土壤盐渍化影响着植物的生存与生长，使作物的产量和品质大幅度下降，耕地面积不断减少，对农业生产和生态环境都有很大影响，已成为一个世界性的资源与生态难题(Shabala et al.， 2008)。盐胁迫会导致大量的Na⁺积累在植物细胞中，影响细胞的pH值和渗透压，破坏离子平衡，影响吸收其他必需元素，导致植物代谢紊乱，破坏植物正常的发育和生长(Zhu，2001；Leidi et al.， 2010)；而植物细胞会采用Na⁺的区隔化、Na⁺的外排以及渗透调节等方式来降低胞质中Na⁺的浓度，避免过高浓度的Na⁺对细胞产生的毒害作用，维持细胞内环境的稳定(Brini et al.， 2012)。研究表明，植物Na⁺/H⁺逆向转运蛋白(Na⁺/H⁺ antiporter，NHX)在耐盐调控中发挥着重要作用(Qiu，2012)。

根据NHX家族蛋白在细胞中分布和作用位置的不同，可将NHX家族蛋白分为3类(Bassil et al.， 2012)： 位于质膜(plasma membrane)的NHX通过消耗能量的逆向转运方式将Na⁺从胞质中排出胞外，减弱其对细胞产生的盐害作用(Munns et al.， 2008)； 位于内体膜(endosomal membrane)的NHX调节细胞器中Na⁺的浓度，维持细胞器的pH值和离子平衡，影响细胞器内蛋白质的分选和细胞的应激反应(Bassil et al.， 2011)； 位于液泡膜(vacuolar membrane)的NHX通过产生的H⁺电化学梯度将Na⁺运输进入液泡，可将排入的Na⁺作为离子渗透调节剂，避免细胞水分的进一步流失(Blumwald，2000)，影响植物的生长和发育(Apse et al.， 2003)。研究表明，过量表达液泡膜型NHX可提高植株耐盐能力(Liu et al.， 2010)。在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中首次克隆得到高等植物液泡膜型AtNHX1(Apse et al.， 1999)，其将Na⁺区隔进入叶的液泡中，在拟南芥、番茄(Solanum lycopersicum)(Zhang et al.， 2001)中过量表达后得到在高盐环境中正常生长的转基因植株；棉花(Gossypium spp.)(Wu et al.， 2004)、大麦(Hordeum vulgare)(Vasekina et al.， 2005)、玉米(Zea mays)(Zoerb et al.， 2005)、大豆(Glycine max)(Sun et al.， 2006)等液泡膜型NHX1的功能也相继得到验证。

桑树(Morus)是多年生木本植物，一直以来都是家蚕饲料的主要来源，同时因其具有耐旱、耐盐等生态价值，也是滨海滩涂等盐碱地治理的重要树种(秦俭等，2010； 刘雪琴等，2014)。川桑(Morus notabilis)基因组测序的完成(He et al.， 2013)为桑树抗逆分子生物学研究奠定了坚实的基础，但目前只有MnMAPKs等(Wei et al.， 2014)少数关于桑树抗逆分子生物学的研究报道。为了了解桑树抗盐性的分子机制，本研究以川桑为材料，克隆得到了桑树液泡膜型NHX基因MnNHX1； 利用荧光定量PCR方法研究‘湖桑32号’(Morus multicaulis ‘Husang No. 32’)在NaCl胁迫条件下，在不同时间、不同组织中NHX1表达量的变化情况，利用植物过量表达载体，探索了MnNHX1在转基因拟南芥中过量表达对植株抗盐性的影响，为MnNHX1进一步的开发利用提供理论依据。

供试材料为野生川桑(取自四川雅安)的嫩叶(用于提取克隆MnNHX1的mRNA)和鲁桑(Morus multicaulis)品种‘湖桑32号’约20 cm高苗木的根、茎和叶(种子收获于西南大学桑树种质资源圃，种子萌发后移栽控温植物箱得到桑苗，所取不同组织用于提取qRT-PCR试验的mRNA)。野生Columbia型拟南芥(西南大学罗克明教授惠赠)用于遗传转化； 拟南芥超量表达载体为pLGNL(本实验室保存)，该载体含有GUS和Kan双重筛选标记以及由CaMV35S启动子控制目的基因表达元件； EHA105型根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)(本实验室保存)用于介导拟南芥的遗传转化。

