柿(Diospyros kaki)属于柿科(Ebenaceae)柿属(Diospyros)植物，是我国重要的六大木本粮油树种之一，具有重要的经济、生态和社会价值(李树钢，1987；何方等，2004)。柿适生能力强，分布范围广，除西藏、新疆、青海、内蒙古、黑龙江、吉林6省(区)外，其他地区均有栽培与分布(左大勋等，1984；宗学普，2002)。柿种质资源数量繁多，存在丰富的遗传变异，中国现有品种1 000多个，居世界首位(李高潮等，2006)。虽然已经有学者对柿种质资源进行了遗传多样性研究，但是其试验材料主要是甜柿资源，然而我国除了大别山区有极少数甜柿分布外，其他各地柿资源均为涩柿(张青林，2006；郭大龙，2006；杜晓云，2008)。河南省是涩柿五大主产区之一，在全国柿分布区中占据重要地位，据农业部2011年统计，河南省柿产量约43万t，居全国第3位，该省西部属于秦岭东部余脉伏牛山区，拥有丰富的柿种质资源(丁向阳等，2001；韩德波等，2010)，但是这些资源管理粗放，品种混杂，存在非常严重的同名异物或同物异名现象。目前未见关于河南省柿种质资源遗传多样性的研究报道。分子标记是分析物种多样性的常用方法，其中SSR(simple sequence repeat)，即简单序列重复，又称微卫星，广泛分布于植物基因组中，具有数量多、多态性高、稳定性好、操作简单等优点，已广泛应用于植物遗传多样性研究(周炎花等，2011；黄平等，2012)。需特别注意的是，在进行多倍体植物遗传多样性分析时，许多常规的计算公式或者软件并不适用，因为它们基本都是针对二倍体和单倍体开发的。已有报道显示，利用SSR引物可对多倍体柿进行PCR扩增，将此共显性标记转化成简单有效的显性标记(等同于基因组DNA片段的PCR扩增技术)，可有效进行多倍体柿遗传多样性分析(Naval et al.，2010)。本文在河南省各地柿种质资源调查收集的基础上，利用已发表的众多SSR引物，对来自不同地区的102份材料进行PCR扩增，分析资源的遗传多样性及亲缘关系，并进行种质资源鉴定，判断同名异物或同物异名品种，以期为河南省柿种质资源的合理保存、有效利用及杂交育种等工作提供科学理论依据。

以柿属植物6种、1变种共计102份种质资源为材料(表 1)进行试验，其中来自河南省各地柿种下资源93份，包括各地主栽品种、农家品种及野生资源，另外选取了9份材料作对照，包括柿变种(野柿 D. kaki var. sylvestris)、柿近缘种(君迁子D. lotus、浙江柿D. glaucifolia、油柿D. oleifera、美洲柿D. virginiana)及金枣柿(D. spp.)。春季在中国林业科学研究院经济林研究开发中心柿种质资源圃内采集刚展开的幼嫩叶片，液氮保存带回实验室，-70 ℃贮藏以备提取DNA。

