:3的体积比加入20%乙酸乙酯，置于20 ℃磁力搅拌器中，2 600 r·min^-1浸提24 h；再置于20 ℃高速离心仪中，3 500 r·min^-1旋转15 min。离心后的上清液，即为根际土壤浸提物。

将2种浸提方法得到的马尾松、枫香根际土壤浸提物，35 ℃真空旋转蒸发仪浓缩至1 mL，无水硫酸钠脱水后，采用GC-MS Agilent-6890N/59731联用仪对浸提物进行分析，进样量为1.0 μL，不分流进样。色谱条件：色谱柱为Agilent 122-3832(30 m×0.25 mm×0.25 μm)超高惰性柱，柱温70 ℃(2 min)，以10 ℃·min^-1升温至280 ℃，保持20 min；气化室温度250 ℃；载气为高纯He(99.999%)，载气流量1.0 mL·min^-1。质谱条件：离子源为EI源；离子源温度230 ℃；四级杆温度150 ℃；电子能量70 eV；扫描范围(m/z) 35~500 amu；扫描速度0.2 s扫全程；检测器电压500 V；电流350 μA；溶剂延迟时间3.0 min。GC-MS数据应用标准质谱谱库NIST02获得，采用面积归一化法计算各组分的相对含量。

将2种浸提方法得到的根际土壤浸提物进行GC-MS分析，图 1为2种林木根际土壤浸提物的总离子流图。

	图 1 2种林木根际土壤浸提物的总离子流图 Fig. 1 Total chromatogram of extract with two solvent extractions from rhizospheric soil of two trees

马尾松根际土壤乙醇浸提物共有效命名了6 种有机物，分属于烃类、醇类、酸类和苯类，其中以酸类(2 种)相对含量最高，占总量的72.85%； 乙酸乙酯浸提物共有效命名了14 种有机物，分属于烃类、醇类、酮类、酸类、酯类、酚类和醚类，其中以酸类(3 种)相对含量最高，占总量的53.92%(表 2)。 枫香根际土壤乙醇浸提物共有效命名了8 种有机物，分属于烃类、醇类、酸类、酯类、酚类和酰胺类，其中以酸类(3 种)相对含量最高，占总量的46.18%；乙酸乙酯浸提物共有效命名了9 种有机物，分属于烃类、醇类、酮类、酸类、酚类和苯类，其中以酸类(2 种)和醇类(2 种)相对含量较高，分别占总量的37.25%和31.97%(表 2)。

表 2 2种林木根际土壤浸提物组分 Tab.2 Component of solvent extraction from rhizospheric soil of two trees

表 2 2种林木根际土壤浸提物组分 Tab.2 Component of solvent extraction from rhizospheric soil of two trees 组分Component 马尾松 P. massoniana 枫香 L. formosana 乙醇浸提物Ethanol extraction 乙酸乙酯浸提物Ethylacetate extraction 乙醇浸提物Ethanol extraction 乙酸乙酯浸提物Ethylacetate extraction 种类数Kind number 占总量百分比Percentage of total(%) 种类数Kind number 占总量百分比Percentage of total(%) 种类数Kind number 占总量百分比Percentage of total(%) 种类数Kind number 占总量百分比Percentage of total(%) 烃类 Hydrocarbons 2 14.48 3 10.41 1 4.20 2 17.98 醇类 Alcohol 1 4.69 1 2.62 1 18.50 2 31.97 酮类 Ketones 0 0 3 11.38 0 0 1 6.30 酸类 Acids 2 72.85 3 53.92 3 46.18 2 37.25 酯类 Esters 0 0 1 4.41 1 3.50 0 0 酚类 Phenols 0 0 2 8.33 1 5.33 1 2.98 苯类 Benzene 1 7.98 0 0 0 0 1 3.52 醚类Ethers 0 0 1 8.92 0 0 0 0 酰胺类Amides 0 0 0 0 1 22.28 0 0 总计 Total 6 100.00 14 100.00 8 100.00 9 100.00

马尾松根际土壤乙醇、乙酸乙酯浸提物分别检测出109和56 种有机物，二者都分属于烃类、醇类、酮类、酸类、酯类和酰胺类等，但在物质种类和数量上差异较大；从物质种类上考虑，采用乙醇浸提更为充分。乙醇、乙酸乙酯浸提物中相对含量大于2%的组分分别有6和14 种(表 3)，乙醇浸提物以酸类和烃类为主，乙酸乙酯浸提物以酸类、酮类和烃类为主。2种浸提物均检测出脱氢松香酸和硬脂酸。此外，2种浸提方法马尾松根际土壤浸提物都以脱氢松香酸的相对含量最高，分别为28.98%和20.36%。

表 3 2种林木根际土壤浸提物各化学组分的相对含量(＞2%) Tab.3 Relative content of chemical constitute with two solvent extractions from rhizospheric soil of two trees

