2015, Vol. 51
文章信息
- 乌凤章, 王贺新, 徐国辉, 张自川
- Wu Fengzhang, Wang Hexin, Xu Guohui, Zhang Zichuan
- 木本植物低温胁迫生理及分子机制研究进展
- Research Progress on the Physiological and Molecular Mechanisms of Woody Plants Under Low Temperature Stress
- 林业科学, 2015, 51(7): 116-128
- Scientia Silvae Sinicae, 2015, 51(7): 116-128.
- DOI: 10.11707/j.1001-7488.20150713
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文章历史
- 收稿日期：2014-08-30
- 修回日期：2015-03-29
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作者相关文章
低温是主要的非生物胁迫因子之一,限制了许多野生植物和作物的地理分布,降低了生产率。低温胁迫可以分为冷胁迫(0～15 ℃)和冰冻胁迫(< 0 ℃)。起源于热带和亚热带的冷敏感植物,不仅缺乏抗冻锻炼机制,不能在冰冻温度下生存,而且对冰点以上的低温敏感而易受冷害,通常把植物对冰点以上低温的适应能力称为抗冷性。研究表明,冷敏感植物在1~10 ℃的低温胁迫下,会出现水分状况、矿质营养、光合作用、呼吸作用和新陈代谢等生理过程的紊乱,造成冷害甚至死亡。植物对冷胁迫的响应通常表现为膜质组成、抗氧化成分及冷胁迫相关基因的转录速率的改变(Lukatkin,2002)。
一般情况下,来自温带地区的植物,不仅表现出不同程度的抗冷性,而且暴露到较低的非冰冻温度或略低于零度下能提高其抗冻性,保证植物越过寒冷的冬季,通常把这个过程称为抗冻锻炼,而把植物对冰点以下低温的适应能力称为抗冻性。经过抗冻锻炼的植物能够达到一定水平的抗冻性,而未经过抗冻锻炼的植物将会死亡。抗冻锻炼程度与植物生长阶段有一定关系,并与冬季休眠期密切相关。在植物中冬季休眠和抗冻性不仅随季节变化而发展,而且能确保准确的开始和终止。这个过程包括生长暂时停止、光合作用和呼吸作用下调、植物地上器官部分或全部丧失、形成专门的器官(如芽)、积聚冰冻保护物质。 1年生草本植物和多年生木本植物都存在低温锻炼,然而木本植物具有能够在持续长时间低温、极端低温和组织内结冰状况下生存的能力,而1年生草本植物通常不具备这种能力。因此,阐明木本植物在冷胁迫和冰冻胁迫下生存的生理及分子机制,不仅是亟需解决的重大科学问题,而且还具有重要的经济意义。近年来,比较转录组学、蛋白质组学、代谢组学结合抗冷(冻)性突变分析显著增加了对抗(冷)冻锻炼过程的信号通路和重要的分子变化的复杂网络的理解(Janda et al., 2014; Chen et al., 2014)。本文通过讨论木本植物响应和适应低温胁迫采取的代谢策略、提高抗冷(冻)性的主要生理和分子机制,为木本植物抗冻栽培及育种提供重要参考。
1 木本植物的抗冷性 1.1 冷胁迫对植物生长发育的影响植物对冷胁迫的敏感程度与其起源地密切相关,热带或亚热带起源的植物对冷胁迫较为敏感,而温带起源的植物则敏感程度较小。冷害对植物体的损伤程度取决于低温程度和持续时间的长短,损伤的直接表现是叶片呈水渍状或果实上出现斑点,这些生理受损的组织往往易受病菌的侵染或造成局部坏死(Tasumi et al., 1981)。另外,冷害还会造成苗弱、植株生长迟缓、萎蔫、黄化、 坐果率低、产量降低和品质下降等。
1.2 冷胁迫对植物生理代谢的影响处于生长状态的冷敏感植物在冷胁迫下会诱导生理过程,包括水分状况、矿质营养、光合作用、呼吸作用和总代谢水平的改变。冷胁迫可导致冷敏感植物水分损失,引起强烈的萎蔫。这与根系吸收水分并将其输送到枝条能力迅速下降以及在对随后的水分亏缺响应中关闭气孔能力降低有关(Bloom et al., 2004)。植物冷害程度可以通过防止水分状况受到干扰而减轻。
冷胁迫可造成根吸收离子以及离子在植物地上部分移动困难,随着植物中营养元素普遍下降,植物器官之间营养元素的分配被破坏(刘勇等,2014)。冷胁迫可导致植物硝酸盐还原酶的活性降低,减少氨基酸和蛋白质中的氮吸收,使有机磷比例下降、无机磷含量增加,这是磷酸化和有机磷化合物分解增强的结果。冷胁迫还可造成植物呼吸速率降低、富含能量的磷酸盐增加,导致ATP 水平降低(Lawrence et al., 2000)。抗冷植物比冷敏感植物具有更大的温度自我平衡性(Yamori et al., 2009),寒冷减少了幼苗中电子运输的细胞色素途径,增加选择性的呼吸途径,或许这种选择性途径在植物适应冷胁迫过程中发挥了重要作用。这种途径被寒冷信号所触发,随着温度降低而增强,从而导致线粒体中形成的过氧化物含量减少(Hu et al., 2008)。
