生长素不仅调节植物自身生长与发育，而且在植物应答生物与非生物胁迫过程中具有重要作用(Woodward et al.， 2005)。大量的遗传学和生物化学研究表明，生长素信号转导是实现其生物学效应的内在机制，例如，生长素通过与TIR1/AFB F-box(Dharmasiri et al.， 2005;Mockaitis et al.， 2008)、生长素反应因子(auxin response factors，ARFs)(Guilfoyle et al.， 2007;Okushima et al.， 2005)和生长素反应阻遏子/抑制子(Aux/IAA阻遏子)(Overvoorde et al.， 2005;Remington et al.， 2005)这3个蛋白质家族的直接或间接相互作用，影响下游基因的转录，从而影响或应对体内与体外的环境变化。

TIR1/AFB F-box作为生长素受体参与从生长素结合到Aux/IAA蛋白降解这一信号转导过程，并且TIR1/AFB F-box家族各成员具有不同的生化特性和生物学功能。拟南芥(Arabidopsis thaliana)的TIR1/AFB F-box基因家族具有7个成员，分别为TIR1，AFB1，AFB2，AFB3，AFB4，AFB5和COI1。生长素运输抑制剂响应蛋白1(TIR1)是第1个确定的生长素受体(Dharmasiri et al.， 2005;Kepinski et al.， 2005)，它是一个F-box蛋白，具有多个富亮氨酸重复(LRR-rich repeats，LRRs)区域，参与泛素化蛋白降解途径(ubiquitination protein degradation pathway)。除TIR1外，AFB1，AFB2和AFB3同样也具有受体的作用，与TIR1在功能上存在冗余(Dharmasiri et al.， 2005)。研究发现，TIR1/AFB2与Aux/IAA蛋白之间的相互作用强于TIR1/AFB1和TIR1/AFB3(Parry et al.， 2009)，AFB3在植物根部氮素反应中起重要作用(Vidal et al.， 2010)。而遗传学试验结果则显示AFB4负调控植物生长素反应(Greenham et al.， 2011)。此外，COI1是植物的茉莉酸反应途径所必需的(Xu et al.， 2002)。

目前AFB基因家族已经在拟南芥、水稻(Oryza sativa)等模式植物中被广泛地研究，但是其在木本植物中的研究却非常缺乏。杨树(Populus)是林木分子生物学研究的模式物种，因而本研究以NL-895杨(P. deltoides × P. euramericana cl. NL-895)为材料，克隆杨树AFB基因家族成员，并检测其在病原菌、激素和干旱胁迫下的表达模式，以期更加深入地了解杨树生长发育及激素信号转导过程，为杨树的遗传改良选育工作打下坚实基础。

基因克隆和表达分析所用材料为NL-895杨无菌苗，使用MS₀培养基(蔗糖20 g·L^-1，pH 5.8)进行继代培养，生长条件为25 ℃，16 h/8 h(光照/黑暗)。

选取培养4周、苗高约4 cm、生长状态较一致的NL-895组培苗，将茉莉酸甲酯(MeJA，500 μmol·L^-1)和去离子水(对照)分别均匀喷洒在杨树苗叶片上，于1，12，24 h后取样。丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)菌株DC3000用无菌水重悬至10⁶个孢子·mL^-1，均匀喷洒在叶片上，去离子水为对照，在处理后0.5，1，1.5，2 h取样。干旱胁迫处理采用20%(m/V)PEG-6000培养杨树组培苗，对照以无菌水培养，分1，12和24 h 3个时间点。各样品取样后液氮速冻，－70 ℃保存备用。

pMD19-T购自大连宝生物工程公司(Takara)，大肠杆菌(Escheriachia coli)Top10和DC3000保存于本实验室。

采用Trizol法(Invitrogens公司)提取NL-895杨叶片总RNA。引物设计基于毛果杨(P.trichocarpa)基因组(http://www.phytozome.net/search.php)预测AFB基因家族的序列信息，通过PCR扩增基因片段，测序，进而设计RACE引物，并选用大连宝生物公司生产的3′-Full RACE Core Set Ver.2.0试剂盒和5′-Full RACE试剂盒克隆目的基因3′和5′片段。将所获得的3′和5′片段进行比对与拼接，获得全长cDNA。用NCBI ORF Finder程序查找序列的ORF(open reading frame)，并根据正确的ORF设计基因全长引物(表 1)，采用TaKaRa LA Taq高保真酶扩增目的基因的ORF。所有扩增产物均在1%～2%的琼脂糖凝胶上进行电泳分析，将分子质量正确的条带切下，回收纯化(天根公司)，连接pMD19-T vector(TaKaRa公司)，转化大肠杆菌Top10，最后将阳性克隆委托测序公司(上海英骏)测序。