表 3 2种林木根际土壤浸提物各化学组分的相对含量(＞2%) Tab.3 Relative content of chemical constitute with two solvent extractions from rhizospheric soil of two trees % 类别Type 化合物Compound 马尾松 P. massoniana 枫香 L. formosana 乙醇浸提物Ethanol extraction 乙酸乙酯浸提物Ethylacetate extraction 乙醇浸提物Ethanol extraction 乙酸乙酯浸提物Ethylacetate extraction 烃类Hydrocarbons 十六烷 Hexadecane — 2.63 — — 十七烷 Heptadecane — 3.41 — — 二十一烷 Heneicosane — — — 2.87 氯二十一烷 1-chloroeicosane — — 2.59 — 3，3，6，6-tetram乙基-1，4-环己二烯 1，4-cyclohexadiene， 3，3，6，6-tetram ethyl- 5.95 — — — 豆甾烷-3，5-二烯 Stigmastan-3，5-diene 2.85 — — — 7-氧杂二环[4.1.0]庚烷，2，2，6-三甲基-1-(3-甲基-1，3-丁二烯基)-5-亚甲基 7-Oxabicyclo[4.1.0]heptane， 2，2，6-trimethyl-1-(3-methyl-1，3-butadienyl)-5-methylene- — — — 9.20 长叶烯 Decahydro-4，8，8-trimethyl-9-methylene-1，4-methanoazulene — 2.13 — — 醇类 Alcohol 22，23-二氢豆甾醇22，23-dihydro-stigmasterol 2.85 — 11.41 — 叶绿醇 Phytol — — — 2.45 羽扇豆醇 Lupeol — — — 19.01 环鸦片甾烯醇 9，19-cyclolanost-25-en-3-ol， 24-methyl-，(3.beta.，24S)- — 2.06 — — 酮类 Ketones 豆甾-3， 5-二烯-7-酮 Stigmasta-3，5-dien-7-one — 2.14 — — beta-扶桑甾醇氧化物 Sitostenone — 2.38 — 4.23 26-(乙酰氧基)胆甾-4-烯-3-酮 4-cholesten-3-one， 26-(acetyloxy) — 4.41 — — 酸类 Acids 脱氢松香酸 Dehydroabietic acid 28.98 20.36 4.46 — 硬脂酸 Octadecanoic acid 15.30 12.42 21.81 14.28 顺14-十五碳烯酸 14-pentadecenoic acid — — 2.21 — 棕榈酸 n-Hexadecanoic acid — 9.54 — 10.72 酯类 Esters 1-金刚烷甲酸苯甲酯1-adamantanecarboxylic acid， benzyl ester — — 2.16 — N-乙酰基-乙酸(酯)-白雀定 Quebrachidine， N-acetyl-， acetate(ester) — 3.46 — — 酚类 Phenols 2，4-二叔丁基苯酚Phenol， 2，4-bis(1，1-dimethylethyl) — 3.92 3.29 2.00 2-(4-二乙胺-苯基亚氨基甲基)-6-乙氧基苯酚 Phenol， 2-(4-diethylaminophenyliminomethyl)-6-ethoxy- — 2.62 — — 苯类 Benzene 4，4′-双(三甲基硅基)联苯 Biphenyl， 4，4′-bis(trimethylsilyl) 4.85 — — — 丁基羟基甲苯 Butylated hydroxytoluene — — — 2.36 醚类Ethers 异香树烯氧化物 Alloaromadendrene oxide-(2) — 7.00 — — 酰胺类Amides 芥酸酰胺 13-docosenamide， (Z)- — — 13.74 —

枫香根际土壤乙醇、乙酸乙酯浸提物分别检测出96和63种有机物，采用乙醇浸提的物质种类比较丰富。乙醇、乙酸乙酯浸提物中相对含量大于2%的组分分别有8和9种，乙醇浸提物以酸类、醇类和酰胺类为主，乙酸乙酯浸提物以酸类和醇类为主。2种浸提物均检测出硬脂酸和2，4-二叔丁基苯酚。此外，枫香根际土壤乙醇、乙酸乙酯浸提物分别以硬脂酸和羽扇豆醇相对含量最高，分别为21.81%和19.01%。

乙醇浸提方法下，2种林木根际土壤浸提物均检测出脱氢松香酸、硬脂酸和22，23-二氢-豆甾醇，其中马尾松以脱氢松香酸含量最高，为28.98%，枫香以硬脂酸含量最高，为21.81%。相对枫香，马尾松根际土壤浸提物特有的物质有3，3，6，6-tetram乙基-1，4-环己二烯、 4，4′-双(三甲基硅基)联苯和豆甾烷-3，5-二烯，其中以3，3，6，6-tetram乙基-1，4-环己二烯含量最高，为5.95%。

乙酸乙酯浸提方法下，2种林木根际土壤浸提物均检测出硬脂酸、棕榈酸、2，4-二叔丁基苯酚和beta-扶桑甾醇氧化物，且含量差异不大。相对枫香，马尾松根际土壤浸提物特有的物质有脱氢松香酸、异香树烯氧化物、26-(乙酰氧基)胆甾-4-烯-3-酮、N-乙酰基-乙酸(酯)-白雀定、十七烷、十六烷、2-(4-二乙胺-苯基亚氨基甲基)-6-乙氧基苯酚、豆甾-3，5-二烯-7-酮、长叶烯、环鸦片甾烯醇，其中以脱氢松香酸相对含量最高，为20.36%。