在冷胁迫期间或冷胁迫后,冷敏感植物光合速率降低,这与温度降低和持续的寒冷时期密切相关,而且将受冷的植物转移到热条件下这种状态会保持较长时间(Strauss et al., 2007)。在冷敏感植物中,光合机构获得的过剩激发能量,导致光抑制和光氧化发生,降低寒冷期间过度光照下的光合活性,表现为叶绿体膜脂质过氧化作用增强,叶绿素、胡萝卜素和叶黄素发生降解(Wang et al., 2008; Kingston-Smith et al., 2000)。
冷胁迫下冷敏植物组织中蛋白质合成急剧下降,通常含量减少。蛋白质合成抑制的结果是游离氨基酸水平增加,特别是脯氨酸水平增加,这被认为是抗冷机制之一。低温降低许多酶的活性,其原因可能是多聚体酶的解体、蛋白质和类脂之间的疏水相互作用失调、酶的动力学性质和变构调节发生可逆改变造成的。在低温下,冷敏感植物保持所有器官中可溶性糖浓度的增加和淀粉含量显著下降(Jouve et al., 1993)。碳水化合物水平的变化与寒冷引起的呼吸作用、光合作用受损和碳水化合物代谢酶的活性变化相关联(Ebrahim et al., 1998)。
1.3 冷胁迫对细胞膜的影响冷敏感植物在低温下发生相变,并从柔性液晶态转变成固体凝胶态,从而导致膜及与膜结合的酶活性的改变。抗冷性植物一般具较高的膜脂不饱和度,可在较低温度下保持膜流动性,维持正常的生理功能,因而抗冷性植物膜脂相变温度低于低温敏感植物; 这种膜脂不饱和度既有遗传稳定的一面,也有随温度降低或诱导的一面。许多植物对低温反应的一种重要表现就是增加不饱和度较高的脂肪酸,如油酸、亚油酸和亚麻酸在总脂肪酸中的比例(陈娜等,2005)。
1.4 植物响应及适应冷胁迫的分子机制 1.4.1 冷信号感知和转导膜是低温信号应答的主要部位,而由膜蛋白识别的质膜流动性改变在其中起主导作用。植物细胞可以感知寒冷诱导的膜流动性及蛋白质构象变化。植物细胞膜感受到低温后,将低温信号通过钙离子、ABA等第二信使将低温信号继续向下游传递,其中钙离子是低温信号转导时重要的第二信使。钙调蛋白称为钙离子感受器,可以通过增加胞质钙离子来传递初级信号,改变不同蛋白质的磷酸化状态。植物中主要的钙感受器有钙调蛋白(calmodulins,CaMs)、钙依赖性蛋白激酶(CaM domain-containing protein kinases,CDPKs)、类钙调磷酸酶B蛋白(calcineurin B-like proteins,CBLs)和互作蛋白激酶(CBL-interacting protein kinases,CIPKs)。这些钙感受器包括感受器中继因子和应答因子,感受器中继因子可与钙离子结合,从而改变构象,调节基因表达。CaM和CBLs应答因子如蛋白激酶和磷酸酶具有的功能域,能够将信息传递到下游目标基因(Klimecha et al., 2007; Reddy et al., 2004),引起基因表达的变化,进而导致适当的生理变化(Sathyanarayanan et al., 2004; Yang et al., 2003)。
促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)链是真核生物信号传递网络中的途径之一。随着胞外的Ca2+流入细胞浆内,MAPK信号通路通过MAP3K-MAP2K-MAPK 依次磷酸化,将上游信号传递给下游应答分子,在基因表达调控和细胞质运动等细胞行为中起关键作用(Nakagami et al., 2005)。
1.4.2 冷响应过程的转录调控植物受到低温胁迫时,会诱导产生一些转录因子,最典型的是 CBF(CRT/DRE binding factor)、锌指蛋白和碱性亮氨酸拉链蛋白(basic leucine zipper,bZip)家族成员等,但对其下游目标相对知之甚少(Knight et al., 2009)。通过转录因子的转录调控作用激活一系列与低温逆境相关功能基因的表达来提高植物整体的低温抗性。低温响应转录调控的大致途径为: 低温信号被膜感知,并传递到不同的信号转导组分,导致对一些基因转录的刺激,加强低温信号和控制低温调节基因的表达。根据这一通路对CBF转录因子的依赖与否可以分为CBF途径和非CBF途径。转基因分析表明,CBF可以充分激活下游COR基因的表达,并且当组成性表达时常温就能诱导低温锻炼(Jaglo-Ottosen et al., 1998)。CBF除了调控下游基因的表达外,也受到上游一些转录因子的调节。研究显示,植物体内存在2条途径调节CBF基因的表达：一条为钙离子信号途径(Thomashow,2010)。