反转录酶M-MLV及RNA酶抑制剂购自Promega公司，BamHⅠ和EcoRⅠ限制性内切酶、RNA提取试剂RNAiso Plus、pMD19-T载体、荧光定量试剂、pBI121和DNA聚合酶购自TaKaRa公司，T₄-DNA连接酶购自成都天泰生命科技有限公司，大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司，Murashige & Skoog基础盐混合物(MS)购自重庆升博科技有限公司。华大基因公司完成引物合成和测序任务。

将-80 ℃冻存的川桑叶片置于研钵中，加入液氮，研磨为粉状，根据RNAiso Plus使用说明书提取总RNA，使用NANODROP2000仪器检测RNA的浓度和纯度，并用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整度。根据反转录试剂盒，以3 μg提取的总RNA为模板，体外反转录合成川桑cDNA。

将各物种NHX1蛋白序列从NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)网站上下载，根据tblastn比对结果，从川桑基因组中获得一个预测的NHX1基因。根据预测序列设计引物(上游引物序列： 5′-ATGACTGGAGTTTTGAGCTATGCCG-3′； 下游引物序列： 5′-TCATTCCCATTGAGCAGGAGGAG-3′)，以反转录得到的cDNA为模板扩增得到川桑NHX1基因条带。反应体系为25 μL，反应程序为： 94 ℃预变性5 min； 94 ℃变性40 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30个循环； 72 ℃延伸10 min。扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，纯化回收目的基因片段并与pMD19-T载体连接，连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，37 ℃培养后挑选阳性克隆送华大基因公司测序验证，将获得的该基因命名为MnNHX1(GenBank登录号： KJ720637)。

MnNHX1编码氨基酸翻译使用BioEdit软件，蛋白质基本理化性质预测使用ExPASy 在线程序(http://web.expasy.org/)，蛋白质跨膜结构域预测使用TMHMM在线程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)，蛋白质结构域预测使用SMART在线程序(http://smart.embl-heidelberg.de/)。

使用ClusatalX软件对其他物种的NHX1蛋白序列和MnNHX1序列进行多重序列比对，使用GENEDOC软件分析比对结果。应用MEGA5.1软件构建NJ系统进化树，bootstrap值设置为1 000，分析MnNHX1与其他物种NHX1之间的进化关系。

将使用无菌水清洗过的‘湖桑32号’种子在4 ℃春化2～3天，选取饱满的种子置于铺有湿润滤纸的培养皿中，然后转入人工智能培养箱中培养，待种子萌发后播种于混合土中(营养土:蛭石:珍珠岩的体积比为3:1:1)。2个月后，选取生长情况相似的幼苗浇灌含有200 mmol·L^-1NaCl的营养液200 mL。分别在高盐溶液处理0，12，24，48 h后，取‘湖桑32号’根、茎、叶等组织，液氮速冻，置于-80 ℃冰箱中备用。以提取处理不同时间、不同组织材料的cDNA为模板，进行荧光定量PCR试验(上游引物序列： 5′-GCGACCTTGTCATTTGTTG-3′；下游引物序列： 5′-TTCCAGGACTATCACTCACGT-3′)，并分析试验结果(反应条件为： 95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃延伸30 s，40个循环)。

在MnNHX1上游、下游引物分别加上BamHⅠ酶切位点、EcoRⅠ酶切位点，进行PCR反应，回收目的片段与pMD19-T载体连接，连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，37 ℃培养后挑选出阳性克隆送华大基因公司测序验证。用BamHⅠ和EcoRⅠ对超量表达载体pLGNL和pMD19- MnNHX1进行双酶切，T₄-DNA连接酶连接回收的目的片段和pLGNL骨架，将构建的超量表达载体pLGNL-MnNHX1转入农杆菌感受态细胞，28 ℃培养后挑选阳性菌斑。

