林业科学  2015, Vol. 51 Issue (8): 52-59   PDF    
DOI: 10.11707/j.1001-7488.20150807
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文章信息

何学友, 蔡守平, 杜月飞, 陈德兰, 黄金水, 李孔泉
He Xueyou, Cai Shouping, Du Yuefei, Chen Delan, Huang Jinshui, Li Kongquan
感染油茶象幼虫的高致病力金龟子绿僵菌菌株筛选
Screening of Metarhizium anisopliae Strain with High Virulence against Larvae of Curculio chinensis (Coleoptera: Curculionidae)
林业科学, 2015, 51(8): 52-59
Scientia Silvae Sinicae, 2015, 51(8): 52-59.
DOI: 10.11707/j.1001-7488.20150807

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收稿日期：2014-09-15
修回日期：2015-04-02

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何学友
蔡守平
杜月飞
陈德兰
黄金水
李孔泉

引用本文
何学友, 蔡守平, 杜月飞, 陈德兰, 黄金水, 李孔泉. 2015. 感染油茶象幼虫的高致病力金龟子绿僵菌菌株筛选[J]. 林业科学, 51(8): 52-59.
He Xueyou, Cai Shouping, Du Yuefei, Chen Delan, Huang Jinshui, Li Kongquan. 2015. Screening of Metarhizium anisopliae Strain with High Virulence against Larvae of Curculio chinensis (Coleoptera: Curculionidae). Scientia Silvae Sinicae, 51(8): 52-59.  DOI: 10.11707/j.1001-7488.20150807
感染油茶象幼虫的高致病力金龟子绿僵菌菌株筛选
何学友1, 蔡守平1, 杜月飞2, 陈德兰3, 黄金水1, 李孔泉4    
1. 福建省林业科学研究院 国家林业局南方山地用材林培育重点实验室 福州 350012；
2. 新疆维吾尔族自治区昌吉市林业局 昌吉 831100；
3. 福建省武夷山市林业局 武夷山 354300；
4. 福建省古田黄田国有林场 古田 352251
收稿日期：2014-09-15；修回日期：2015-04-02
基金项目：福建省省属公益类科研院所基本科研专项“真菌杀虫剂防治重要森林害虫的研究与应用” (2014Ｒ1011 － 2)、 “绿僵菌固体发酵 培养关键技术的研究” (闽林研[2013]38号)。
摘要：【目的】筛选对油茶象幼虫具有高致病力的绿僵菌菌株，为防治油茶象幼虫提供高效的生防菌。【方法】在测定7个金龟子绿僵菌菌株的生长速度和产孢量的基础上，采用浸渍法和孢子拌土法对油茶象幼虫进行致病力测定，并以土表喷菌液的方式进一步研究优良菌株对土壤中油茶象幼虫的感染效果。【结果】 FJMa201101和FJMa201205两个菌株产孢量最高；不同绿僵菌菌株对油茶象幼虫均有一定的致病力，107孢子·mL-1的孢悬液浸渍法接种后第13天和105孢子·g-1土的孢子拌土法接种后第9天，油茶象幼虫的死亡率均达到100%，LT50分别在1.65~4.26天和1.96~3.51天之间；FJMa201101和FJMa201205两个菌株对油茶象幼虫的致病力最强。FJMa201101菌株浸渍法接种LT50为1.65天，感染率为86.6%；孢子拌土法LT50为2.11天，感染率为94.5%。FJMa201205菌株浸渍法接种LT50为1.71天，感染率为91.1%；孢子拌土法LT50为1.96天，感染率为88.9%。林间土表喷菌液的方式，FJMa201101和FJMa201205两个菌株之间的感染效果差异不显著，但先喷菌再引入试虫较引入试虫后再喷菌的感染效果更好。【结论】 FJMa201101和FJMa201205两个金龟子绿僵菌菌株可以作为防治油茶象幼虫的优良菌株在生产上应用。
关键词： 油茶象    金龟子绿僵菌    致病力    浸渍法    孢子拌土法    蛀果害虫    
Screening of Metarhizium anisopliae Strain with High Virulence against Larvae of Curculio chinensis (Coleoptera: Curculionidae)
He Xueyou1, Cai Shouping1, Du Yuefei2, Chen Delan3, Huang Jinshui1, Li Kongquan4    
1. Key Laboratory of Southern Mountain Timber Forest Cultivation of State Forestry Administration Fujian Academy of Forestry Fuzhou 350012;
2. Changji Forestry Bureau of Xinjiang Uygur Autonomous Region Changji 831100;
3. Wuyishan Forestry Bureau, Fujian Province Wuyishan 354300;
4. Huangtian State-Owned Forest Farm of Gutian, Fujian Province Gutian 352251
Abstract: [Objective] Curculio chinensis (Coleoptera: Curculionidae) is one of the most serious pests of oil-tea Camellia fruits.Screening of Metarhizium anisopliae strains with high virulence against this pest is important for using fungi as biocontrol agent to suppress this pest.[Method] Colony growth and sporulation of 7 strains of M. anisopliae were measured and their virulence against C. chinensis larvae were investigated in laboratory by using two inoculating methods ( Being dipped on larvae with conidia suspension of 107 spores·mL-1 and being mixed in soil with 105spores·g-1). The infection effects in field were evaluated through spraying conidia suspension of two superior strains. [Result] Bioassay results showed that larvae of C. chinensis were susceptible to different M. anisopliae strains. The larval mortalities reached 100% on the 13th day after inoculation using dipping inoculative method and the 9th day for conidia-soil mixing inoculative method. The median lethal time (LT50) of dipping inoculative method was 1.65 days to 4.26 days, and that of conidia-soil mixing inoculative method was 1.96 days to 3.51 days. The FJMa201101 and FJMa201205 strains of M. anisopliae were the most virulent against larvae of C. chinensis. When larvae inoculated with FJMa201101, the LT50 was 1.65 days, and the infection rate was 86.6% when using dipping inoculative method, while the LT50 was 2.11 days and the infection rate was 94.5% respectively for conidia-soil mixing inoculative method. When inoculated with FJMa201205, the LT50 was 1.71 days with the infection rate of 91.1% by using dipping inoculative method, whilst it was 1.96 days with the infection rate of 88.9% with conidia-soil mixing inoculative method. In field test, there was no significant difference in infection rate between the two superior strains, but the infection rates of larvae introduced to soil after spraying conidia suspension were significantly higher than those introduced before spraying. Meanwhile, the two strains were excellent at growth performance. [Conclusion] Therefore, the two strains of M. anisopliae, FJMa201101 and FJMa201205, could be the promising candidate in controlling C. chinensis larvae.
Key words: Curculio chinensis    Metarhizium anisopliae    virulence    dipping inoculative method    conidia-soil mixing inoculative method    pest of oil-tea Camellia fruit    