质膜感受到冷信号,通过改变胞质中的三磷酸肌醇(IP3)含量,诱导胞质内钙离子的积累,迅速增加的钙离子与钙调蛋白结合转录因子(CAMTA3)形成复合物,通过CAMTA3与CBF2启动子上CG-1元件结合,激活CBF的表达。另外一条途径是ICE1(inducer of CBF expression 1)-CBF-寒冷响应途径。ICE1是类似MYC的bHLH转录因子,可特异地结合到CBF3启动子的MYC作用元件,激活CBF3的表达,表达产物CBF结合到多种寒冷和脱水应答基因,包括它们自己启动子的CCGAC核心基序上(Stockinger et al.,2007),进而诱导这些功能基因表达,最终使植物获得低温耐受能力。除了拟南芥(Arabidopsis thaliana)中存在ICE-CBF调节途径外,在苹果(Malus domestica)和橡胶树(Hevea brasiliensis)也具有这种保守途径(Feng et al.,2012; 王祥军等,2012)。在非CBF途径转录调控中,已知的逆境相关类转录因子,如MYB类、NAC类和bZIP类转录因子均参与低温抗性反应。
1.4.3 冷胁迫响应基因及表达产物在冷胁迫下植物中基因表达也发生一系列变化,大量的基因被诱导。这些基因的表达产物主要分为2类: 一类为上述的调控蛋白；另一类为功能蛋白。它们直接参与植物抗逆反应,提高植物的低温耐性。这组基因编码的蛋白包括胚胎后期丰富蛋白(LEA)、热休克蛋白(HSPs)、渗透调节物质的生物合成所需的酶、防冻剂和解毒蛋白质。LEA和热激蛋白是胁迫诱导的2个主要蛋白质,在水、盐分和极端温度胁迫下积累,在胁迫过程中起保护细胞作用(Renaut et al.,2006)。已经证明LEA广泛存在于植物对干旱、寒冷及渗透引起的水分亏缺的响应中,二级结构预测表明LEA以任意的双螺旋结构存在,通常在胚胎发生晚期过程中合成,且大部分成员都是由相对简单的氨基酸组成的亲水分子,这类冷应答基因主要包括 COR15a,COR47,COR6.6 和COR78/RD29等(Mahajan et al., 2005)。COR15a的表达产物可调节脯氨酸和某些糖类物质的合成,超表达植株在应答低温胁迫后膜中六角形Ⅱ期脂质的形成下降,因而膜的损害程度减少,提高了植物对低温的耐性。HSPs用以防止细胞内冷敏感蛋白三级或四级结构的破坏。如芸薹属(Brassica spp.)植物在5 ℃低温处理后,体内积累较多的Hsp90； 番茄(Lycopersicon esculentum)和菠菜(Spinacia oleracea)在低温下产生一类Hsp70家族蛋白。这些蛋白类分子伴侣可在低温条件下调节蛋白质的折叠和运输,恢复钝化酶的活性(Li et al., 1999)。植物脱水蛋白具有高度的亲水性和热稳定性,在低温胁迫下,它们在膜下积累像黏胶拉链一样结合于大分子表面,以保护大分子的结构和活性(Wisniewski et al.,2006)。表 1为已鉴定的一些冷胁迫诱导基因或蛋白质。
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近年来,对冷敏感植物低温锻炼提高抗冷性的生理机制进行了大量研究。戴金平等(1991)研究表明,黄瓜 (Cucumis sativus) 幼苗在低温锻炼后SOD,CAT和POD活性显著提高,并在逆境胁迫时保持稳定,提高了它们对氧自由基和过氧化氢的清除作用。 陆地棉(Gossypium hirsutum) 幼苗经适当的低温锻炼后,在冷胁迫下蛋白质含量和种类都有明显的变化,而且都有低温诱导蛋白产生； 在临界生长温度(12 ℃)下锻炼后的棉苗能耐受较长时间(7天)的低温(4 ℃)冷胁迫,幼苗脯氨酸含量最高,其抗冷性比对照明显提高(范月仙等,2011)。番茄幼苗经12 ℃锻炼7天、甜玉米 (Zay mays) 种苗经11 ℃锻炼8天或15天后,较常温下(26 ℃/21 ℃)生长的苗木脯氨酸含量显著增加,质膜Ca2+-ATPase在2 ℃冷胁迫后仍保持高活性；而未经锻炼的种苗在同样低温处理后,质膜Ca2+-ATPase活性丧失,遭受冷害,即通过低温锻炼对2 ℃低温胁迫的抗性明显提高(简令成等,2005)。冷敏感拟南芥基因型经过低温锻炼后,合成了低相变温度的脂类,增加了膜不饱和脂肪酸的组成(Provart et al., 2003)。