表 1 试验材料类型及其来源 Tab.1 Types and origins of the materials analyzed

表 1 试验材料类型及其来源 Tab.1 Types and origins of the materials analyzed 序号No. 种质名称Name of the germplasms 类型Types 产地Origins 1 ‘大火罐’ D. kaki ‘Dahuoguan’ 农家品种Local cultivar 洛阳Luoyang 2 ‘小火罐’ D. kaki ‘Xiaohuoguan’ 农家品种Local cultivar 洛阳Luoyang 3 ‘早熟柿’ D. kaki ‘Zaoshushi’ 农家品种Local cultivar 洛阳Luoyang 4 ‘小镜面糊卵’ D. kaki ‘Xiaojingmianhuluan’ 农家品种Local cultivar 洛阳Luoyang 5 ‘小面糊’ D. kaki ‘Xiaomianhu’ 农家品种Local cultivar 洛阳Luoyang 6 ‘面糊卵’ D. kaki ‘Mianhuluan’ 农家品种Localcultivar 洛阳Luoyang 7 ‘面窝窝’ D. kaki ‘Mianwowo’ 农家品种Local cultivar 洛阳Luoyang 8 ‘磨盘柿’ D. kaki ‘Mopanshi’ 农家品种Local cultivar 洛阳Luoyang 9 ‘树梢黄’ D. kaki ‘Shushaohuang’ 农家品种Local cultivar 洛阳Luoyang 10 ‘羊烘烘’ D. kaki ‘Yanghonghong’ 农家品种Local cultivar 洛阳Luoyang 11 ‘遮叶’ D. kaki ‘Zheye’ 农家品种Local cultivar 洛阳Luoyang 12 ‘朱皮柿’ D. kaki ‘Zhupishi’ 农家品种Local cultivar 洛阳Luoyang 13 ‘花疙瘩’ D. kaki ‘Huageda’ 农家品种Local cultivar 栾川Luanchuan 14 ‘栾川八月黄’ D. kaki ‘Luanchuan-Bayuehuang’ 主栽品种Major cultivar 栾川Luanchuan 15 ‘栾川出头柿’ D. kaki ‘Luanchuan-Chutou’ 农家品种Local cultivar 栾川Luanchuan 16 ‘栾川牛心’ D. kaki ‘Luanchuan-Niuxin’ 主栽品种Major cultivar 栾川Luanchuan 17 ‘水葫芦’ D. kaki ‘Shuihulu’ 农家品种Localcultivar 栾川Luanchuan 18 ‘雁过红-1’ D. kaki ‘Yanguohong-1’ 主栽品种Major cultivar 栾川Luanchuan 19 ‘石榴柿’ D. kaki ‘Shiliushi’ 农家品种Local cultivar 栾川Luanchuan 20 ‘冻柿’ D. kaki ‘Dongshi’ 农家品种Local cultivar 孟津Mengjin 21 ‘红柿’ D. kaki ‘Hongshi’ 农家品种Local cultivar 孟津Mengjin 22 ‘孟津镜面柿’ D. kaki ‘Mengjin-Jingmianshi’ 农家品种Local cultivar 孟津Mengjin 23 ‘算盘子’ D. kaki ‘Suanpanzi’ 农家品种Local cultivar 孟津Mengjin 24 ‘天生蛋’ D. kaki ‘Tianshengdan’ 农家品种Local cultivar 孟津Mengjin 25 ‘摘家烘’ D. kaki ‘Zhaijiahong’ 农家品种Local cultivar 孟津Mengjin 26 ‘新安牛心’ D. kaki ‘Xinan-Niuxin’ 主栽品种Major cultivar 新安Xin’an 27 ‘冬冬’ D. kaki ‘Dongdong’ 农家品种Local cultivar 新安Xin’an 28 ‘冬青’ D. kaki ‘Dongqing’ 农家品种Local cultivar 新安Xin’an 29 ‘方柿’ D. kaki ‘Fangshi’ 农家品种Local cultivar 新安Xin’an 30 ‘红轱卵’ D. kaki ‘Hongguluan’ 农家品种Local cultivar 新安Xin’an 31 ‘鸡心柿’ D. kaki ‘Jixinshi’ 农家品种Local cultivar 新安Xin’an 32 ‘罗盘柿’ D. kaki ‘Luopanshi’ 农家品种Local cultivar 