采用蘸花法将构建的超量表达载体pLGNL-MnNHX1转入处于开花期的拟南芥中，黑暗环境中培养1天后转入人工培养箱，收取成熟种子。种子在1/2MS培养基(1/2MS 2.17 g·L^-1+蔗糖30 g·L^-1+琼脂7 g·L^-1，pH6.0)使用卡那霉素(Kan)筛选转基因幼苗，筛选后转入营养土中种植。

提取生长1.5个月的转基因拟南芥幼苗叶片总RNA，并体外反转录为cDNA。以拟南芥ACTIN2基因(Gene ID： 821411)为内参基因(McDowell et al.， 1996)，通过RT-PCR(上游引物序列： 5′-ATCGGAAGAGCAGCATTTATT-3′； 下游引物序列： 5′-TGAGTATGACCTGCCCTTGTA-3′)检测MnNHX1在转基因拟南芥叶片中的表达情况(反应条件为： 94 ℃预变性5 min； 94 ℃变性 40 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环； 72 ℃延伸10 min)。根据RT-PCR试验结果筛选MnNHX1表达差异的转基因植株，收取种子并种植得到T3代种子用于耐盐性鉴定试验。

取野生型(WT)和转基因系T3代种子各100粒，分为2组，消毒(种子消毒液： 500 μL漂渍液加5 μL吐温-20定容于10 mL)后均匀涂布于含有100 mmol·L^-1 NaCl的MS培养基(蔗糖30 g·L^-1+MS 4.33 g·L^-1+琼脂7 g·L^-1，pH6.0)上，于人工培养箱中培养6天后记录其发芽数。

取野生型和转基因系T3代生长1周幼苗各10株，分为2组，平行放置于含有150 mmol·L^-1 NaCl的培养基中，垂直生长10天后观察其根长长度和侧根数目。再取生长1周的幼苗各100株，分为2组，放置于含有200 mmol·L^-1 NaCl的培养基中，每天记录其死亡数。将野生型和3株转基因系种植到同一盆中，并做3次重复，生长4周后，每隔3天浇灌含有200 mmol·L^-1 NaCl的营养液150 mL，浇灌1.5个月后，观察其生长状况。

经克隆分析得到产物长度为1 644 bp的基因序列(图 1)，该基因共编码547个氨基酸残基(图 2)，将其与预测的川桑NHX1基因序列比对分析发现，该基因即为目的基因MnNHX1。ExPASy在线程序预测MnNHX1编码蛋白的分子质量为60.46 kDa，等电点为8.66。TMHMM在线程序对其跨膜结构域的分析表明，MnNHX1为一个典型的跨膜转运蛋白，具有12个明显的跨膜结构区，其中包括2个未完全跨膜区(图 3)，其为NHX重要结构域，与Na⁺结合(张雨良等，2009)。

	图 1 MnNHX1的PCR扩增结果 Fig. 1 PCR amplification of MnNHX1

	图 2 MnNHX1序列和编码的蛋白氨基酸序列 Fig. 2 The coding sequence and deduced amino acid sequence of MnNHX1 方框为氨氯吡嗪脒结合位点，双下划线为糖基化位点，单下划线为跨膜结构域； “*”表示终止密码子。 The coding sequence and deduced amino acid sequence of MnNHX1 amiloride binding sites in box; Glycosylation sites in double underline; Transmembrane domains sites in single underline; “*” indicates stop codon.