油茶(Camellia spp.)泛指山茶科(Theaceae)山茶属(Camellia)中油脂含量较高、具有经济栽培价值的食用油料树种，主要分布在长江流域及其以南的14个省(市、区)，其中栽培面积最大的是普通油茶(C.oleifera)，其次为小果油茶(C.meiocarpa)。截至2013年，我国油茶种植总面积已达383万hm2，油茶产业产值由2008年的110亿元增加到390亿元(焦玉海，2013)。油茶象(Curculio chinensis Chevrolat)(鞘翅目Coleoptera：象甲科Curculionidae)又名茶籽象甲、油茶中华实象，是危害油茶果实最为严重的一种害虫，为油茶害虫中唯一的全国林业危险性有害生物。该虫成虫以喙管插入未成熟的油茶果内取食，引起果实早期脱落，亦能为害嫩梢组织；幼虫在果内蛀食果仁，使茶籽严重减产(蒋三俊， 2009，蔡守平等，2011；何立红等，2014)，并且影响茶油品质。据调查，油茶象危害后有的油茶林的落果率可达到69.2%(姜晓装，2001)。油茶作为食用油料树种，应尽量少用或避免使用化学农药，因此，亟需探寻油茶象的生物防治方法和技术。绿僵菌(Metarhizium spp.)是研究和应用最广的虫生真菌之一，其寄主范围较广(刘爱英，1991；周燚等，2006)。近年来，世界各地用绿僵菌对近百种农林作物及卫生害虫进行了防治试验(Roberts et al.， 2004；周燚等，2006)。我国在利用绿僵菌防治农林业害虫中也开展了积极有效的工作(陈祝安等，1995；董辉等，2011；何学友等，2011；陆永跃等，2004；宋漳等，2001；童应华等，2009；吴青等，2006；肖育贵等，2000；庄乾营等，2010)。金龟子绿僵菌(M.anisopliae)是防治地下害虫良好的真菌杀虫剂，已有长期的应用实践(周燚等，2006；樊美珍等，1996；Mazodze et al.， 1999；Milner et al.， 2003)。油茶象虽然是严重的蛀果害虫，但其在老熟幼虫阶段钻出油茶果实，落入土壤中滞育，时间长达1年以上，直至第3年才在土中化蛹，随后羽化出成虫。有关利用虫生真菌防治油茶象的研究尚未见报道，因此，本文选择7株金龟子绿僵菌，采用浸渍法和孢子拌土法对油茶象幼虫进行致病力测定，并以土表喷菌液的方式进一步研究优良菌株对土壤中油茶象幼虫的感染效果，以期筛选出对油茶象幼虫致病力强的优良金龟子绿僵菌菌株，为防治油茶象幼虫提供高效的生防菌。