冷胁迫下,不同冷敏感植物基因表达谱不同。Provart等(2003)鉴定了634个冷致死拟南芥突变体冷响应基因,包括与脂质代谢、叶绿体功能、糖代谢、自由基解毒相关的基因。Wang等(2013)用转录组学方法分析了冷敏感树木麻疯树(Jatropha curcas)暴露于12 ℃低温下基因表达的变化,其中上调基因有: 1)脂肪酸不饱和性相关基因——编码△9-硬脂酰ACP去饱和酶(△9-stearoyl-ACP desaturase,SAD)与△12-脂肪酸脱氢酶(△12-fatty acid desaturase,FAD2)基因; 2)抗氧化相关基因——编码过氧化物酶(POD)、锌超氧化物歧化酶(SOD)、脱氢抗坏血酸还原酶(dehydroascorbate reductase,DHAR)和谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase,GR)基因; 3)渗透相关基因——编码半乳糖苷、棉子糖和肌醇合成酶基因; 4)亲水蛋白相关基因——编码LEA-5基因、编码RNA结合蛋白(RNA-binding protein,RBP)基因; 5)信号转导相关基因——编码转录因子MYB15和CBF基因。
冷敏感树木木薯(Manihot esculenta)幼苗抗冷锻炼研究表明,编码与氧化还原调节有关的ROP interactive partner 3的基因、编码小分子营养代谢有关的核糖体蛋白L11和泛素6的基因、类RmlC cupins家族蛋白的基因和编码转录因子CBF同系物的基因在4 ℃或14 ℃条件下与对照24 ℃相比表达上调,这在一定程度上提高了木薯的抗冷性,使木薯能够在4 ℃条件下生存至少5天(Zeng et al., 2014)。
综合上述研究表明,冷敏感植物通过抗冷锻炼,感知寒冷信号,在转录水平通过转录因子CBF等调控作用,诱导抗冷相关基因的表达,提高膜不饱和脂肪酸、渗透物质含量、营养维持物质和抗氧化酶活性,从而提高抗冷性。
2 木本植物的抗冻性发生在晚秋和早春的霜冻和冬季极端低温限制了树木的可持续生长,通过确定适宜的树木栽植地点、选择抗冻树种和使用适宜的栽培技术能够降低生产损失,但在冬季寒冷气候区冻害对于树木生长是一个长期存在的问题。抗冻性是植物生存于低于冰点温度的能力,是一个响应于波动环境的活跃性状,依赖于基因型的抗冻锻炼和休眠的定时、仲冬抗冻性大小、脱锻炼的速度、再锻炼的能力和芽萌的定时。许多温带物种已经逐步进化了一种能力,即在秋季长时间寒冷但不结冰温度和光周期变化条件下增加它们的抗冻性(Thomashow,1999; Catala et al., 2011)。这种诱导过程被称为抗冻锻炼,最终保证植物安全越冬,使其在随后的春天成功地再生。木本植物抗冻锻炼过程包括2个阶段(Weiser,1970): 第一阶段,在初秋开始加强锻炼,被短日照和冰点以上的低温诱导生长停止和休眠发展； 第二个阶段,直接暴露在冰点或略低于冰点温度下,一些未知因子能帮助抗冻锻炼。当锻炼结束时,植物的抗冻性达到最大水平(Li et al., 2002)。一些树木细胞经完全抗冻锻炼后可以耐受-50～-100 ℃的低温,这就是所谓的过度冷却现象。这种现象存在于榆树(Ulmus pumila)、枫香树(Liquidambar formosana)、山毛榉(Fagus sylvatica)等物种中(Burke et al., 1979)。
抗冻性是一个非常复杂的性状,包括抵抗低温对植物功能的直接影响和因冰晶形成造成的间接影响的能力。寒冷条件直接影响改变生物热力学过程、生物分子的稳定性和功能及改变正常细胞过程,如光合作用、胞间及胞内运输和有毒的活性氧ROS形成与清除之间的平衡(Thomashow,1999)。植物冻害的机制主要是结冰伤害、引起蛋白质损伤的巯基假说和对膜的伤害。胞间结冰对植物的伤害比胞内结冰更大,主要原因是: 1)胞间结冰导致原生质过度脱水,造成蛋白质变性或原生质发生不可逆的凝胶化; 2)冰晶引起细胞的机械损伤; 3)解冻过快对细胞的重大损伤(李美如等,1996)。植物在抗冻锻炼过程中通常能被诱导产生一系列抗冻防御反应。图 1为木本植物冷响应基因调节过程示意图。植物抗冻机制主要体现在以下几个方面。
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图 1 木本植物冷响应基因调节过程 Fig. 1 Diagram showing regulation of cold responsive genes in woody plants ABA：脱落酸； APX：抗坏血酸过氧化物酶； CBF：C重复序列结合因子； COR gene：冷调节基因； GR：谷胱甘肽还原酶； Hsp：热激蛋白； LEA protein：胚胎发育晚期丰富蛋白； MAPKs：促分裂素原活化蛋白激酶； SOD：超氧化物歧化酶。 ABA：abscisic acid; APX：ascorbate peroxidase; CBF：Crepeat binding factors; COR gene：cold regulated genes; GR：glutathione reductase; Hsp：heat shock protein; LEA protein：late embryogenesis abundant protein; MAPKs：mitogen activated protein kinases; SOD：superoxide dismutase. |
