白腐菌是木材腐朽菌的一类，在生态系统循环中起到关键的降解作用(戴玉成，2012)。在植物体内，木质素与半纤维素通过化学键紧密连接，包裹在纤维素之外，这种复杂的结构使得纤维素很难被微生物降解(吕世翔等，2009)，但白腐菌在降解木质纤维素方面具有特殊的优势(张晓昱等，2004)。

近年来，国内外对白腐菌的各种木质纤维素酶进行了大量研究。主要集中在木质纤维素酶高产菌种选育、木质素降解机制以及污染物降解等方面。吴志显等(2005)对火木层孔菌(Phellinus igniarius)、粗毛盖菌(Funalia gallica)等6 种白腐菌木质素降解的机制进行了初步研究。Kamei等(2012)筛选出一株新的白腐菌Phlebia sp. MG-60，可以在有氧状态下去除木材的木质素，在无氧状态下降解纤维素并糖化发酵生产乙醇。Liew等(2011)利用马占相思木屑对几种热带白腐菌的生物制浆和木质素降解酶活进行研究，结果显示云芝栓孔菌(Trametes versicolor)和针层孔菌(Phellinus sp.)的木质素降解能力更强。

目标区域扩增多态性(TRAP)分子标记技术是利用已知目标基因序列设计固定引物，选择性扩增目的基因的某一特定区域(Miklas et al.， 2006)。该技术的优点在于能够产生围绕目标基因序列的多态性标记(Li et al.， 2011)。目前已广泛应用于遗传多样性分析、基因定位、遗传图谱构建等方面的研究(Xiao et al.， 2010； Devarumath et al.， 2013； 张丽群等，2012)。

本研究以帽儿山采集的云芝栓孔菌、火木层孔菌和松杉灵芝为对象，测定其生长速度及几种主要木质纤维素酶活性变化，并采用TRAP-PCR技术探讨3种白腐菌木质纤维素酶相关基因序列间的遗传差异。目的是从分子水平上了解3种白腐菌木质纤维素酶的表达与相关基因多样性的关系，为以后高产木质纤维素酶菌种选育和白腐菌木材降解分子机制的研究提供科学依据。

本试验所使用的3种白腐菌均可造成木材海绵状白色腐朽(图 1)，即云芝栓孔菌、火木层孔菌和松杉灵芝(Ganoderma tsugae)，均采自黑龙江省尚志市东北林业大学帽儿山实验林场。

	图 1 云芝栓孔菌(a)、火木层孔菌(b)和 松杉灵芝(c) Fig. 1 Trametes versicolor(a)， Phellinus igniarius (b) and Ganoderma tsugae (c)

在无菌的条件下，用含75%的酒精棉擦拭菌体表面，用解剖刀切取子实体中有生命力的菌块(约1 cm²)，用75%酒精表面消毒2 min，次氯酸钠溶液消毒1 min，无菌水冲洗3次，然后将组织块切成2 mm²大小，滤纸吸干后接入PDA平板培养基上，置于28 ℃下恒温培养，待菌丝体覆盖整个平板后用接种针挑取尖端菌丝转接到新的PDA培养基上，如此反复使菌株纯化。将纯的白腐菌株转接到白桦(Betula platyphylla木屑麦麸培养基上，置于28 ℃培养箱中继续培养，待菌丝体长满试管放入4 ℃冰箱中保存。

用打孔器取直径约0.75 cm大小的菌饼接种到PDA培养基中，分别放入23，28 ℃培养箱中培养，每12 h测量记录培养基中的菌落直径，每个菌种设3个重复。每20 mL马铃薯-葡萄糖液体培养基(200 g·L^-1马铃薯，20 g·L^-1葡萄糖)接入一个直径约0.75 cm的菌饼，在28 ℃、150 r·min^-1摇床中震荡培养，每隔48 h取出，过滤并用蒸馏水冲3次，放入100 ℃烘箱中烘至恒质量后称量，每个菌种设3个重复。

白桦木屑的处理： 干燥的白桦木屑经粉碎机粉碎后用蒸馏水多次冲洗，经6层纱布过滤最后放入烘箱中烘干备用。

在20 mL马铃薯-葡萄糖液体培养基中加入1 g白桦木屑，分别接种3种白腐菌菌饼1块(直径约0.75cm)，无白桦木屑的马铃薯-葡萄糖液体培养基为对照，每个菌种设3个重复。分别培养3，6，9天后取出，培养液在10 000 r·min^-1离心10 min，上清液即为粗酶液。