表 1 杨树PeAFB基因克隆引物 Tab.1 Oligonucleotides primers used in PeAFB cloning

表 1 杨树PeAFB基因克隆引物 Tab.1 Oligonucleotides primers used in PeAFB cloning 引物名称Primer ID 正向引物Forward primer 反向引物Reverse primer PeAFB2-1 ORF 5′-ATGAATTATTTCCCTGATGAAGT-3′ 5′-AAGGGTAACGTCGCCAGGATG-3′ PeAFB2-2 ORF 5′-ATGAATTATTTCCCAGATG-3′ 5′-TAAAGTCCACACGAAC-3′ PeAFB3 ORF 5′-ATGAATTATTTCCCTGATGAAG-3′ 5′-TAAAGTCCACACGAACTCTGGTG-3′ PeAFB5 ORF 5′-ATGGTCACCAACAAAAAGCCT -3′ 5′-CAAGATGGAAACAAATCGTG -3′ Eflα qRT-PCR 5′-GGCAAGGAGAAGGTACACAT -3′ 5′-CAATCACACGCTTGTCAATA -3′ PeAFB2-2 qRT-PCR 5′-CTTGGGTGTAGGGTCTTA -3′ 5′-AGTCAAGTTCGGGCAAAT -3′ PeAFB3 qRT-PCR 5′-CTGCTCCTCAATGCCTAT -3′ 5′-AGCCCACTTCAGTCACAGC -3′

利用ProtParam(http://expasy.org/tools/protparam.html)软件进行蛋白质理化参数分析，计算蛋白质的分子质量以及理论等电点pI； 采用Interproscan(http://www.ebi.ac.uk/interpro/sequencesearch)进行保守结构域分析； 利用Swiss-Model(http://swissmodel.expasy.org)软件进行PeAFB蛋白质三级结构的预测； 序列多重比对使用Clustal W软件，序列的系统树采用MEGA5.1 软件中的邻接(neighbor joining，NJ)算法进行构建(Tamura et al.， 2011)。

各样品总RNA提取参照1.3.1，采用SuperScriptTM III First-Str and Synthesis System for RT-PCR反转录试剂盒(Invitrogen)合成cDNA。使用Oligo 6软件设计qRT-PCR扩增引物(表 1)，EF1α基因作为内参基因(Xu et al.， 2011)。qRT-PCR采用SYBR Green Realtime PCR Master Mix(TOYOBO)在ABI 7500 Real time PCR Systems(Applied Biosystems)上完成，每个样品3次重复。

根据毛果杨全基因预测杨树AFB基因家族的序列信息，通过PCR扩增获得4条来自NL-895杨的cDNA片段，测序，进而设计4对RACE引物，选用大连宝生物公司生产的3′RACE试剂盒、5′RACE试剂盒分别克隆PeAFB基因的3′和5′端片段，试验结果显示5′和3′RACE均能扩增出特异性条带。将特异性条带切胶回收纯化，克隆到T载体上，测序，以及序列拼接。并通过序列比对，将其命名为PeAFB2-1，PeAFB2-2，PeAFB3和PeAFB5。各基因的cDNA全长、ORF全长、编码氨基酸全长、分子质量以及等电点如表 2所示。

表 2 杨树PeAFB基因序列分析 Tab.2 Sequence analysis of PeAFB

表 2 杨树PeAFB基因序列分析 Tab.2 Sequence analysis of PeAFB 基因Gene cDNA/bp ORF/bp 氨基酸(个)Amino acid 亮氨酸含量Leu content(%) 分子质量Molecular mass 等电点pIIsoelectric point PeAFB2-1 2 461 1 546 515 13.4 57 984.4 7.78 PeAFB2-2 3 115 1 716 571 12.6 64 013.3 6.88 PeAFB3 2 441 1 716 571 13.0 64 179.3 7.16 PeAFB5 2 818 1 914 637 10.5 71 094.5 5.42