新安Xin’an 33 ‘满天红’ D. kaki ‘Mantianhong’ 农家品种Local cultivar 新安Xin’an 34 ‘小柿’ D. kaki ‘Xiaoshi’ 农家品种Local cultivar 新安Xin’an 35 ‘门定’ D. kaki ‘Mending’ 农家品种Local cultivar 偃师Yanshi 36 ‘南衙’ D. kaki ‘Nanya’ 农家品种Local cultivar 偃师Yanshi 37 ‘七月早-1’ D. kaki ‘Qiyuezao-1’ 主栽品种Major cultivar 偃师Yanshi 38 ‘小牛心’ D. kaki ‘Xiaoniuxin’ 农家品种Local cultivar 偃师Yanshi 39 ‘偃师出头柿’ D. kaki ‘Yanshi-Chutou’ 农家品种Local cultivar 偃师Yanshi 40 ‘偃师镜面柿’ D. kaki ‘Yanshi-Jingmianshi’ 农家品种Local cultivar 偃师Yanshi 41 ‘偃师牛心’ D. kaki ‘Yanshi-Niuxin’ 农家品种Local cultivar 偃师Yanshi 42 ‘盖柿’ D. kaki ‘Gaishi’ 农家品种Local cultivar 伊川Yichuan 43 ‘火晶柿’ D. kaki ‘Huojingshi’ 主栽品种Major cultivar 伊川Yichuan 44 ‘胎里红’ D. kaki ‘Tailihong’ 农家品种Local cultivar 伊川Yichuan 45 ‘林州1号’ D. kaki ‘Linzhou 1’ 农家品种Local cultivar 安阳Anyang 46 ‘林州2号’ D. kaki ‘Linzhou 2’ 农家品种Local cultivar 安阳Anyang 47 ‘博爱八月黄’ D. kaki ‘Boai-Bayuehuang’ 主栽品种Major cultivar 博爱Bo’ai 48 ‘灰子柿-1’ D. kaki ‘Huizishi-1’ 主栽品种Major cultivar 郏县Jiaxian 49 ‘盘柿’ D. kaki ‘Panshi’ 农家品种Local cultivar 郏县Jiaxian 50 ‘莲花柿’ D. kaki ‘Lianhuashi’ 农家品种Local cultivar 郏县Jiaxian 51 ‘面黄蛋’ D. kaki ‘Mianhuangdan’ 农家品种Local cultivar 郏县Jiaxian 52 ‘水丈红-1’ D. kaki ‘Shuizhanghong-1’ 主栽品种Major cultivar 郏县Jiaxian 53 ‘水丈红-2’ D. kaki ‘Shuizhanghong-2’ 主栽品种Major cultivar 郏县Jiaxian 54 ‘小面黄蛋’ D. kaki ‘Xiaomianhuangdan’ 农家品种Local cultivar 郏县Jiaxian 55 ‘大白梨柿’ D. kaki ‘Dabailishi’ 农家品种Local cultivar 鲁山县Lushan 56 ‘胡栾头-2’ D. kaki ‘Huluantou-2’ 农家品种Local cultivar 鲁山县Lushan 57 ‘皮匠楼-2’ D. kaki ‘Pijianglou-2’ 农家品种Local cultivar 鲁山县Lushan 58 ‘七月早-3’ D. kaki ‘Qiyuezao-3’ 主栽品种Major cultivar 鲁山县Lushan 59 ‘树叉红-2’ D. kaki ‘Shuchahong-2’ 农家品种Local cultivar 鲁山县Lushan 60 ‘四瓣面柿’ D. kaki ‘Sibanmianshi’ 农家品种Local cultivar 鲁山县Lushan 61 ‘血柿’ D. kaki ‘Xueshi’ 主栽品种Major cultivar 鲁山县Lushan 62 ‘雁过红-3’ D. kaki ‘Yanguohong-3’ 主栽品种Major cultivar 鲁山县Lushan 63 ‘鬼脸青’ D. kaki ‘Guilianqing’ 农家品种Local cultivar 平顶山Pingdingshan 64 ‘胡栾头-1’ D. kaki ‘Huluantou-1’ 农家品种Local cultivar 平顶山Pingdingshan 65 ‘落花甜’ D. kaki ‘Luohuatian’ 农家品种Local cultivar 平顶山Pingdingshan 66 ‘牛心柿’ D. kaki ‘Niuxinshi’ 主栽品种Major cultivar 平顶山Pingdingshan 67 ‘皮匠篓-1’ D. kaki ‘Pijianglou-1’ 农家品种Local cultivar 平顶山Pingdingshan 68 ‘七月早-2’ D. kaki ‘Qiyuezao-2’ 主栽品种Major cultivar 平顶山Pingdingshan 69 ‘线穗柿’ D. kaki ‘Xiansuishi’ 农家品种Local cultivar 平顶山Pingdingshan 70 ‘雁过红-2’ D. kaki ‘Yanguohong-2’ 主栽品种Major cultivar 平顶山Pingdingshan 71 ‘十月红’ D. kaki ‘Shiyuehong’ 主栽品种Major cultivar 平顶山Pingdingshan 72 ‘灰子柿-2’ D. kaki ‘Huizishi-2’ 主栽品种Major cultivar 叶县Yexian 73 ‘水柿’ D. kaki ‘Shuishi’ 农家品种Local cultivar 叶县Yexian 74 野生柿01 D. kaki wild plant 01 野生资源Wild resource 新安Xin’an 75 野生柿02 D. kaki wild plant 02 野生资源Wild resource 新安Xin’an 76 野生柿03 D. kaki wild plant 03 野生资源Wild resource 新安Xin’an 77 野生柿04 D. kaki wild plant 04 野生资源Wild resource 新安Xin’an 78 野生柿05 D. kaki wild plant 05 野生资源Wild resource 新安Xin’an 79 野生柿06 D. kaki wild plant 06 野生资源Wild resource 新安Xin’an 80 野生柿07 D. kaki wild plant 07 野生资源Wild resource 新安Xin’an 81 野生柿08 D. kaki wild plant 08 野生资源Wild resource 新安Xin’an 82 野生柿09 D. kaki wild plant 09 野生资源Wild resource 新安Xin’an 83 野生柿10 D. kaki wild plant 10 野生资源Wild resource 新安Xin’an 84 野生柿11 D. kaki wild plant 11 野生资源Wild resource 新安Xin’an 85 野生柿12 D. kaki wild plant 12 野生资源Wild resource 新安Xin’an 86 野生柿13 D. kaki wild plant 13 野生资源Wild resource 新安Xin’an 87 野生柿14 D. kaki wild plant 14 野生资源Wild resource 新安Xin’an 88 野生柿15 D. kaki wild plant 15 野生资源Wild resource 新安Xin’an 89 野生柿16 D. kaki wild plant 16 野生资源Wild resource 新安Xin’an 90 野生柿17 D. kaki wild plant 17 野生资源Wild resource 新安Xin’an 91 野生柿18 D. kaki wild plant 18 野生资源Wild resource 新安Xin’an 92 野生柿19 D. kaki wild plant 19 野生资源Wild resource 新安Xin’an 93 野生柿20 D. kaki wild plant 20 野生资源Wild resource 新安Xin’an 94 野柿D. kaki var. sylvestris 柿变种Variant of D. kaki 浙江丽水Lishui, Zhejiang 95 金枣柿D. spp. — 浙江丽水Lishui, Zhejiang 96 君迁子1 D. lotus 1 近缘种Related species 洛阳Luoyang 97 君迁子 2 D. lotus 2 近缘种Related species 鲁山县Lushan 98 君迁子3 D. lotus 3 近缘种Related species 洛阳Luoyang 99 浙江柿D. glaucifolia 近缘种Related species 浙江宜丰Yifeng, Zhejiang 100 油柿 D. oleifera 近缘种Related species 浙江丽水Lishui, Zhejiang 101 美洲柿1 D. virginiana 1 近缘种Related species 美国U.S.A. 102 美洲柿2 D. virginiana 2 近缘种Related species 美国U.S.A.