麦麸的处理： 干燥的麦麸用蒸馏水多次冲洗，经4层纱布过滤后，放入烘箱中烘干，经粉碎机粉碎后备用。

培养液中各物质的质量分数分别为： 2%(NH₄)₂SO₄，0.1% KH₂PO₄，0.5% MgSO₄·7H₂O，0.01%CaCl₂，0.01%NaCl，0.005%FeSO₄·7H₂O，0.001 6%MnSO₄·H₂O，0.001 4%ZnSO₄·7H₂O，0.002% CoCl₂。

在50 mL三角瓶中加入1 g烘干的麦麸碎屑或白桦木屑及10 mL培养液，灭菌后接入菌饼(直径约0.75 cm)，分别培养3，6，9天后，向培养物中加入5倍质量的蒸馏水，盖上封口膜浸泡12 h，随后用2～3层纱布过滤，培养液在6 000 r·min^-1离心10 min，取上清即为粗酶液。

木质素过氧化物酶(LiP)活性测定参见文献(董旭杰等，2007)，锰过氧化物酶(MnP)活性测定参见文献(徐淑霞等，2007)，漆酶(Lac)活性测定参见文献(李慧蓉，2005)。内切纤维素酶活测定参见文献(Deswal et al.， 2011)，外切纤维素酶活测定参见文献(Li et al.， 2007)。

利用CTAB法提取3种白腐菌的基因组DNA，紫外分光光度计(UV-1800，Japan)检测DNA浓度。引物设计： 来自NCBI数据库的木质纤维素降解相关酶基因为靶标基因序列，设计固定引物用于TRAP-PCR，筛选出产生多态性条带的引物用于PCR扩增(PTC-100，Germany)。PCR反应条件： 在20 μL反应体系中，ddH₂O11.2 μL、10×buffer 2 μL、Mg²⁺(25 mmol·L^-1)2.0 μL、dNTP(10 mmol·L^-1)0.6 μL、固定引物(10 μmol·L^-1)1.5 μL、随机引物(10 μmol·L^-1)1.5 μL、模板DNA 100 ng、TaqDNA聚合酶0.2 μL。PCR程序为： 94 ℃ 5 min； 94 ℃ 1 min，35 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，5个循环； 94 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 90 s，35个循环； 4 ℃保存。PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶，以100 V缓冲电压，1×TAE缓冲液电泳分离，使用UPS凝胶成像系统(Universal HoodⅡ，BioRad)检测结果。

采用SPSS17.0统计学软件进行木质纤维素酶间方差(单因素和双因素)和显著性分析。

多态位点比率(PPB)： PPB=多态位点数/检测到的位点总数×100%。

在不同温度下，3种白腐菌的生长情况见图 2。28 ℃时，云芝栓孔菌、火木层孔菌和松杉灵芝的菌落平均生长速度(直径变化)分别为7.0，3.6和2.6 mm·d^-1； 而在23 ℃培养条件下，3种白腐菌的生长速度分别为6.0，3.4和3.2 mm·d^-1。说明云芝栓孔菌生长受温度变化影响较大，28 ℃更适合其生长； 火木层孔菌菌丝体长满平板需要12天，温度差异对这种真菌影响不明显； 松杉灵芝是3种白腐菌中生长最慢的菌株，生长天数也相对较长一些，但与其他菌种相比，23 ℃更适合其生长。

	图 2 3种白腐菌在28 ℃(a)、23 ℃(b)PDA培养基生长情况 Fig. 2 Growth rate of three white-rot fungi in PDA medium at 28 ℃(a) and 23 ℃(b)

3种木材白腐菌生物量变化如图 3所示，它们在液体培养基中的生物量变化很大，云芝栓孔菌从第2天开始进入对数期，生长速度比较快，在第10天生物量达到最大值后迅速进入衰亡期； 火木层孔菌延迟期为0～4天，随后生物量直线上升，到第10天时达到同期云芝栓孔菌的42.36%，对数期时间较长，16天还未到达平台期； 松杉灵芝的生物量最低，延迟期为0～6天，第10天仅达到同期云芝栓孔菌的9.27%，第12天达到其生物量最大值248 mg，随后逐渐下降，第16天降到135.8 mg。

	图 3 液体培养基中3种白腐菌生物量的变化 Fig. 3 Biomass changes of three white-rot fungi in liquid culture