抗冻锻炼涉及植物生物化学及生理学状态的重大变化,从而改善对低温胁迫的抗性。一般情况下,蛋白质和各种保护性功能化合物增加,而光合作用和几个其他代谢相关的生化途径被抑制(Rudi et al.,2010; Winfield et al., 2010)。植物通过进化形成操纵冰晶形成的能力,这是通过降低凝固点(热滞后)或通过抑制冰再结晶实现的(Byard et al.,2010),β-1,3-葡聚糖酶、WRKY蛋白、几丁质酶和类甜味蛋白等参与了上述反应。抗冻锻炼期间植物获得改变膜稳定性的能力,这涉及膜脂类成分组成及分配比的改变,表现在细胞内不饱和脂肪酸和磷脂的含量增加,使膜脂的相变温度降低、细胞膜的流动性增强,提高植物的抗冻性(Moellering et al.,2010)。 通过脂质代谢及膜脂成分的遗传操纵提高了转基因杨树(Populus alba×P. gl and ulosa)(Zhou et al.,2009)的抗冻性。抗冻锻炼期间生成与膜相互作用起保护作用的碳水化合物(Valluru et al., 2008),其含量随组织锻炼的状态而变化。在木本植物组织中抗冻锻炼期间,淀粉浓度降低,可溶性糖浓度提高(Dhanaraj et al.,2004)。尤其是低聚糖棉子糖和水苏糖与抗冻性、低温和休眠紧密相关,但蔗糖也提高木本植物芽的抗冻力。除了碳水化合物外,木本植物在响应渗透胁迫时还积累相容性溶质或渗透调节物质。相容性溶质的功能是维持细胞膨压,也可以通过稳定细胞膜和蛋白质起自由基清除剂或分子伴侣作用。渗透调节物质分为三大组： 氨基酸(如脯氨酸)、季胺(甘氨酸、甜菜碱等)和多元醇/糖(甘露醇)。在转基因植物中,渗透调节物质的过度表达能提高抗逆性(Diamant et al.,2001)。寒冷气温也使植物遭受活性氧诱导的氧化胁迫,因此,抗氧化酶(抗坏血酸过氧化物酶、谷胱甘肽还原酶、超氧化物歧化酶和其他)激活,参与自由基的清除。抗氧化酶的活性由低温诱导,并在冰冻引起的伤害恢复中起重要作用(Renaut et al., 2006)。
2.2 木本植物抗冻分子机制人们对自然环境和人工控制环境下植物抗冻锻炼进行了大量观测和研究,结果表明,植物通过感知短光周期和/或低温信号,诱导一系列低温诱导基因表达,表达产物参与上述生理代谢过程而获得对冰冻温度的抗性。树木抗冷锻炼和抗冻锻炼的机制和代谢途径有许多相似之处,但后者可能更复杂,因为它需要面对极端的低温和不正常的温度波动。
2.2.1 脱落酸参与抗冻锻炼ABA是调节基因的主要参与者,通过ABA依赖的转录因子的转录激活参与植物胁迫响应基因的调节(Shinozaki et al., 2000)。这条途径可能通过与CBF1,CBF2和CBF3 分子的同源体CBF4 分子与下游基因的作用,提高植物的抗冻性。与前者不同的是,CBF4受干旱和ABA诱导,对低温的诱导反应不明显。CBF4 也是通过靶基因CRT/DRE 顺式作用元件调节相关胁迫基因(如COR15a,COR78a等)的表达而增强植物抗逆性。许多证据表明在自然条件下ABA在低温锻炼中的作用：首先,低温条件下,拟南芥内源ABA水平增加(Cuevas et al., 2008); 其次,外源ABA的应用能增强整个植物抗冻性(Mantyla et al., 1995); 第三,低温锻炼中的许多基因表达都受ABA调控,包括CBF基因(Agarwal et al., 2010)。
2.2.2 抗冻锻炼期间诱导的基因及表达产物在抗冻锻炼期间,特异基因表达会引起特定的蛋白质的积累。如一些作为分子伴侣的热激蛋白的合成出现上调,与热胁迫的调节方式一致,表明冷和热2种胁迫下都伴随着蛋白质的去稳定性,这种稳定蛋白质结构的机制,对于植物生存是非常重要的。
抗冻蛋白(antifreeze protein,AFPs)是另外一类冷胁迫诱导表达的蛋白质,通常含有多个亲水性冰晶结合域,并具有较强的抑制冰晶重结晶活性。包括2种类型：一种为PR-AFPs,在低温诱导下具有抗病和抗冻双重功能,如内切壳多糖酶和内切葡聚糖酶。目前发现含PR-AFPs的植物主要包括黑麦(Secale cereale)、欧白英(Solanum dulcamara)、胡萝卜(Daucus carota)(李文轲等,2012)、高丛蓝莓(Vaccinium corymbosum)(Kikuchi et al., 2009)、葡萄(Vitis riparia)(Mathiason et al., 2009)等。此外还有一些其他类型的AFPs,包括沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)、白松(Pinus monticola)、甜杨(Populus suaveolens)等。