采用改良CTAB法(梁玉琴等，2012)从叶片中提取柿全基因组DNA，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，紫外分光光度计检测DNA浓度，合格样品置于-20 ℃保存备用。

从现已发表的110对柿属植物SSR引物中(Soriano et al.，2006；Guo et al.，2006; 2008；Luo et al.，2013；阮小凤等，2008；吴硕等，2012)筛选出17对多态性较高、重复性较好的引物用于最终试验测定(表 2)。PCR反应体系如下：总体积20 μL，DNA模板30 ng，20 mmol·L^-1 Tris-HCl(pH8.3)，1.5 mmol·L^-1 MgCl₂，50 mmol·L^-1 KCl，0.25 mmol·L^-1 dNTP，正反向引物各0.8 μmol·L^-1，1U Taq DNA聚合酶。PCR循环体系如下：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性45 s，按照各引物退火温度退火50 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃总延伸4 min。ABI Prism 3130 遗传分析仪检测PCR产物，GeneMapper 4.0软件分析扩增片段长度(即条带长度)。

表 2 试验所用SSR引物信息 Tab.2 Information of SSR primers used in the experiment

表 2 试验所用SSR引物信息 Tab.2 Information of SSR primers used in the experiment 位点Loci GenBank编号GenBank accession No. 重复基元Repeat motif 引物序列Primer sequence(5′-3′) 退火温度Tm/℃ 条带长度Band length/bp 1430 (GAG)5 F: TCA GTA AAG CTG CGG GCA TC 56 190～250 DC588341 R: ACG GTT CTC CTG ATC CTC ACG 1554 (CAT)6 F: CAC CGC ATC CTC TTC GAC ATC C 56 190～223 DC586537 R: ACG CAT CCG TCA AAT CAC AAC A 4379 (GAG)9 F: TGA CTC TGC TCC ACA GGC ACT TC 56 208～235 DC585084 R: CTC GTC TGG CAA TTC TGC TTC G 5553 (GTAGTG)3 F: CCA GTT GAT GGC AAT GGG AGG C 56 226～254 DC585710 R: GGT GCG ATG TTG GAG GGA AGA G 6615 (CTT)7 F: ACA CTC CAC TCT ACC CAA ATA CC 55 244～268 DC585737 R: GAC ATC ATA AGT CAA AGC ACG AA 6665 (TA)9 F: TGA CCA ACC CCA AAG TGT GGG AG 60 171～209 DC592790 R: AGG TCC CTC TGG TGA GCA CAT GC 8125 (GGC)4 F: TTA TCC CAT CAA AGC AAC CCA C 55 189～227 DC592401 R: CTG CCA ACT TCT TCT CCA TCT CC 8917 (AT)10 F: ACA CGT TCA GTA CCA GGA GGG A 55 166～197 DC591591 R: AGT ACC ACA AAC CAC CAG TGG 9004 (GCAGGA)3 F: GCC ACA AAC TTC ACA GAG GAC C 55 251～272 DC591297 R: AGG CGA GTG CGA GTA AGA CGA A DKs76 (AGG)7 F: TCG GCT TCA CCT ATG TTG 52 111～138 DC585435 R: CGA TTC CTT GGA CCT TTG DKs91 (AG)7 F: CGG AAG AGG GAG AAA TCG 55 191～207 DC592713 R: GAA TCG GGA AAG CAA GTT mDp17 (GA)21 F: CCA AAT CAT TCG AAG CCA AT 52 128～168 EF567410 R: CCT TCA CCG ATG TCC TTT GT ssrDK11 (GA)16 F: ATG TTT CAG GGG TTC CAT TG 53 155～191 DQ097479 R: TCA CTC GTC TTT GCC TTT CC ssrDK14 (AG)16 F: GTG AAG GAA CCC CAT AGA A 52 158～192 DQ097482 R: CCA TCA TCA GGT AGG AGA GA ssrDK16 (GA)12 F: ACT ACA ACG GCG GTG AGA AC 55 136～172 DQ097484 R: GTC CTT CAC TTC CCG CAT T ssrDK29 (CCTTT)8 F: ATC ATG AGA TCA GAG CCG TC 53 112～152 DQ097497 R: CAC GTT AAC GTT ACG GAA CA ssrDK31 (CT)15 F: AGT TCT TGC GAT GGG ATT TG 60 191～207 DQ097499 R: GAT GAG ATG GGC TGA TTG CT

所用近缘种中的样品多为2倍体，而很多柿种质属于6倍体，并且其多倍体来源不清楚，由于所用材料倍性不一致，无法按照传统的SSR分析方法进行数据分析，因此根据PCR产物扩增情况，统计每一扩增片段的有无，0代表无，1代表有，构建0/1数据矩阵，按照显性标记(Naval et al.，2010)方法进行数据处理。Excel软件计算每对引物扩增的条带总数(N_t)、多态性条带数(N_p)；根据样品中谱带类型，统计带型总数(N₁)；特异带型数(N₂)，即带型数目仅为1的所有样品总数；特异带型比率(P₁)和种质鉴别率(P₂)，二者计算公式分别为P₁=N₂/N₁，P₂=N₂/N，式中N为样品总数；并由带型频率代替等位基因频率计算多态性信息含量(PIC)和Shannon信息指数(I)(Nei，1987)，计算公式分别为${\rm{PI}}{{\rm{C}}_i} = 1 - \sum\limits_{j = 1}^n {P_{ij}^2} ,{I_i} = - \sum\limits_{j = 1}^n {{P_{ij}}\ln {P_{ij}}} $式中P_ij为第i个位点第j个带型的频率，n为第i个位点的带型数；根据带型状况计算每一位点的观察杂合度(H_o)。利用NTsys 2.10软件计算各样品彼此之间的Dice相似系数，并根据相似系数，利用SAHN程序，采用非加权组平均法(UPGMA)进行聚类分析；对相关系数矩阵中心化后进行主坐标分析，通过聚类分析及主坐标分析，判断资源间的亲缘关系，进行种质资源鉴定。

从毛细管电泳检测结果(图 1)可以看出，各条带分辨率高，结果准确可靠。表 3显示了不同引物的扩增片段在所有资源中的多态性，可以看出河南省柿种质资源具有丰富的遗传多样性：17对引物共得到159个不同的DNA片段(即条带)，平均每对引物9.35个，这些条带均具有多态性；扩增条带数最多的引物有2对，分别来自于位点ssrDK11/DQ097479和ssrDK14/DQ097482，其条带数为14个，最少的来自于位点8125/DC592401，条带数为5个。17对引物共得到508个谱带类型(即带型)，每对引物得到的带型数范围为8～53个，平均29.88个，最多的引物来自位点ssrDK11/DQ097479，最小的来自5553/DC585710；特异带型总数为267个，范围为2～37个，平均每对引物5.71个，最多的还是来自位点ssrDK11/DQ097479，最小的同样来自位点5553/DC585710。从特异带型比率(P₁)来看，最高的引物来自位点6665/DC592790(73.68%)，最小的仍为5553/DC585710(25.00%)；而鉴定率(P₂)高低与特异带型数(N₂)相一致，最高的是ssrDK11/DQ097479(36.27%)，最小的是5553/DC585710(1.96%)。多态性信息含量(PIC)除6665/DC592790外，其余均大于0.5，PIC范围是0.466 7～0.964 7，平均0.839 7；Shannon信息指数(I)平均为2.658 6，最高的是mDp17/EF567410(3.596 7)，最小的是DKs91/DC592713(1.112 1)。平均观察杂合度(H_o)为0.777 4，范围是0.147 1(6665/DC592790)至0.960 8(4379/DC585084，8125/DC592401)。