从表 2可以看出，4个PeAFB蛋白亮氨酸含量较高，均在10%以上，特别是PeAFB2-1，达13.4%，符合AFB蛋白质富含亮氨酸特征。

对所获得的4个PeAFB基因家族成员的ORF，以及来自拟南芥的AtAFB基因家族成员进行同源性分析(图 2)。结果显示，AFB家族成员之间有着较高的相似性。PeAFB家族成员N-端都具有典型的F-box结构域(IPR001810)，还有5个富含亮氨酸重复序列(LRR-rich repeat，IPR006553)。

	图 1 杨树和拟南芥AFB蛋白的氨基酸序列比对 Fig. 1 Amino acid sequence multi-alignment of AFB proteins in Populus and Arabidopsis thaliana

	图 2 杨树PeAFB蛋白三级结构预测 Fig. 2 Tertiary structure prediction of PeAFB in Populus

蛋白质以特定的适当空间构象存在时才具有生物活性，因而三级结构与蛋白功能息息相关。蛋白质结构可采用X晶体衍射及核磁共振等试验技术加以验证，但费用成本过高。瑞士模型工作区(Swiss-Model Workspace)是用于对蛋白质结构做同源建模的网络综合服务器，可预测和模拟蛋白质三级结构。4个PeAFB蛋白均以编号为3c6o.1.B的模型为模板，其中AFB2-1与其相似度达到63.96%，AFB2-2为61.84%，AFB3为62.54%，AFB5与其相似度较低，为52.79%。从PeAFB蛋白的三级结构模型可以看出，PeAFB2-1，PeAFB2-2，PeAFB3和PeAFB5的三维结构非常相似(图 2)，在N-端3个α螺旋之后，1个β折叠后面会紧随1个α螺旋，这是明显的LRRs结构。

利用NJ算法将PeAFB基因的氨基酸序列与拟南芥、水稻、玉米( Zea mays)等其他植物的AFB基因进行系统进化树的构建。结果表明，4个杨树PeAFB蛋白和来自其他植物的47个AFB蛋白家族成员可以聚为4大类(图 3)。本研究所克隆的4个杨树PeAFB蛋白属于第Ⅰ类，并且与拟南芥的AtAFB蛋白家族成员同源性非常高。AtAFB2和AtAFB3聚合成一亚分支，而PeAFB2-1，PeAFB2-2和PeAFB3聚合为另一亚分支，它们同属AFB2分支，亲缘关系非常近。AtAFB5，PeAFB5以及SlAFB5也聚合在一起。由此推测，杨树的4个PeAFB成员在杨树中可能也发挥与AtAFB相似的调控作用。

	图 3 杨树和其他植物AFB蛋白家族系统进化树 Fig. 3 Phylogenetic tree of AFB family proteins in Populus and other plants Pe: 杨树 Populus; At: 拟南芥 Arabidopsis thaliana; Os:水稻 Oryza sativa; Sl: 番茄 Solanum lycopersicum; Zm: 玉米 Zea mays.

利用q-RT PCR分析了NL-895杨中PeAFB2-1，PeAFB2-2，PeAFB3和PeAFB5基因在不同胁迫条件下的表达模式。结果显示： 20%(m/V)PEG-6000溶液处理NL-895杨，在1 h后PeAFB2-2，PeAFB3和PeAFB5基因的表达量略微下调，12 h后表达量降低到原来的40%，在24 h和12 h的表达量基本保持一致。而PeAFB2-1基因的表达量在1 h后迅速下调约65%，在12 h和24 h表达量与其他3个PeAFB相似(图 4A)。而NL-895杨叶片经MeJA(500 μmol·L^-1)处理后1 h，4个基因的表达量即迅速下调70%～80%，并且在12 h和24 h后表达量继续保持较低的趋势(图 4B)。在DC3000喷洒于NL-895杨叶片30 min后，4个基因表达量即表现出强烈的下降趋势，然后在1，1.5，2 h的表达量逐渐升高(图 4C)。