1 材料与方法 1.1 试虫来源及饲养

于2014年11月油茶果采收季，在福建省闽侯桐口国有林场、福建省福州北峰国有林场、福建省古田黄田国有林场的油茶果(普通油茶和小果油茶)晒场收集从新鲜油茶果中钻出的油茶象幼虫，置于事先装有灭菌土壤的养虫盒中，带回实验室备用。

1.2 供试菌株

供试的7株金龟子绿僵菌均为笔者在自然界采集的菌株，相关信息见表 1。菌株保存于福建省林业科学研究院森林保护研究所实验室，斜面低温保存。试验前将菌株转接入PPDA平板培养9～10天，待产孢充分后保存备用。

表 1 供试金龟子绿僵菌菌株来源 Tab.1 Origin of different strains of M. anisopliae
1.3 不同菌株生长速度及产孢量测定

用点接法将不同菌株接种于PPDA平板培养基中央，置于(25±1)℃培养箱中培养，用十字交叉法每天测量1次菌落直径，每处理设3次重复，共观察15天，比较不同菌株菌落生长速度。同时记录开始产孢时间，第15天(产孢基本结束)用直径为1.5 cm的打孔器于菌落中心至边缘1/2处打取小菌碟，取出菌碟置于含30 mL浓度0.03%吐温-80无菌水的锥形瓶内，振荡使孢子充分分散并适当稀释，血球计数板测定孢子浓度并换算成单位面积的产孢量。每个平板打取3个菌碟进行孢子含量测定，取其平均值作为1个重复的孢子数。各菌株重复测定3次。

1.4 绿僵菌对油茶象幼虫的致病力测定 1.4.1 浸渍接种法

各菌株从平板上刮取一定量孢子置于灭菌的浓度0.03%吐温-80溶液中，均配制成107孢子·mL-1的孢子悬浮液；将健康、活动正常的油茶象幼虫在孢悬液中浸渍10 s，然后轻轻取出放入养虫盒内已灭过菌的土壤中(土壤含水率为20%±2%)，每盒放置10头幼虫，3个养虫盒作为1个处理(即每处理30头)，每处理3次重复。以浸渍0.03%吐温-80无菌水溶液处理作为对照。处理后将养虫盒放置于黑暗的(25±1)℃恒温培养箱中，每天观察记载油茶象幼虫死亡情况，用灭过菌的棉签轻触虫体，判断幼虫是否存活。死虫置于灭过菌的平皿中，以湿棉球保湿培养，观察菌丝生长及产孢情况(虫尸上长出肉眼可见的菌丝及孢子)，并挑片在显微镜下镜检确定是否为绿僵菌感染致死，统计死亡率及感染率(僵虫率)。