	图 1 样品‘七月早-2’在1554/ DC586537处扩增的毛细管电泳检测 Fig. 1 Capillary electropherogram obtained by 1554/DC586537 of D. kaki ‘Qiyuezao-2’ sz：条带长度Band length/bp；ht: 荧光信号值Value of fluorescent signal/rfu

表 3 基于17对SSR引物所扩增的产物在102份柿属植物种质中的遗传多态性^① Tab.3 Genetic diversity estimated based on the amplified products by 17 SSR primers among 102 germplasms of Diospyros

表 3 基于17对SSR引物所扩增的产物在102份柿属植物种质中的遗传多态性① Tab.3 Genetic diversity estimated based on the amplified products by 17 SSR primers among 102 germplasms of Diospyros 位点LociGenBank编号GenBank accession No. Nt Np N1 N2 P1 P2 h I Ho 1430/ DC588341 7 7 26 8 30.77% 7.84% 0.934 5 2.940 8 0.862 7 1554/ DC586537 10 10 38 19 50.00% 18.63% 0.956 4 3.345 8 0.921 6 4379/ DC585084 9 9 38 22 57.89% 21.57% 0.940 4 3.197 2 0.960 8 5553/ DC585710 6 6 8 2 25.00% 1.96% 0.580 6 1.193 0 0.872 5 6615/ DC585737 7 7 33 14 42.42% 13.73% 0.949 3 3.194 0 0.852 9 6665/ DC592790 10 10 19 14 73.68% 13.73% 0.466 7 1.318 8 0.147 1 8125/ DC592401 5 5 15 3 20.00% 2.94% 0.841 8 2.158 5 0.960 8 8917/ DC591591 9 9 20 11 55.00% 10.78% 0.792 8 2.125 4 0.725 5 9004/ DC591297 9 9 20 12 60.00% 11.76% 0.750 3 1.993 2 0.872 5 DKs76/ DC585435 10 10 39 17 43.59% 16.67% 0.954 1 3.358 4 0.882 4 DKs91/ DC592713 7 7 10 4 40.00% 3.92% 0.510 8 1.112 1 0.313 7 mDp17/ EF567410 13 13 50 30 60.00% 29.41% 0.964 7 3.596 7 0.892 2 ssrDK11/ DQ097479 14 14 53 37 69.81% 36.27% 0.955 2 3.578 9 0.715 7 ssrDK14/ DQ097482 14 14 46 24 52.17% 23.53% 0.962 5 3.550 9 0.931 4 ssrDK16/ DQ097484 11 11 31 15 48.39% 14.71% 0.902 7 2.857 1 0.794 1 ssrDK29/ DQ097497 9 9 27 15 55.56% 14.71% 0.915 2 2.781 4 0.882 4 ssrDK31/ DQ097499 9 9 35 20 57.14% 19.61% 0.897 7 2.893 7 0.627 5 平均Mean 9.35 9.35 29.88 15.71 15.40% 0.839 7 2.658 6 0.777 4 合计Total 159 159 508 267 ① Nt：条带总数；Np：多态性条带数；N1：带型个数；N2：特异带型数；P1：特异带型比率；P2：种质鉴别率；PIC：多态性信息含量；I：Shannon信息指数；Ho：观察杂合度。 Nt：Number of total bands; Np：Number of polymorphic bands; N1：Number of band patterns; N2：Number of unique band patterns; P1: Rate of unique band patterns; P2: Rate of identified germplasms; PIC: Polymorphism information content; I: Shannon’s information index; Ho: Observed heterozygosity.