	图 3 MnNHX1跨膜结构域预测 Fig. 3 Transmembrane domains forecast of MnNHX1

NHX1蛋白质序列的ClustalX比对结果显示，NHX1蛋白序列具有高度保守区，MnNHX1蛋白序列中含有Na⁺和H⁺转运的关键结构域——Na⁺/H⁺交换泵，这为NHX的典型特征；且在Na⁺/H⁺交换泵上游含有NHX抑制剂氨氯吡嗪脒结合位点(LFFIYLLPPI)(Gaxiola et al.， 2001)以及糖基化位点等结构域(图 4)。

图 4 桑树和其他物种NHX1的多重序列比对 Fig. 4 Multiple sequence alignment of NHX1 from mulberry and other species 单下划线为氨氯吡嗪脒结合位点，方框为Na+/H+交换泵，双下划线为糖基化位点。The amiloride binding sites is shown in single underline. The Na+/H+ exchange pump is shown in box. The glycosylation sites is shown in double underline. Hv： 大麦 Hordeum vulgare (AAS17948)； Os： 稻 Oryza sativa (BAA83337)； Zm： 玉米 Zea mays (AAP20428)； At： 拟南芥 Arabidopsis thaliana (AAT95387)； Bn： 欧洲油菜 Brassica napus (AAO38856)； Ag： 北滨藜 Atriplex gmelini (BAB11940)； Mn： 川桑 Morus notabilis (KJ720637)； Gh： 陆地棉 Gossypium hirsutum (AAM54141)； Gm： 大豆 Glycine max (AAY43006)； Vv： 葡萄 Vitis vinifera (AAV36562)； Pe： 胡杨 Populus euphratica (ACU01852)； Ta： 普通小麦 Triticum aestivum (AAK76738).

从MnNHX1和其他物种的NHX1蛋白序列构建的系统进化树(图 5)中可以看出，NHX1可明显分为单子叶植物(monocotyledons)和双子叶植物(dicotyledons)两大类。川桑的NHX1与来自蔷薇科(Rosaceae)的桃(Prunus persica)首先聚在一起，序列相似度为86%，表明NHX1家族在进化上具有较高的保守性。这一结果与桑树APGⅢ的分类结果(The Angiosperm Phylogeny Group，2009)以及桑树基因组进化分类结果(He et al.， 2013)是一致的。

	图 5 桑树和其他物种NHX1的进化分析 Fig. 5 Phylogenetic analysis of NHX1 in mulberry and other plants 节点值是1 000次重复抽样分析的支持百分率。 The numbers at each node represent the bootstrap values based on 1 000 repetitions.

通过荧光定量PCR试验研究‘湖桑32号’在NaCl胁迫条件下，在不同时间、不同组织中桑树NHX1表达量的变化情况(图 6)。结果表明： 无NaCl胁迫诱导条件桑树NHX1在不同的组织中均有表达，但表达不存在显著性差异； 200 mmol·L^-1 NaCl胁迫处理12 h后，叶中表达量无显著变化，但根、茎中桑树NHX1的表达量显著增加； 胁迫处理24 h后，叶中桑树NHX1的表达量显著升高，基因的表达量提高约40倍； 之后所有组织中表达量都出现回落，但叶中表达量依然最高。以上现象表明，在NaCl胁迫条件下，桑树NHX1在‘湖桑32号’根、茎和叶中的表达均受到NaCl胁迫的诱导，但叶中的表达量变化最为显著。

	图 6 桑树NHX1在NaCl胁迫条件下的荧光定量PCR分析 Fig. 6 Quantitative PCR analysis under salt stress of NHX1 of mulberry 运用LSD方法检验各处理间的差异显著性，柱形图上的字母不同表示有显著性差异(P≤0.05)。 Significance of difference between treatments was determined by LSD method. Different letters above the bars indicate significant difference at P≤0.05.

采用蘸花法将超量表达载体转化至拟南芥中，通过抗生素筛选种子得到27株T1代转基因拟南芥株系。从中随机挑选7株转基因株系，检测MnNHX1在不同转基因拟南芥植株中的表达情况(图 7)。为进一步确定阳性植株，对筛选得到的转基因植株进行GUS染色验证(图 8)。结果显示，在不同转基因株系中，MnNHX1的表达量并不相同，T1、T2号植株表达量较低，T6号植株表达量最高，而T7号植株可能由于转入了空载载体没有检测到基因表达。

	图 7 MnNHX1在转基因拟南芥叶片中表达的RT-PCR检测 Fig. 7 RT-PCR analysis of MnNHX1 expression in leaves of transgenic Arabidopsis thaliana WT： 野生型拟南芥； 1-7： 转MnNHX1拟南芥株系。 WT: Wild-type A.thaliana; 1-7: Transgenic A.thaliana lines.