1.4.2 孢子拌土法

将油茶林中的土壤取回、捏碎，过20目筛，然后置于高压蒸汽灭菌锅中灭菌30 min。用各菌株的孢子分别与上述灭过菌的土壤(土壤含水率为20%±2%)混合均匀，配制成浓度为105孢子·g-1土的带菌土壤置于养虫盒中，将健康、未受伤的油茶象幼虫小心置于带菌土壤中，然后将养虫盒置于黑暗的(25±1)℃恒温培养箱中，每天观察记载油茶象幼虫死亡情况。试验处理方法同1.4.1。

1.5 绿僵菌对林间土壤中油茶象幼虫的感染效果

2014年11月上旬，在福州北峰国有林场油茶林中林冠层下挖20 cm×20 cm×20 cm(长×宽×深)的小坑，铺垫细密尼龙网，然后用原土回填，即成一个样方，表面喷水让其恢复自然状态，5天后开始试验。喷菌：将在室内测定致病力最强的菌株的孢子，用灭菌的0.03%吐温-80溶液配制成108孢子·mL-1的孢子悬浮液，吸取3 mL置于手持喷雾器中，用50 mL水稀释后均匀喷至样方土表。引入试虫：选取30头健康油茶象幼虫小心放在样方的土表，让其自由钻入土中，1 h内不能钻入的则替换试虫。处理方式：引入试虫后第5天喷菌以及喷菌后当天、第5天、第15天引入试虫4个处理，每处理随机设置3次重复。以喷无菌水的0.03%吐温-80溶液为对照，3次重复。试虫引入后30天(引入试虫后第5天喷菌的从喷菌当天计起)，将样方中所有土壤连同尼龙网一起取出，带回实验室，仔细检查统计其活虫数、僵虫数以及死虫数，死亡的虫体进一步保湿培养，确定其是否为绿僵菌感染致死(方法同1.4)。采用温度自动记录仪(美国OnsetHOBO，U12-006)测定土壤温度，试验期间土壤温度为11～20 ℃。

1.6 数据处理

根据试验观察数据计算接种后油茶象幼虫的死亡率、感染率，试验数据在DPS数据处理系统平台上进行统计分析，采用死亡率-时间机率值分析法，以时间(天)的对数值为 x，将死亡率转换为机率值，并以机率值为 y，计算出毒力回归方程和致死中时(LT50)，不同菌株之间的致死中时差异采用致死中时比例测定方法来检验(唐启义等，2002)。

2 结果与分析 2.1 不同菌株的生长速度与产孢量

不同绿僵菌菌株在PPDA平板上的生长情况见图 1。在第5天时，不同菌株的菌落直径间存在显著差异(F=65.215，P=0.00 <0.05)，其中以FJMa200902菌株生长最快，菌落直径达 (2.5±0.1)cm，显著高于其 他菌株； 在第10天时，不同菌株的生长依然存在显著差异(F=7.252，P=0.00<0.05)，以FJMa200701，FJMa200902，FJMa201205和FJMa201110菌株生长较快，菌落直径分别为4.9，4.8，4.8和4.7 cm，显著高于其他菌株；而到第15天时，各菌株的菌落直径在5.6~6.5 cm之间，差异不显著(F=1.458，P=0.227>0.05)。各菌株开始产孢时间差异较大，其中FJMa201101，FJMa201110，FJMa201205和FJMa200902菌株开始产孢时间早，基本在第3天就开始逐渐产孢，而其他3个菌株产孢较慢，均在4，5天以后才开始产孢，其中以FJMa201012菌株产孢最慢，菌落生长6天以后在菌落中间才明显可见孢子产生。