根据主坐标分析结果(图 2)，所有资源可分为2大类群。A类群为柿近缘野生种，又明显分为2个亚类，其中A₁包括君迁子、浙江柿、金枣柿和油柿共6份资源，A₂包括美洲柿2份种质，可以看出美洲柿明显区别于其他种。B类群中的样品均为柿种下资源，又可分为3个亚类，其中大部分柿种质遗传特性较一致，构成B₁亚类，包括各地主栽品种、地方品种以及全部野生资源，并且柿变种野柿也在此类群中；B₂亚类包括‘大火罐’、‘小火罐’、‘冬青柿’和‘火晶柿’4份资源；B₃亚类则包括‘遮叶’、‘偃师出头’、‘栾川出头’、‘新安牛心’、‘偃师牛心’、‘鲁山牛心’、‘大白梨柿’和‘鸡心柿’，共计8份资源。B₂亚类虽然也都是柿种下品种，相对于B₁和B₃亚类里面的种质，它们与柿近缘种君迁子、浙江柿等A₁亚类中的资源更为相近，并且4个品种均为河南当地古老农家品种，栽培历史悠久，可能与柿起源进化有关。结合形态特征，B₃亚类中的柿品种可能是‘牛心柿’的不同类型，其品种因分布于不同地区，存在同名异物或同物异名现象。

	图 2 河南省柿种质资源主坐标分析 Fig. 2 Principal coordinates analysis of persimmon germplasms in Henan province

从所有材料聚类图(图 3)可以看出各近缘种与柿具有明显的遗传差异，在相似系数0.481 6处，各物种彼此之间可完全区分开，所有资源可分为2组(a和b)。a组内均为柿近缘种，包括君迁子、浙江柿、金枣柿、油柿和美洲柿共计8份资源；这些近缘种中2份美洲柿亲缘关系最近，其相似系数为0.861 1；3份君迁子亲缘关系也较近，相似系数均大于0.6，其中来自洛阳的2份君迁子先聚类，再与来自平顶山的君迁子聚为一类。b组均为柿种下资源，其中b1小组里除了‘小镜面糊卵’、‘门定’和‘小柿’3份资源外，其他11份资源均为来自洛阳地区的实生野生柿，这些资源与柿变种野柿遗传差异较大，亲缘关系较远，其他几份野生柿也分别与不同的柿品种首先聚类，说明这些野生柿可能是当地柿品种的偶发实生资源。进一步分析，发现这些资源集中分布于洛阳新安县石井乡地区，相隔距离较近，树龄较小，聚类结果与实际分布状况基本相一致。b2小组包括‘大火罐’、‘冬青’、‘小火罐’、‘火晶’、‘小面糊’和‘落花甜’共计6份资源，此组柿资源单独聚类，与其余大部分柿资源有较远的亲缘关系，这与主坐标分析结果相类似。

	图 3 河南柿资源UPGMA聚类分析 Fig. 3 Cluster analysis of persimmon germplasms in Henan province by UPGMA 图中编号对应资源见表 1。 The numbers showed above are consistent with those in Tab. 1.

根据亲缘关系，可鉴别全部102份种质，说明本文所用方法可有效应用于柿属种质资源鉴定。根据亲缘关系，结合形态特征，可初步判定同物异名及同名异物品种，如‘林州1号’和‘林州2号’相似系数为0.980 8，应为同一品种；‘栾川牛心柿’与‘线穂柿’相似系数为0.958 3，应为同物异名品种；b3小组中的4份样品彼此间相似系数均大于0.8，应该是‘七月早’的不同类型，其中‘雁过红-2’为同物异名品种；b4小组中的‘遮叶’与‘偃师出头’相似系数高达0.989 7，且与‘栾川出头’非常相似，三者首先聚为一类，而‘新安牛心’、‘大白梨柿’、‘鸡心柿’、‘偃师牛心’和‘牛心柿’这6份资源相互之间相似系数均大于0.9，这几份种质应为‘牛心柿’的不同类型，这与上述主坐标分析结果也相一致；b5小组中的‘血柿’与‘十月红’相似系数为0.968 4，且与‘灰子柿-1’、‘灰子柿-2’以及‘水丈红-2’亲缘关系较近，这些品种形态特征相似且均为晚熟品种。