木质素过氧化物酶活性如图 4a所示，云芝栓孔菌受木屑诱导处理与对照间的差异极显著，F=34.859^***(表 1)，在相同培养条件下，云芝栓孔菌表达的木质素过氧化物酶活性最强。3种白腐菌的锰过氧化物酶活性与生长天数关系紧密，随着培养时间的增加而递增，之后持平或略有下降(图 4b)。其中，火木层孔菌木屑诱导处理与对照间的差异显著，F=10.424^*。3种白腐菌漆酶活性表达量最高，变化较大(图 4c)。其中，云芝栓孔菌漆酶活性最高，松杉灵芝基本没有漆酶产生。3种白腐菌的漆酶活性受木屑诱导显著提高，且随生长天数递增。3种酶活性均随培养时间的增加而增强。

	图 4 3种白腐菌木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶活性 Fig. 4 Activities of lignin peroxidase， manganese peroxidase and laccase of three white-rot fungi

表 1 3种白腐菌漆酶、锰过氧化物酶、木质素过氧化物酶活性方差分析^① Tab.1 The variance analysis of the activities of three main lignin degradation enzymes

表 1 3种白腐菌漆酶、锰过氧化物酶、木质素过氧化物酶活性方差分析① Tab.1 The variance analysis of the activities of three main lignin degradation enzymes 白腐菌White-rot fungi Lac MnP LiP F treatments F time F treatments F time F treatments F time 云芝栓孔菌 T. versicolor 10.140 ** 9.794 ** 1.577 6 12.015 * 34.859 *** 1.208 火木层孔菌 P. igniarius 5.238 * 10.148 ** 10.424 * 4.171 * 10.173 * 3.25 松杉灵芝 G. tsugae 5.168 * 4.374 * 3.213 0.578 * 11.314 * 1.663 ①3种白腐菌间F值F value among 3 white-rot fungi:F=3.934*(Lac) (0.040 8)， F=7.782**(MnP) (0.001 2) ，F=14.408***(Lip)(0.006 2).

如图 5所示，3种白腐菌在麦麸作为碳源诱导产生的内切β-葡聚糖酶酶活性均高于木屑碳源样品。火木层孔菌产酶能力最强，云芝栓孔菌产酶能力最低，但不同菌种间差异不明显。3种白腐菌在麦麸作为碳源诱导产生的外切β-葡聚糖酶活性均高于木屑碳源样品，松杉灵芝受木屑诱导处理与对照间的差异极显著，F=69.894^**(表 2)。3种白腐菌在培养第3天时EC酶活最强，之后随着培养天数的增加而降低，云芝栓孔菌降幅最为明显，火木层孔菌降幅居中，松杉灵芝降幅最小。

	图 5 3种白腐菌内切β-葡聚糖酶和外切β-葡聚糖酶活性 Fig. 5 Activities of endoglucanase(EG) and exoglucanase(EC) by three white-rot fungi

表 2 3种白腐菌内切β-葡聚糖酶、外切β-葡聚糖酶活性方差分析^① Tab.2 The variance analysis of the activities of endoglucanase (EG) and exoglucanase(EC)

表 2 3种白腐菌内切β-葡聚糖酶、外切β-葡聚糖酶活性方差分析① Tab.2 The variance analysis of the activities of endoglucanase (EG) and exoglucanase(EC) 白腐菌White-rot fungi 内切β-葡聚糖酶EG 外切β-葡聚糖酶EC F treatments F time F treatments F time 云芝栓孔菌 T. versicolor 0.117 9.144 ** 1.985 18.658 ** 火木层孔菌 P. igniarius 0.378 7.592 ** 16.983 ** 3.927 * 松杉灵芝 G. tsugae 12.295 ** 0.441 69.894 ** 1.067 ①3种白腐菌间F值 F value among 3 white-rot fungi: F=3.452(EG)(0.875 5)， F=7.142*(EC)(0.046 1).

经预试验扩增筛选，从64对TRAP引物中确定了扩增后条带清晰、多态性高的17对引物： LiP2-me2，MnP1-me1，MnP2-em3，Lac1-em2，Lac1-em3，Lac2-em3，CBHⅠ1-em2，CDH1-em2，CDH1-em3，CDH2-em3，EG1-em2，EG1-em3，EG2-me2，β1-em2，β1-em3，β2-em2，β2-me1。引物序列如表 3所示(王玉英等，2012； 应正何，2006)。