图 1 不同金龟子绿僵菌菌株菌落直径比较 Fig. 1 Comparison of growths among different M. anisopliae strains

不同绿僵菌菌株的产孢量见图 2。从图中可以看出，不同菌株产孢量存在显著差异(F=7.700，P=0.000)，其中以FJMa201101菌株产孢量最高，15天菌株产孢量达1.13×108孢子·cm-2，显著高于其他菌株； 其次以FJMa200902，FJMa201205菌株产孢量较高； FJMa201010菌株产孢量最低，15天产孢量为6.58×107孢子·cm-2。

图 2 不同金龟子绿僵菌菌株产孢量比较 Fig. 2 Comparison of sporulation among different M. anisopliae strains
2.2 不同菌株对油茶象幼虫的致病力比较 2.2.1 同接种方式接种后油茶象幼虫累积死亡率

不同绿僵菌菌株分别接种油茶象幼虫后，浸渍法和孢子拌土法累积死亡率见图 3，幼虫感病症状见图 4。无论采用哪种接种方式，油茶象幼虫累积死亡率均随时间的增加而逐渐增高。浸渍法接种后第13天、孢子拌土法接种后第9天，所有菌株处理的油茶象幼虫累积死亡率均达到100%。但不同菌株接种后，油茶象幼虫死亡速度存在明显差异，接种FJMa201205和FJMa201101菌株的油茶象幼虫死亡速度显著较其他快，浸渍法接种后第5天，FJMa201101和FJMa201205菌株对油茶象幼虫累积死亡率分别达到100%和93.3%(图 3a)。孢子拌土接种法，油茶象幼虫死亡速度较浸渍法更快，接种后第9天，所有菌株处理的油茶象幼虫累积死亡率均达到100%。其中FJMa201101和FJMa201205菌株的表现也最好，2个菌株接种后第6天幼虫累计死亡率均达到100%(图 3b)。对照组幼虫的死亡率较低，且死亡的幼虫经保湿培养后，未出现绿僵菌感染的情况。

图 3 绿僵菌不同菌株接种后油茶象幼虫累计死亡率 Fig. 3 Cummulative mortality of C. chinensis larvae after inoculation of M. anisopliae strains by different inoculative methods
图 4 油茶象幼虫被金龟子绿僵菌感病症状 Fig. 4 Larvae of C. chinensis infected by M. anisopliae after inoculation
2.2.2 采用浸渍法接种后不同绿僵菌菌株对油茶象幼虫致病力的比较

采用浸渍法接种油茶象幼虫后，不同绿僵菌菌株对其致病力见表 2。经检验，不同菌株对油茶象幼虫致病力回归方程拟合程度显著水平均大于0.05，表明所求致病力回归曲线是合适的。通过计算得出各菌株对油茶象幼虫的致死中时(LT50)及其95%置信区间，从表 2中可看出，各绿僵菌菌株对油茶象的致死中时比较短，均不超过5天，其中以菌株FJMa201101和FJMa201205的致死中时最小，分别为1.65天和1.71天，显著较其他菌株低，而FJMa200701，FJMa200902和FJMa201012 三个菌株的致死中时较长，分别为3.24，3.55，4.26天。FJMa201101和FJMa201205 的感染率也较其他菌株高，分别为86.6%±5.8%和91.1%±1.9%。

表 2 采用浸渍法接种后不同绿僵菌菌株对油茶象幼虫致病力 Tab.2 Virulence of different M. anisopliae strains to larvae of C. chinensis using dipping inoculative method
2.2.3 采用孢子拌土法接种后不同绿僵菌菌株对油茶象幼虫致病力的比较