应用SSR标记进行植物遗传多样性研究时，通常是进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过银染或者荧光染料来检测扩增产物大小(Hu et al.，2012)，此方法不仅操作繁琐耗时，毒性大，而且通量低，大规模样品检测时，数据整合困难，人为主观因素在条带判读时也会造成很大误差，影响结果的准确性。柿是六倍体树种，相对二倍体或者单倍体，在检测PCR产物时，会得到更为复杂的带型，若采用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，将对实验数据分析造成更大困难，人为误差更大，严重降低结果的准确度。针对上述问题本文采用毛细管电泳法检测PCR产物，遗传分析仪通过峰值判断条带长度，不仅操作简单、快速、无毒害，而且此方法通量高，适合大批量样品的检测。另外，荧光检测法分辨率高，所得结果更准确。在数据分析时虽然因为柿多倍体来源不清，无法推断完整基因型，但是通过参照显性标记0/1记录方法，可判断扩增产物的谱带类型，以此判断多倍体柿的遗传多样性。研究结果显示，通过此方法17对SSR引物可鉴别所有供试材料，说明此方法的有效性。所用位点中，ssrDK11/DQ097479、ssrDK14/DQ097482和mDp17/EF567410扩增得到的DNA片段多态性最高，可能会在柿属植物种质资源深入鉴定及指纹图谱构建等工作中发挥更大作用。

河南省地处我国中部地区，属于温带季风气候，周边群山环绕，西部为秦岭东脉伏牛山区，北部少数地区处于太行山区，南部信阳等地为大别山区，气候地理条件非常适合柿生长。该省柿资源研究较少，仅有学者对河南南部平顶山地区的柿品种进行了简单调查(韩德波等，2010)。本课题组首次对全省范围内的柿种质资源进行了全面调查与收集，并对收集到的资源进行遗传多样性分析，结果显示：102份资源中共得到159条具多态性的条带，508个带型，267个特异带型，多态性信息含量平均为0.839 7，Shannon信息指数平均为2.658 6，观察杂合度平均为0.777 4，充分说明河南省柿种质资源具有非常丰富的遗传多样性。研究结果不仅为该地区柿杂交育种等工作奠定了基础，也为我国涩柿资源提供了更多分子生物学信息。

据调查，河南省柿种质资源虽然丰富多样，但这些资源绝大部分栽植于田间地头、房前屋后等四旁地，管理非常粗放。在资源命名方面尤其杂乱，无统一标准，当地百姓多根据柿果实特征如果色、果形、成熟期、果实口感等，给不同的种质起些土名，造成严重的同物异名或同名异物现象，加上各地长期相互引种过程中，常有品种名称混淆或记错等情况，导致资源同物异名或同名异物问题更加严重，对该省柿资源深入研究工作造成了很大阻碍。本文通过DNA标记技术，可将供试样品全部区分开，并根据亲缘关系，结合形态特征，判断出了‘七月早’、‘牛心柿’等部分同物异名或同名异物品种，为该地区柿资源有效保存与利用提供了科学依据。另外，众所周知，野生资源在植物遗传育种中占据重要地位，关于柿野生资源的研究极少，本课题组在资源调查过程中，着重加强了野生柿资源的收集与保存，文中亦对河南省发现的20份野生柿资源进行了遗传鉴定及亲缘关系研究，不仅是对柿遗传信息的重要补充，而且对柿杂交育种等工作具有重要意义。

柿起源于中国，具有2 000多年的栽培历史，众多学者采用不同的分析方法，对柿与柿属其他植物的亲缘关系进行了研究：Choi等(2003)通过对柿属植物10个种进行荧光原位杂交研究，认为二倍体君迁子可能参与了六倍体柿的形成，并发现来源于不同地理区域的柿属植物具有不同数目的rDNA拷贝数，根据杂交结果认为柿可能为同源异源多倍体；Yonemori等(2008)利用柿属15个种的ITS区域和matK基因序列进行了系统发育研究，认为与君迁子相比，油柿与柿的亲缘关系更近，此结果与Choi等(2003)的研究略有差异；Hu等(2008)利用叶绿体DNA PCR-RFLP技术对柿属植物进行了系统发育研究，结果显示，与柿亲缘关系最近的是君迁子和浙江柿，其次为油柿，关系较远的是金枣柿和美洲柿。另外，金枣柿一直作为柿种下的一个品种，但近几年的研究证实其为二倍体，并且形态特征与柿有明显差异，学者们利用不同的分子标记对二者亲缘关系进行了研究，均证实金枣柿与柿亲缘关系较远，应为柿属植物新种(郭大龙，2006；Du et al.，2009)。本文根据前人研究结果，选取了部分柿近缘种作为对照，证实几个近缘种与柿具有明显的遗传差异，特别是金枣柿和美洲柿，与柿遗传差异较大，并发现君迁子与浙江柿具有更近的亲缘关系。研究结果不仅是对前人研究的佐证，也为今后利用DNA标记深入分析柿起源进化奠定了基础。