在低温诱导的蛋白质中,一些与渗透胁迫有关,包括与渗透剂合成有关的蛋白质、膜稳定蛋白(如脱水蛋白以及LEA蛋白)上调。由于胞外冰晶的存在,在胞内产生明显的渗透胁迫,所以防御冰冻胁迫也需要一些类似的处理渗透胁迫的方法。苹果叶片脱水蛋白基因 MdDHN2,MdDHN4,MdDHN6和MdDHN8在低温锻炼期间上调(Liang et al., 2012),其中 MdDHN2也存在于仲冬时期树皮和花芽以及低温诱导下的树皮中(Garcia-Banuelos et al., 2009; Wisniewski et al., 2008)。许多木本植物在抗冻锻炼及含水量减少条件下脱水蛋白上调(Sarnighausen et al., 2004; Welling et al.,2004; Wisniewski et al.,2006)。这些结果表明脱水蛋白在树木冬季存活机制中具有重要作用,但这种渗透保护和抗冰冻的确切机制还不清楚。
2.2.3 抗冻锻炼期间转录因子调节基因表达CBF基因在热带、亚热带植物和温带木本植物中广泛存在,具有保守结构和功能。Zhang等(2004)分析8 700个番茄基因时发现,受 LeCBF1和AtCBF3诱导表达超过2.5倍的仅有4个基因,其中3个属于受CBF调控基因,包括2个脱水蛋白基因和1 个可能编码蛋白酶抑制剂的基因,而属拟南芥CBF调节的棉子糖合成酶、脯氨酸合成酶和转录因子RAP2.1 均不在番茄CBF调控基因之列,这说明冷敏感植物和抗冻植物CBF冷应答途径是不同的。甜樱桃(Prunus avium)CBF同源物(PaCBF)能够提高拟南芥的抗冻性(Kitashiba et al., 2004); 与南方冷敏感品种相比,北方抗冻性强的高丛蓝莓品种中的一个 BB-CBF基因在抗冻锻炼的早期高水平表达(Polashock et al.,2010)。此外,BB-CBF在非低温锻炼的南方冷敏感品种花芽和叶片中过表达,使其抗冻性提高; 一个苹果 DREB/CBF基因与拟南芥DREB2B相似,在寒冷、干旱、热和ABA处理2 h之内上调,8~24 h之间表达量明显提高(Zhao et al.,2012)。这些研究都表明CBFs 在树木中存在,且与模式植物拟南芥中已经展示的低温响应途径相似；但二者的抗冻锻炼有所不同,木本植物的抗冻潜力更大,而且抗冻锻炼机制也更复杂(有季节性抗冻锻炼和休眠现象),所涉及的基因也有差别。
2.3 木本植物抗冻锻炼期间转录组、蛋白质组和代谢组变化为了更好地获得对植物抗冻过程的理解,开发提高抗冻性的技术策略,在进行基因组学研究的同时需要辅之以转录组学、蛋白质组学和代谢组学研究(Guy et al., 2008)。近年来,木本植物中相关研究进展较快。
2.3.1 木本植物抗冻锻炼的转录组学转录组学是在RNA水平上研究生物体中各基因转录情况及其调控规律、用以阐明生物表型与功能的一门科学。转录组可定量分析生物受外界环境影响的各个基因表达的变化,主要检测的是生物体RNA水平的基因表达量。目前最主要的2个检测技术为基于杂交的基因芯片技术(microarray)和基于第2代深度测序的RNA测序技术(RNA-Seq)。Pang等(2013)将沙冬青幼苗在4 ℃和20 ℃处理14天后,首次利用Illumina/Solexa技术研究非模式物种抗冻锻炼后基因表达情况,鉴定的上调基因包括： 编码脂肪酸去饱和酶(fatty acid desaturase,FAD)基因、吡咯啉-5-羧酸合成酶(delta 1-pyrroline-5-carboxylate synthetase,P5CS)基因、与蔗糖和其他单糖合成相关的基因、LEA基因、抗氧化酶CAT/SOD基因、信号转导相关的依赖蛋白激酶(calcium dependent protein kinase,CDPKs)基因、激活ABA功能的SnRK2蛋白激酶基因、在保卫细胞中具ABA信号功能的磷脂酶Dα1(PLDα1)、磷脂酶β1(PLDβ1)和磷脂酶Dδ(PLDδ)基因、转录因子ERF/WRKY/CBF基因。
Chen等(2014)将2年生胡杨(Populus euphratica)苗木分别置于4 ℃和-4 ℃条件下处理6 h后,使用Solexa测序技术完成了样品叶片转录物组的测序,并对大量的早期冷响应基因进行鉴定,表明转录因子、与ABA及钙信号传导相关的关键转录成分在胡杨低温响应中可能发挥重要作用。