采用孢子拌土法接种油茶象幼虫后，不同绿僵菌菌株对其致病力见表 3。从表 3可以看出，不同菌株对油茶象幼虫致病力回归方程拟合程度显著水平也均大于0.05，表明所求致病力回归曲线是合适的。同样计算各菌株对油茶象幼虫的致死中时发现，接种FJMa201205和FJMa201101菌株的致死中时显著较其他菌株短，分别为1.96，2.11天； 最长的是FJMa201012菌株，为3.51天。采用孢子拌土法接种的平均幼虫感染率较浸渍法略高，其中最高的仍是FJMa201101和FJMa201205菌株，分别达到94.5%±3.9%和88.9%±5.1%。

表 3 采用菌剂拌土法接种后不同绿僵菌菌株对油茶象幼虫致病力 Tab.3 Virulence of different M. anisopliae strains to larvae of C. chinensis using conidia-soil mixing inoculative method
2.3 绿僵菌对林间土壤中油茶象幼虫的感染效果

如表 4所示，2个菌株之间感染效果差异不显著，但先喷菌再引入试虫处理的感染效果明显好于引入试虫后再喷菌，且幼虫死亡率随着喷菌后引入幼虫时间的延长而逐渐降低。FJMa201101和FJMa201205两个菌株喷菌后当天引入试虫，油茶象幼虫校正死亡率分别为56.3%±3.4%和51.7%±1.9%；喷菌5天后引入试虫，幼虫校正死亡率分别为53.0%±4.4%和48.2%±8.9%。感染率也是这2个处理相对较高。

表 4 不同处理下绿僵菌对林间土壤中油茶象幼虫的感染效果 Tab.4 Field test results of controlling larvae of C. chinensis by different treatments
3 结论与讨论

供试的金龟子绿僵菌菌株对油茶象幼虫均有一定的致病力，107孢子·mL-1的孢悬液浸渍法接种后第13天和105孢子·g-1土孢子拌土法接种后第9天，幼虫的死亡率均达到100%，LT50分别在1.65~4.26天和1.96~3.51天之间。本次试验中，从油茶果晒场收集健康的油茶象幼虫后直接置于灭过菌的土壤中，幼虫存活情况良好。笔者在以前的研究中发现，如果将油茶象幼虫放入未灭菌的林间土壤中，则油茶象被真菌(绿僵菌或白僵菌)感染的现象较为普遍，在一些土壤中感染率甚至可达到20%左右，结合本研究的结果，说明油茶象幼虫对绿僵菌是比较易感的群体。FJMa201101和FJMa201205两个菌株均表现最好，无论浸渍法或是拌土法，这两个菌株均表现出对油茶象幼虫的致死速度快、LT50短、感染率高；同时，产孢量也较高。FJMa201101和FJMa201205两个菌株可作为油茶象幼虫优良的生防菌株进一步加以利用。筛选出优良菌株是利用虫生真菌防治害虫的前提，后续还要进一步研究高致病力菌株对油茶象幼虫的LC50以及菌剂林间应用技术，相关工作正在开展。