	图 4 杨树PeAFBs基因在不同的胁迫条件下的表达模式 Fig. 4 Expression pattern of PeAFBs under different stresses

TIR1/AFB F-box蛋白作为生长素受体，在生长素信号转导过程中起着至关重要的作用。在所有的陆生植物中，TIR1/AFB F-box蛋白家族序列高度保守，并且家族成员极少发生扩增，表明该蛋白家族在进化过程中未承受导致基因产生多样性的正向选择压力(Parry et al.， 2009)。 在拟南芥中的研究发现，Flg22处理野生型幼苗30 min后，AtTIR1，AtAFB2和AtAFB3表达量即减少了2～3倍；同时，由于AFB基因是miRNA393的靶基因，而过表达miRNA393的转基因拟南芥一定程度上可以抵抗Pto DC3000的感染，并抑制Pto DC3000的生长(Navarro et al.， 2006)。本文的研究结果与之一致： 当DC3000侵染NL-895杨时，生长素信号转导受体PeAFB2-2和PeAFB3的基因表达量迅速降低(30 min内)，然后在1，1.5，2 h的表达量逐渐升高。MeJA与植物抵抗真菌侵染有非常密切的关系，NL-895杨叶片经MeJA(500 μmol·L^-1)处理后1 h，4个PeAFB基因的表达量即迅速下调，与DC3000侵染结果一致。因此推测PeAFB基因的功能可能与AtAFB2和AtAFB3类似，以负调控的方式参与了植物的抗病反应，通过降低对生长素的敏感性促使植株在短时间内迅速启动相关防御机制来抵抗微生物的侵染。此外，TIR1/AFB F-box蛋白家族也参与了植物应对非生物胁迫的应答过程，例如，水稻过表达miR393，可直接靶向OsTIR1和OsAFB2，水稻抗盐和抗干旱能力降低(Xia et al.， 2012)。在本研究中，20%(m/V)PEG-6000溶液处理NL-895杨12～24 h后，表达量降低到原来的40%左右，推测TIR1/AFB F-box蛋白同样以负调控的方式参与了杨树的植物干旱应答。

研究表明，F-box蛋白与SKP1可通过N末端的F-box结构域互作，从而SKP1蛋白将RBX1/cullin二聚体与F-box蛋白接合在一起，形成SCF复合体(SCFs complexes，Skp1-cullin-F-box protein ligase)(Bai et al.， 1996)。由于F-box蛋白所含参与蛋白互作的保守基序不同，赋予了SCF酶复合体底物特异性，如LRRs、WD40重复序列、ANK重复序列(Pichart，2001)。其中，LRRs是一段20～30个氨基酸的保守序列，可重复2～45次，其在真核生物中广泛参与了蛋白互作。本研究所获得的4个PeAFB家族成员N-端都具有保守的F-box结构域(IPR001810)，还有5个富含亮氨酸重复序列LRRs(Leu-rich repeat，IPR006553)，并形成典型的LRRs结构域(图 1、图 2)，表明其在蛋白空间结构上具有典型的TIR1/AFB F-box蛋白特征，与已报道的拟南芥同源蛋白类似。

系统发育研究结果表明，在被子植物和裸子植物分化之前就已形成TIR1/AFB2，AFB4和AFB6这3个独立分支； 随后，在单双子叶分化以前，TIR1/AFB2 又分化为2个独立分支，即AFB1和AFB2； 最终形成4个分支并保存至今(Parry et al.， 2009)。本研究将所克隆的4个杨树AFB和其他模式植物TIR1/AFB F-box蛋白构建了系统发育树，结果与之相符。PeAFB2-1，PeAFB2-2和PeAFB3聚合在一起，属于AFB2分支，并且与同属AFB2分支的拟南芥AtAFB2和AtAFB3亲缘关系非常近，与单子叶植物玉米和水稻的AFB2和AFB3亲缘关系较远。此外，AtAFB5，PeAFB5以及SlAFB5也聚合在AFB5这一支，与玉米和水稻的AFB5亲缘关系也较远。系统进化分析结果支持杨树和拟南芥TIR1/AFB F-box基因存在直系同源关系，推测它们可能在各种生物学过程中具有相近的功能，这与本文基因表达分析的研究结果相一致。