Wang等(2013)鉴定了茶树(Camellia sinensis)在自然越冬条件下抗冻锻炼后差异表达基因,包括传感器或信号因、低温应答转录因子基因、质膜稳定相关基因、渗透应答基因和解毒酶基因。路径分析表明,“碳水化合物代谢途径”和“钙信号通路”可能在茶树应对冰冻胁迫中发挥至关重要作用。上述研究表明在抗冻锻炼过程中,抗冻性强的树木沙冬青和胡杨关键转录成分主要与ABA及钙信号传导相关,而在抗冻性较弱的茶树中“碳水化合物代谢途径”和“钙信号通路”相关基因起主要作用。
在自然环境中,影响植物越冬生存的环境因子不仅仅是气温,光也是一个可能成为胁迫的因素,它可能导致光氧化损伤(Arora et al., 2011)。早期光诱导蛋白(ELIPS)是核编码、光胁迫诱导的蛋白质,位于类囊体膜,属于叶绿素a/b结合蛋白家族,在植物中广泛分布。ELIPs作为临时色素载体或作为过量激发能储存、耗散场所来发挥光保护作用(Adamska et al., 2001)。在高丛蓝莓花芽(Die et al., 2014)和杜鹃(Rhododendron catawbiense)叶(Peng et al., 2008)中发现低温锻炼高度诱导的ELIP基因,支持了ELIP在冬季植物组织中对高光胁迫适应机制中的重要作用。
2.3.2 木本植物抗冻锻炼的蛋白质组学研究近年来,有关树木对低温胁迫响应的蛋白质组学研究逐渐增多。Renaut等(2004)研究了低温对杨树(Populus tremula× P. tremuloides)蛋白质表达的影响。以在23 ℃条件下生长的植株为对照,分析了3个月的杨树暴露于4 ℃低温下7,14 h时叶片蛋白质组的变化,鉴定了26个蛋白质。其中在逆境条件下,新出现或表达量上调的蛋白质包括分子伴侣、热激蛋白、脱水蛋白和其他胚胎发育晚期丰富蛋白等,并发现4 ℃条件下消失或表达量下调的蛋白质主要是与能量代谢有关的蛋白。
本文作者所在研究组前期研究检测了旺盛生长的白桦(Betula platyphylla)幼苗在4 ℃处理当天、4和14天的蛋白质凝胶图谱,鉴定了15个差异表达蛋白质,它们主要参与信号转导(钙调蛋白)、光合作用、碳氮及能量代谢、应激相关(过氧化物还原因子)等。
Kjellsen等(2010)通过质谱鉴定出43个西伯利亚云杉(Picea obovata)响应低温胁迫的蛋白,在自然抗冻锻炼期间积累的蛋白包括脱水蛋白、Hsps70、脂质运载蛋白、亲环蛋白、富含甘氨酸蛋白和几个活性氧中间体清除蛋白。
此外,国内外学者先后对桃(Renaut et al., 2008)、杏(Prunus armeniaca)(Zhuang et al., 2012)、山桑(Morus bombycis)(Ukaji et al., 2004)、小沙冬青(Ammopiptanthus nanus)(Lu et al., 2010)、北海道黄杨(Euonymus japonicus‘Cuzhi’)(郝强等,2011)和欧洲山杨(Populus tremula)无性系(Sergeanta et al., 2014)抗冻锻炼后蛋白质组进行了分析,上述研究证实了以前从一维SDS-PAGE或基因表达中已经获得的冷诱导蛋白数据,如PR蛋白、防御、细胞结构、氨基酸、木质素代谢和信号转导相关蛋白、热休克蛋白、脂质运载蛋和LEA等上调,与能量代谢相关蛋白上调或下调。
2.3.3 木本植物抗冻锻炼的代谢组学研究代谢组学提供了全面的代谢产物水平的整体变化轮廓,其水平可能是酶的活性和在转录水平基因调控的结果,这些新兴技术的初步应用有益于确定与冷胁迫相关的新的代谢产物和途径(Guy et al., 2008)。目前相关研究以模式植物拟南芥为主,木本植物研究处于起步阶段。
具有高的低温锻炼能力的拟南芥基因型Ws-2在低温锻炼期间114个代谢物显著提高,而在较低的低温锻炼能力的基因型Cvi-1中只有47个代谢物增加,这表明低温锻炼的能力依赖于冷诱导代谢组中代谢物的整体变化(Cook et al.,2004)。Benina等(2013)使用GC-MS进行低温(4 ℃)下巴尔干苣苔(Haberlea rhodopensis)、盐芥(Thellungiella halophyla)和拟南芥代谢组分析比较,表明低温锻炼期间糖、有机酸、多羟基化合物的积累构成了巴尔干苣苔主要代谢防御机制,而氨基酸和氨基酸衍生物的积累有助于拟南芥和盐芥的低温锻炼。这些结果表明,3个物种在环境温度胁迫下代谢物组和对低温响应策略存在本质差异。
Angelcheva等(2014)通过对西伯利亚云杉在自然条件下充分低温锻炼的针叶与抗冻锻炼前的针叶代谢组差异分析,发现223个代谢产物积累、52个降解,棉子糖家族寡糖、糖酸和糖醇、去饱和脂肪酸、二半乳糖甘油合成和积累增加,蛋白质和非蛋白氨基酸和多胺积累增加。这说明碳水化合物、氨基酸、多胺和脂质代谢相关的代谢物在西伯利亚云杉对极端低温快速适应中发挥重要作用。