表 3 3种白腐菌TRAP-PCR引物序列 Tab.3 TRAP-PCR primers of three white-rot fungi

表 3 3种白腐菌TRAP-PCR引物序列 Tab.3 TRAP-PCR primers of three white-rot fungi 引物类型Primer 靶标酶名称Name of target enzyme 序列Primer sequence(5′—3′) 固定引物 木质素过氧化物酶Lignin peroxidase(LiP2) CCCCGAGCCCTTCC Fixed primer 锰过氧化物酶Manganese peroxidase(MnP1) ATGGCGTCGTGGAAGGTG 锰过氧化物酶Manganese peroxidase(MnP2) GGTGAGGCGGAGGGAC 漆酶Laccase(Lac1) ACAACTACAACAACCCGTCTG 漆酶Laccase(Lac2) GTCTGGAAGCGGATTGTG 纤维素二糖水解酶ⅠCellobiohydrolaseⅠ(CBHⅠ1) ATCTGCGACAAGGACGG 纤维二糖脱氢酶Cellobiosedehydrogenzse(CDH1) TCAACGACAACCCCGAC 纤维二糖脱氢酶Cellobiosedehydrogenzse(CDH2) GTCGGGGTTGTCGTTGA 内切葡萄糖苷酶Endoglucase(EG1) ACGAGCCGCACGACAT 内切葡萄糖苷酶Endoglucase(EG2) TCGTGCGGCTCGTTCAT β-葡萄糖苷酶β-glucosidase(β1) GTGGAAGGTGCTGCGGTA β-葡萄糖苷酶β-glucosidase(β2) CAGGGAGGCGGAGTGG 随机引物 em2 GACTGCGTACGAATTTGC Arbitrary primer em3 GACTGCGTACGAATTGAC me1 TGAGTCCAAACCGGATA me2 TGAGTCCAAACCGGAGC

3种白腐菌木质素相关酶基因的TRAP-PCR结果见图 6。采用LiP编码基因引物对3种白腐菌基因组DNA扩增后共产生15条条带，云芝栓孔菌多态性比率为83.33%，火木层孔菌50%，松杉灵芝85.71%，物种间多态性比率为80%。MnP编码基因的2对引物对3种白腐菌基因组DNA扩增后共产生22条条带，云芝栓孔菌多态性比率为80%，火木层孔菌为87.5%，松杉灵芝88.89%，物种间多态性比率为86.36%。Lac编码基因引物的TRAP-PCR结果显示，共产生72条条带，云芝栓孔菌多态性比率71.43%，火木层孔菌60%，松杉灵芝80%，物种间多态性比率为66.67%。由此得出3种白腐菌的LiP基因、MnP基因和Lac基因在种内和种间均存在较高的遗传差异(表 4)。

	图 6 木质素相关基因TRAP-PCR电泳 Fig. 6 TRAP-PCR Electrophoresis of ligninase-related genes 1，2，7，8，13，14，19，20：云芝栓孔菌T.versicolor；3，4，9，10，15，16，21，22：火木层孔菌 P.igniarius；5，6，11，12，17，18，23，24：松杉灵芝 G.tsugae；M：DL 2000 Marker.

表 4 木质素酶相关基因TRAP-PCR的多态位点百分率 Tab.4 Polymorphic loci percentage of the ligninase-related genes by TRAP-PCR

表 4 木质素酶相关基因TRAP-PCR的多态位点百分率 Tab.4 Polymorphic loci percentage of the ligninase-related genes by TRAP-PCR 标记基因引物Primer of marker gene 条带总数Total number of bands 多态条带数Number ofpolymorphic bands 多态位点比率Percentage ofpolymorphic bands(%) LiP编码基因引物Primer of LiP-related gene 云芝栓孔菌 T. versicolor 6 5 80 火木层孔菌 P. igniarius 2 1 松杉灵芝 G. tsugae 7 6 MnP编码基因引物Primer of MnP-related gene 云芝栓孔菌 T. versicolor 5 4 86.36 火木层孔菌 P. igniarius 8 7 松杉灵芝 G. tsugae 9 8 Lac编码基因引物Primer of Laccrelated gene 云芝栓孔菌 T. versicolor 28 20 66.67 火木层孔菌 P. igniarius 20 12 松杉灵芝 G. tsugae 24 16 总计Total 109 79 72.47

3种白腐菌纤维素相关酶基因的TRAP-PCR结果见图 7。用CBH编码基因引物对3种白腐菌基因组DNA扩增后共产生31条条带，云芝栓孔菌多态性比率57.14%，火木层孔菌66.67%，松杉灵芝58.33%，物种间多态性比率为61.29%； 用CDH编码基因引物对3种白腐菌基因组DNA扩增后共产生38条条带，云芝栓孔菌多态性比率88.89%，火木层孔菌92.85%，松杉灵芝86.67%，种群间多态位点比率为72.91%； 用EG编码基因引物对3种白腐菌基因组DNA扩增后共产生50条条带，云芝栓孔菌多态性比率63.15%，火木层孔菌58.82%，松杉灵芝50%，物种间多态性比率为58%； 用β-葡萄糖苷酶编码基因引物对3种白腐菌基因组DNA扩增后共产生72条条带，多态性条带为58条，云芝栓孔菌多态性比率72%，火木层孔菌70.83%，松杉灵芝57.5%，物种间多态性比率72.45%。由此得出3种白腐菌间的纤维素降解相关基因的遗传多样性较高(表 5)。