	图 8 转基因拟南芥的GUS染色 Fig. 8 GUS staining of transgenic A. thaliana

统计种子的发芽率是分析盐胁迫应答的一种有效且快速的方法，植物的低发芽率是一种对高盐环境的适应性表现(Verslues et al.， 2006)。图 9A所示为野生型和转基因拟南芥T3代种子的发芽情况，在相同条件培养7天后，野生型拟南芥(WT)发芽数最多，6号转基因系发芽数最少； 统计学分析结果显示，2号和6号转基因系的发芽率与野生型存在显著性差异(图 9D)。研究结果说明转基因拟南芥种子与野生型种子相比，对高盐环境的适应性更强。

图 9 转基因拟南芥功能验证 Fig. 9 Functional verification of transgenic A. thaliana A： 种子萌发状况； B： 根长和侧根生长状况； C： 高盐生长状况； D： 发芽数和发芽率统计； E： 根长和侧根数统计； F： 死亡数和死亡率统计； G： 转基因拟南芥盐水浇灌。 Line2，Line5，Line6： 转基因拟南芥株系。运用LSD方法检验各处理间的差异显著性，柱形图上的字母不同表示有显著性差异(P≤0.05)。 A: Seed germination conditions; B: Root length and lateral root growth conditions; C: Growth under high salt conditions; D: Statistics of germination and germination rate; E: Statistics of root length and number of lateral roots; F: Statistics of number of deaths and mortality; G: Irrigate salt water to transgenic A. thaliana. Line2， Line5， Line6: Transgenic A.thaliana lines. Significance of difference between treatments was determined by LSD method， and different letters above the bars indicate significant difference at P≤0.05.

根长和侧根数显示了植物在受到NaCl胁迫时获得水源的能力。图 9B所示为野生型和转基因拟南芥T3代植株幼苗在同一盐处理的MS培养基中根长和侧根生长情况，在垂直生长10天后，转基因株系相对于野生型株系在根长和侧根数上都表现出了一定的生长优势，根长和侧根数均大于野生型； 统计学分析结果显示，虽然转基因拟南芥株系与野生拟南芥在根长上没有显著性差异，但是6号转基因株系侧根数显著增多(图 9E)。研究结果说明转基因拟南芥株系在高盐环境中拥有更强获取水源、提供自身生长的能力。

幼苗在NaCl胁迫环境中的成活率是验证植株耐盐性最为直接、有效的方法。图 9C所示为野生型和转基因拟南芥幼苗在同一高盐处理的MS培养基中的生长情况。在培养6天后， 野生型拟南芥植株发白、变黄严重，存活株系叶泽发暗，生长状况差； 而转基因拟南芥有些植株仍缓慢生长，整体成活率较高；统计学分析结果显示，转基因株系的死亡率均低于野生型，其中5号和6号转基因株系与野生型株系相比，死亡率显著降低(图 9F)。转基因拟南芥株系高的成活率表明其在高盐环境中能保持更为优良的性状。

图 9G所示为野生型和转基因拟南芥连续浇灌含高浓度NaCl营养液的生长状态。野生型拟南芥生长出现明显抑制，茎秆短小，叶子发黄、失水萎缩； 而转基因拟南芥植株性状优良，茎秆高长，其中转基因拟南芥6号植株不仅叶子呈嫩绿色、花序完整，而且还结出饱满的种子荚，具有良好的生长和发育能力。研究结果说明转基因拟南芥植株在持续受NaCl胁迫时能保持良好的生存能力。