采用根际土壤提取、分离和鉴定方法，首次对马尾松根际土壤浸提物的化学成分进行试探性研究。结果表明，乙醇浸提方法共检测出109种有机物，乙酸乙酯浸提方法共检测出56种，其中相对含量大于2%的组分分别有6和14种。2种浸提方法下，相对含量最高的都是有机酸类物质，主要包括脱氢松香酸、硬脂酸和棕榈酸，结果与曹光球等(2005)通过超临界流体萃取技术研究发现的马尾松根化感物质(α-杜松醇、θ-杜松烯、棕榈酸、叶绿醇)组成具有一定的相似性。但本研究根际土壤浸提物组分与曹光球等(2006)研究的马尾松针叶挥发物组分存在一定差异。曹光球等(2006)通过超临界流体萃取技术提取、分离马尾松针叶化感物质，纯CO₂提取的叶生化物质主要为苯甲醛和Cis-2，6-二甲基-2，6-辛二烯等，乙醇和CO₂混合提取的叶生化物质主要为β-芳樟醇和苯乙醇等。Su等(2009)发现马尾松针叶受损状况下针叶的挥发性成分主要有桧烯、罗勒烯、乙酸芳香酯、大根香叶烯和(E)-4，8-二甲基-1，3，7-壬三烯等。因此，比较分析植物体内的生化物质应充分考虑植株的取样器官、生长时期和立地条件以及收集提取技术等因素。 采用根际土壤提取、分离和鉴定方法，首次对马尾松根际土壤浸提物的化学成分进行试探性研究。结果表明，乙醇浸提方法共检测出109种有机物，乙酸乙酯浸提方法共检测出56种，其中相对含量大于2%的组分分别有6和14种。2种浸提方法下，相对含量最高的都是有机酸类物质，主要包括脱氢松香酸、硬脂酸和棕榈酸，结果与曹光球等(2005)通过超临界流体萃取技术研究发现的马尾松根化感物质(α-杜松醇、θ-杜松烯、棕榈酸、叶绿醇)组成具有一定的相似性。但本研究根际土壤浸提物组分与曹光球等(2006)研究的马尾松针叶挥发物组分存在一定差异。曹光球等(2006)通过超临界流体萃取技术提取、分离马尾松针叶化感物质，纯CO₂提取的叶生化物质主要为苯甲醛和Cis-2，6-二甲基-2，6-辛二烯等，乙醇和CO₂混合提取的叶生化物质主要为β-芳樟醇和苯乙醇等。Su等(2009)发现马尾松针叶受损状况下针叶的挥发性成分主要有桧烯、罗勒烯、乙酸芳香酯、大根香叶烯和(E)-4，8-二甲基-1，3，7-壬三烯等。因此，比较分析植物体内的生化物质应充分考虑植株的取样器官、生长时期和立地条件以及收集提取技术等因素。

迄今研究发现的化感物质以有机酸、酚类和萜类化合物最为多见，有机酸尤其是酚酸类是最主要的化感物质，如水杨酸、苯甲酸、阿魏酸和苹果酸等(Uddin et al.， 2012; 张志忠等，2013)。脱氢松香酸、硬脂酸和棕榈酸等是否为马尾松的化感物质，需要进一步化感试验验证，如对受体种子发芽和幼苗生长等的影响。此外，马尾松根际土壤有机酸含量显著高于枫香，这是否与2种林木根际土壤pH和林下植被多样性存在联系，也值得进一步探讨。

根系分泌物的收集方法多样，且易受外界环境因素的影响。有学者通过设计循环培养装置(Hodge et al.， 1996; 王占义等，2010)模拟植物的正常生长情况，来收集根系分泌物，但这不太适合成熟林木根系的研究。由于林木根系分泌到土壤中的物质，易受土壤微生物的分解作用，因此采用根际土壤浸提法得出的根系分泌物成分，与植物正常生命活动情况下的分泌情况存在一定差异。

Smith(1970)和陈龙池等(2003)采用野外挖掘和容器培养等方法，对林木根系分泌物进行了研究和探讨，在一定程度上解决了上述问题；但由于根系分泌物的收集方法缺乏一种公认的标准，使得研究结果间的可比性差。此外，有机提取剂极性不同，萃取的根系分泌物的成分也不同(杨先国等，2013)。本研究从试剂毒害性小角度考虑，选择乙醇、乙酸乙酯进行浸提，比较分析其浸提效果。研究发现，2种林木根际土壤乙醇浸提物的有机物种类显著高于乙酸乙酯浸提物，采用乙醇浸提更为充分。此外，还应增加与其他毒性较高的有机试剂(如甲醇、二氯甲烷等)进行比较分析，以期找到安全、有效的提取方法。因此，如何进行有效收集、提取和分离仍是林木根系分泌物研究的重点和难点。