前人利用绿僵菌对鞘翅目幼虫致病力测定的研究已有较多报道，在106~108孢子·mL-1的浓度条件下，供试(或初筛)菌株LT50大多在3~10天之间，有的甚至长达数周。何学友等(2005)采用浸渍法接种测定不同金龟子绿僵菌菌株对松墨天牛(Monochamus alternatus)3~4龄幼虫致病力，LT50在5~7天之间；王宝辉等(2009)用绿僵菌MS01的108孢子·mL-1悬浮液接种70天龄光肩星天牛(Anoplophora glabripennis)幼虫，LT50为3.35天；陈川等(2009)采用浸渍法接种华北大黑鳃金龟(Holotrichia oblita)幼虫，在绿僵菌孢子浓度为2.0×107孢子·mL-1时，LT50为8.12天；张雯龙等(2012)研究了不同来源绿僵菌对椰心叶甲(Brontispa longissima)3龄幼虫的致病力，结果发现SY-2菌株在108孢子·mL-1孢子悬浮液接种处理后，对椰心叶甲3龄幼虫的LT50为3.8天；张晶等(2012)在室内用喷雾法测定13株绿僵菌对4龄红棕象甲(Rhynchophorus ferrugineus)幼虫的致病力，Red2菌株在浓度为1.0×108孢子·mL-1水悬浮剂时的LT50为5.23天。相关报道LT50甚至有超过20天的，如赵文琴等(2005)用金龟子绿僵菌Ma09和Ma20菌株1×107 孢子·mL-1的孢悬液，采用浸渍法接种铜绿丽金龟(Anomala corpulenta)幼虫(供试的蛴螬虫龄较大)后置于土壤中饲养，LT50分别为26.24和26.65天。Ansari等(2004)在测定虫生真菌对Hoplia philanthus幼虫的致病力时，首先采用浸渍法研究了34株绿僵菌、白僵菌、拟青霉(Paecilomyces sp.)菌株对H.philanthus 3龄幼虫的致病力，结果发现2个绿僵菌菌株CLO53和CLO54接种10周后，H.philanthus 幼虫死亡率超过90%，而其他菌株的死亡率在10%～62%之间；进一步采用菌粉拌土法研究了绿僵菌CLO53菌株对H.philanthus幼虫的致病力，在20 ℃条件下，土壤中孢子浓度为108·g-1时LT50最短，为2.4周，而孢子浓度越低，其LT50也越长，104时LT50最长，为18.7周。从以上研究结果不难看出，接种方法、虫龄、接种量等多种因素均能影响LT50的长短，但在相近条件下，如本研究中金龟子绿僵菌对油茶象幼虫的致死中时LT50短于3天的很少见，其原因可能是自然界中油茶象幼虫出果入土后那很快做蛹室，进入长达1年多的滞育，而生物测定试验过程影响了其生理状态，从而降低了其对病原菌的抵抗力，亦或是其他原因造成，具体原因有待更深入的研究。

在林间土壤感染试验中，采取模拟油茶象幼虫自然钻入土壤之前和之后喷菌的方式进行，结果喷菌后引入试虫的感染效果较喷菌前引入试虫的处理好。这可能是由于油茶象幼虫在落地后，迅速钻入土壤中，而孢子悬浮液地表喷菌其孢子大部分分布在地表或浅层土壤(试验期间，试验地未出现明显的有效降水)。若先引入试虫再喷菌，试虫与绿僵菌孢子的接触机率较小；而喷菌后再引入试虫，幼虫在钻入土壤的过程中接触到绿僵菌孢子的机率更高。林间油茶象幼虫出果时期长，试验结果对制定林间施菌时机有较大的指导意义，亦即在幼虫出果高峰前期喷菌更为有效。本次试验在油茶象幼虫引入1个月后检查效果，校正死亡率在40%～60%之间，比室内致病力测定感染率低，可能主要原因是： 1)试验期11月土壤温度在11～20 ℃之间，与绿僵菌的最佳生长温度25 ℃左右相比较低，不利于绿僵菌的生长与侵染；2)与室内试验相比，幼虫接触到的孢子较少。研究表明，绿僵菌在土壤中宿存能力强(周燚等，2006；樊美珍等，1996；Flores et al.， 2002)，对控制诸蛴螬、桃小食心虫等在土壤中生活周期长的害虫具有重要作用(樊美珍，1996；Ansari et al.， 2004；Mazodze et al.， 1999)。因此，随着时间的推移，更多绿僵菌孢子可能会随着雨水渗入更深层土壤从而接触虫体，加之土壤温度的回升，都将提高感染效果。而生产上正常管理的油茶林每年(或2年)都会垦覆，在垦覆过程中也会将孢子(菌剂)翻入土中使其与虫体有更多接触的机会。油茶象幼虫在土壤中生活期长，在其羽化前控制其虫口密度，对减轻该害虫危害有着重要的意义，林间长期控制效果还有待进一步研究。

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