	图 7 纤维素酶相关基因TRAP-PCR电泳 Fig. 7 TRAP-PCR electrophoresis of cellul-related genes (1，2，7，8，13，14，19，20:云芝栓孔菌T. versicolor; 3，4，9，10，15，16，21，22:火木层孔菌P.igniarius; 5，6，11，12，17，18，23，24:松杉灵芝G.tsugae;M:DL 2000 Marker.

表 5 纤维素酶相关基因TRAP-PCR的多态位点百分率 Tab.5 Polymorphic loci percentage of the cellulase-related genes by TRAP-PCR

表 5 纤维素酶相关基因TRAP-PCR的多态位点百分率 Tab.5 Polymorphic loci percentage of the cellulase-related genes by TRAP-PCR 标记基因引物Primer of marker gene 条带总数Total number of bands 多态条带数Number ofpolymorphic bands 多态位点比率Percentange ofpolymorphic bands(%) 纤维二糖水解酶编码基因引物Primer of CBH 云芝栓孔菌 T. versicolor 7 4 61.29 火木层孔菌 P. igniarius 12 8 松杉灵芝 G. tsugae 12 7 纤维二糖脱氢酶编码基因引物Primer of CDH 云芝栓孔菌 T. versicolor 9 8 89.47 火木层孔菌 P. igniarius 14 13 松杉灵芝 G. tsugae 15 13 内切葡聚糖苷酶编码基因引物Primer of EG 云芝栓孔菌 T. versicolor 19 12 58.00 火木层孔菌 P. igniarius 17 10 松杉灵芝 G. tsugae 14 7 β-葡萄糖苷酶编码基因引物Primer of BG 云芝栓孔菌 T. versicolor 25 18 72.45 火木层孔菌 P. igniarius 24 17 松杉灵芝 G. tsugae 30 23 总计Total 198 140 70.70

本研究得出云芝栓孔菌和火木层孔菌的最适宜生长温度是28 ℃，松杉灵芝的最适培养温度为23 ℃，这与国家食用菌最适培养温度的参考值不一致。刘欣等(2008)研究也表明木蹄层孔菌(Fomes fomentarius)更适合在23 ℃下培养。尽管本研究菌种均采自黑龙江，并且长时间生长在较低温环境下，但不同的菌种却有着不同的温度适应性。

3种白腐菌木质素相关酶活性受木屑诱导显著提高，玉米秸秆为碳源诱导产生的纤维素酶活性均高于木屑碳源样品，原因可能在于纤维素酶属于糖苷水解酶类，是专门催化水解纤维素链中 β-1，4-糖苷键的一类酶的总称，单个纤维素酶的作用是独立的，而不同酶分子之间的作用是相互补偿的，各酶组分之间存在复杂的协同反应关系，因此对不同碳源的响应也十分复杂(张小梅等，2013)。而且，纤维素酶酶活的表达量与菌种的生长速度和生物量没有直接关系，如松杉灵芝生长速度和生物量最低，但其纤维素的表达量却高于其他2菌种。云芝栓孔菌更偏好于木质素酶的表达，而火木层孔菌和松杉灵芝则更偏好于纤维素酶的表达。该结果可以为今后相关酶生产的候选菌种的选择提供依据。

松杉灵芝生长速度较慢，菌丝体较薄、量少，不容易收集，因此严重影响松杉灵芝基因组DNA提取量和效果。本研究选用液体培养基培养菌种，并用于基因组DNA提取，提取效果理想。

在木质素过氧化物酶的研究中，云芝栓孔菌与松杉灵芝的酶活差异较大，但酶基因多态性均在80%左右，差异不大。3种白腐菌的锰过氧化物酶活性为云芝栓孔菌>火木层孔菌>松杉灵芝，但它们的锰过氧化物酶基因多态性变化趋势相反，云芝栓孔菌最低而松杉灵芝最高。在漆酶活性的测定中，松杉灵芝几乎没有产生漆酶，但其漆酶基因多态性却和其他2种白腐菌大致相同。由此可见，3种菌木质素酶活性的大小与其酶基因多态性之间没有明显的对应关系。而3种白腐菌纤维素酶活性大致相同，其基因多态性也比较一致，两者可能存在某种联系，但还有待于进一步研究。