此外,低温胁迫代谢组学的研究结果表明,许多植物中碳水化合物的代谢作用是一致的,似乎这是寒冷胁迫下代谢组重新编程的主要特征(Guy et al., 2008)。尽管代谢组学虽然能检测大部分低温胁迫响应的代谢物质,但仍然有些胁迫响应的代谢物质、代谢途径未被发现,代谢途径间的联动机制仍有待于进一步研究。
2.4 与木本植物休眠有关的DAM基因表达短光周期和低温诱导休眠相关的MADS Box genes(DAM)表达。DAM基因家族包括6个基因(Bielenberg et al.,2008)。若敲除桃成熟芽体中的6个DAM基因,在短日照条件下,芽不能进入生理休眠(Bielenberg et al., 2004),而且长时间的寒冷温度抑制这些基因的表达(Sasaki et al., 2011)。因此,DAM基因被认为在冬季休眠诱导、维持以及解除过程发挥作用。在野外及人工控制的短光周期条件下,5个桃树DAM (DAM1,DAM2,DAM4,DAM5和DAM6)基因被诱导表达,而且DAM6表达水平最高；DAM1和DAM2 在野外条件下休眠诱导时期表达,DAM5和DAM6在仲冬表达水平最高,表明它们具有维持休眠作用；DAM3在低温调节下出现,在整个冬季减少,可能在解除休眠中发挥作用(Bielenberg et al., 2008)。MAD-box 转录因子的一些成员,例如Flowering Locus C(FLC)和Short Vegetative Phase(SVP),参与拟南芥开花应答的温度调控,也能够调控多年生木本植物的芽休眠(Hemming et al., 2011; Lee et al., 2007)。在枳类和乳浆草的生理休眠过程中,它们上调表达,并且在生理休眠解除后,表达量下降(Zhang et al.,2009; Dogramaci et al., 2010)。
3 结论与展望对于来源于热带、亚热带的植物而言,表现出对冷胁迫敏感的特性。冷胁迫会造成植物水分状况改变,营养吸收能力减弱,呼吸作用减弱,引起光抑制,造成光合效率降低、生理代谢异常、膜结构和膜成分改变,易遭受冷害。冷敏感植物通过低温锻炼,诱导抗冷相关基因表达,表达的蛋白质和代谢物质主要参与抗氧化、膜稳定及渗透调节作用,从而提高植物抗冷性。温带树木随日照变短和温度降低开始发展抗冻性,通过暴露在冰点及略低于冰点度的温度,获得更高水平的抗冻锻炼,但在春季气温升高时抗冻力下降。分子生物学研究已从冷信号的识别、转导、信号级联放大、响应等方面对木本植物低温信号传递网络进行了一定深度的剖析,木本植物中一些参与抗冻锻炼基因(如CBF / DRE基因、抗冻蛋白基因以及脱水蛋白基因)和生理休眠相关基因(DAM基因)已经从特定植物谱系的持续进化中而逐渐形成。但对低温胁迫下相关分子应答途径、基因转录调控方面的研究还不够深入。低温会引起代谢过程及大量产物的变化,对于调控这些过程的转录因子及关键功能基因、相关交叉信号途径的全面了解与解析,将有助于林木抗冷(冻)新品种的培育。季节性光照变化及温度降低诱导类似的信号过程和相关的靶基因表达,但对木本植物感受和转导信号的机制以及休眠和抗冻的确切分子机制尚不是很清楚。ABA与Ca2＋信号转导途径如何协同作用将寒冷胁迫信号传递到细胞核的转录因子,转录因子如何调控抗冻基因的表达,抗冻基因又是如何发挥抗冻活性等的分子机制等仍需深入研究。
近年来,随着新一代高通量DNA测序技术的快速发展,RNA测序(RNA-seq)已成为基因表达和转录组分析新的重要手段。目前,已对冷敏感树木及抗冻树木对低温胁迫的响应及适应过程的转录组进行了较多的研究,鉴定了许多低温胁迫基因,增加了对树木抗冷(冻)机制的进一步了解。木本植物低温诱导蛋白质的研究已取得一些进展,已鉴定和发现了一大批响应低温胁迫的相关蛋白,取得了许多有价值的研究成果,为基于蛋白质组水平解释植物响应和适应低温胁迫过程中的分子机制提供了新的理论依据,拓展了对于木本植物抗冷(冻)分子机制的认识,但迄今对大多数低温诱导蛋白质功能及其表达机制仍不清楚。植物对低温胁迫的应答是一个非常复杂的体系,涉及到一系列的信号转导、基因调控、蛋白修饰和代谢调节等细胞途径,未来使用蛋白质组学方法应与遗传学、生物化学、基因组学、转录组学技术相结合,开展木本植物对低温响应的研究,将更深入地阐明重要蛋白质表达机制和功能,完整地提供木本植物如何应对它们生存环境的表现。目前利用低温胁迫代谢组学技术检测到许多低温胁迫响应的代谢物质,但局限于模式植物拟南芥及一些作物种类,对木本植物研究的很少。未来代谢组学的研究应在揭示木本植物低温胁迫响应和适应机制中发挥应有的重要功能。
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