通过重建离子平衡提高植株忍受盐胁迫的能力是许多物种的耐盐机制(Guan et al.， 2011)，因此NHX基因成为广泛研究并具有开发价值的植物耐盐基因之一。本研究从野生川桑的cDNA中克隆得到1个液泡膜型NHX基因MnNHX1，对其编码的蛋白质预测显示，MnNHX1具有典型的跨膜结构，跨膜区数目与已报道的NHX跨膜区数目相似(10～12)，具有典型的Na⁺/H⁺交换泵结构域。系统进化分析表明，MnNHX1属于液泡膜型NHX，与双子叶植物聚为一类，亲缘关系较近，表明单、双子叶植物NHX在进化上存在差异(唐欣等，2014)。

在单盐胁迫环境中，液泡膜NHX将Na⁺区隔进入液泡中，重建细胞中的离子平衡，达到耐盐效果。本研究发现在对‘湖桑32号’进行NaCl胁迫处理时，其根、茎NHX1在处理早期表达量高于叶中的表达量，随着时间的推移，叶中的表达量上升； 对ZmNHX1(Zoerb et al.， 2005)，ThNHX1(Wu et al.， 2009)，VrNHX1(Sagarika et al.， 2014)的研究也出现类似结果。由于根系是吸收水分或Na⁺进入植株体的最主要器官，而茎是运输离子的主要器官，因此推测这可能是根和茎在短时间NaCl胁迫条件下细胞中桑树NHX1表达量上调的主要原因。而叶片是液泡集中和发挥区隔化作用的主要器官，随着处理时间增长，大量Na⁺进入叶片，这是桑树NHX1在叶中表达量明显提高最主要的原因。

在植株的不同组织中，NaCl胁迫对NHX1诱导的表达模式相似，都是先升高后缓慢降低，诱导表达水平的高低具有组织差异性。本研究发现，在高盐处理12 h后，‘湖桑32号’根中NHX1表达量提高了近4倍，而叶中NHX1表达量出现了下调； 随着处理时间的增长，处理24 h后，叶中NHX1表达量大幅度提高，而根、茎中NHX1表达量出现回落，茎中NHX1表达量水平甚至低于对照。研究结果表明NaCl胁迫诱导不同组织中NHX1表达量高低是存在差异的，这与AtNHX1(Quintero et al.， 2000)，GhNHX1(Wu et al.， 2004)的研究结果相似。

NHX在植物中存在组成型表达和诱导性表达2种形式(张智俊等，2011)。其中诱导型表达受外界环境的影响，只有存在盐胁迫诱导时，才能检测到NHX蛋白的活性； 但组成型表达不受外界环境干扰，在任何条件下都能检测到NHX蛋白持续表达，其中受盐胁迫后NHX蛋白的表达量显著提高。研究发现，拟南芥、水稻(Fukuda et al.， 1999)、玉米、大豆等植物中NHX都为组成型表达。桑树NHX1未进行NaCl胁迫时，在‘湖桑32号’根、茎、叶中都检测到了NHX蛋白的活性，经高盐环境诱导后，表达量显著提高，表明桑树NHX1也为组成型表达。

在高盐胁迫条件下，高发芽率并不与随后生长过程的耐盐性直接相关(Almansouri et al.， 2001； Saleki et al.， 1993)。在大多数情况下，通过ABA抑制种子萌发和初期生长是一种适应性的应答表现，这种机制延迟了早期种子的萌发和生长，减少蒸腾水的丢失，保持自身更好的生长状态(Verslues et al.，2006)。

AtNHX1在拟南芥(Apse et al.， 1999)、番茄(Zhang et al.， 2001)、荞麦(Fagopyrum esculentum)(Chen et al.， 2008)中过量表达，AeNHX1(Qiao et al.， 2007)、MsNHX1(An et al.， 2008)和DmNHX1(Zhang et al.， 2012)在拟南芥中过量表达，可使转基因植株在高盐环境中正常生长，显著提高了植株的耐盐性。本研究结果也显示，将MnNHX1在拟南芥中过量表达后，在连续浇灌含200 mmol·L^-1 NaCl的营养液时，转基因拟南芥表现出良好的生长发育能力。因此，转单一基因能使转基因植株在高盐环境中更好地发育和生长。