林业科学  2015, Vol. 27 Issue (6): 111-118   PDF    
DOI: 10.11707/j.1001-7488.20150613
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文章信息

訾晓雪, 曹宇, 闫绍鹏, 王秋玉
Zi Xiaoxue, Cao Yu, Yan Shaopeng, Wang Qiuyu
3种白腐菌木质纤维素酶活性及酶相关基因的TRAP标记遗传多态性
Ligocellulolytic Enzyme Activities in Three White-Rot Fungi and Genetic Polymorphism of These Enzyme-Related Genes Using TRAP Marker
林业科学, 2015, 27(6): 111-118
Scientia Silvae Sinicae, 2015, 27(6): 111-118.
DOI: 10.11707/j.1001-7488.20150613

文章历史

收稿日期:2014-01-12
修回日期:2015-04-01

作者相关文章

訾晓雪
曹宇
闫绍鹏
王秋玉

3种白腐菌木质纤维素酶活性及酶相关基因的TRAP标记遗传多态性
訾晓雪, 曹宇, 闫绍鹏, 王秋玉     
东北林业大学生命科学学院 哈尔滨 150040
摘要【目的】木质纤维素是重要的可再生资源,白腐菌对降解木质纤维素具有特殊的优势。研究3种白腐菌的生物学特性、酶学活性以及菌种间的遗传多样性,系统分析3种白腐菌木质纤维素酶的表达与相关基因多态性的关系,为高产木质纤维素酶菌种选育提供理论基础,为白腐菌木材降解分子机制的研究提供科学依据。【方法】以云芝栓孔菌、火木层孔菌和松杉灵芝3种白腐菌为研究材料,测定在不同培养温度下固体培养基中菌落的生长速度和液体培养基中的生物量变化,利用比色法测量白腐菌5种木质纤维素酶活性,运用目标区域扩增多态性(TRAP)分子标记分析3种白腐菌的木质纤维素降解相关酶基因的多态性。【结果】在不同温度下(23,28 ℃),3种白腐菌在PDA固体培养基上的生长速度均为云芝栓孔菌>火木层孔菌>松杉灵芝,云芝栓孔菌和火木层孔菌在28 ℃的生长速度高于23 ℃,而松杉灵芝在23 ℃培养生长更快;液体培养基中云芝栓孔菌的生物量高于火木层孔菌和松杉灵芝。3种白腐菌木质素相关酶活性受木屑诱导显著提高,木质素酶活性最高的是漆酶,其次是木质素过氧化物酶,最低的是锰过氧化物酶;纤维素酶的表达在3种白腐菌中无显著差异,但外切纤维素酶活性明显高于内切纤维素酶活性,玉米秸秆为碳源诱导产生的纤维素酶活性明显高于木屑碳源样品。云芝栓孔菌更偏好于木质素酶的表达,而火木层孔菌和松杉灵芝则更偏好于纤维素酶的表达。TRAP分子标记扩增结果显示,木质素酶相关基因的6对引物共产生109条条带,多态性条带为79条,多态性百分比为72.47%;纤维素酶相关基因的11对引物共产生198条条带,多态性条带为140条,多态性百分率为70.70%。【结论】通过生长速度、生物量、木质纤维素酶活性的检测以及TRAP分子标记结果表明3种白腐菌在种间具有较高的遗传差异。3种白腐菌木质素酶活性的大小与其酶基因多态性之间没有明显的对应关系;3种白腐菌纤维素酶活性大致相同,其基因多态性也比较一致。
关键词白腐菌    木质素酶    纤维素酶    TRAP分子标记    遗传变异    
Ligocellulolytic Enzyme Activities in Three White-Rot Fungi and Genetic Polymorphism of These Enzyme-Related Genes Using TRAP Marker
Zi Xiaoxue, Cao Yu, Yan Shaopeng, Wang Qiuyu     
College of Life Science, Northeast Forestry University Harbin 150040
Abstract: [Objective] Lignocellulose is an important renewable resource in the world, and white-rot fungi have special advantages in degradation of this resource. We studied the biological characteristics, enzymatic activity and genetic diversity of fungi, and analyzed systematically the relationship between woody cellulase expression and the related gene polymorphism, in order to provide a theoretical basis of breeding and molecular mechanisms of white-rot fungi. [Method] Three white-rot fungi, Trametes versicolor, Phellinus igniarius and Ganoderma tsugae, were used to study the growth rate in solid medium under different culture conditions and the biomass in liquid medium. Colorimetric methods were used to measure activities of five kinds of cellulose enzymes, and the target region amplification polymorphism (TRAP) was applied to analyze polymorphisms of three kinds of lignocellulose-degrading enzyme genes. [Result] The results showed that growth rate of the three white-rot fungi was successively Trametes versicolor > Phellinus igniarius > Ganoderma tsugae at different temperatures (23°C and 28°C) on the PDA medium. The growth rate of Trametes versicolor and Phellinus igniarius was higher at 28°C than at 23°C, while this was inverse for Ganoderma tsugae. The biomass of Trametes versicolor in the liquid medium was highest among the three fungi. Spectrophotometry was used to detect the activities of the five ligocellulose enzymes produced by three fungi. Sawdust could markedly increase ligninase activities, however cellulose activity induced by maize straw was higher than that by sawdust as carbon source. The activity of laccase was highest in all the three ligninases, manganese peroxidase was the second and lignin peroxidase was the last. There was no significant difference in the cellulases activities among the three fungi, but exo-cellulase was significantly higher than endo-cellulase. Trametes versicolor had the highest ligninase activity, and the others produced higher cellulase activity. In addition, a total of 109 bands were amplified by 6 primers related to ligninase gene, including 79 polymorphic bands, and the polymorphism ratio was 71.34%. With 11 primers related to cellulase gene, 198 fragments were obtained, of which 140 were polymorphic bands (70.70%). [Conclusion] There existed relatively high genetic differences among these three kinds of white-rot fungi using the detection of growth rate, biomass, enzyme activities and molecular marker. The values of enzyme activities had no corresponding relationship with enzyme gene polymorphism. However, cellulose activities were consistent among fungi, and the same in gene polymorphism. These results would be helpful for the study on mechanism of wood decayed by white-rot fungi.
Key words: white-rot fungi    ligninase    cellulase    TRAP    genetic variation    

白腐菌是木材腐朽菌的一类,在生态系统循环中起到关键的降解作用(戴玉成,2012)。在植物体内,木质素与半纤维素通过化学键紧密连接,包裹在纤维素之外,这种复杂的结构使得纤维素很难被微生物降解(吕世翔等,2009),但白腐菌在降解木质纤维素方面具有特殊的优势(张晓昱等,2004)。

近年来,国内外对白腐菌的各种木质纤维素酶进行了大量研究。主要集中在木质纤维素酶高产菌种选育、木质素降解机制以及污染物降解等方面。吴志显等(2005)对火木层孔菌(Phellinus igniarius)、粗毛盖菌(Funalia gallica)等6 种白腐菌木质素降解的机制进行了初步研究。Kamei等(2012)筛选出一株新的白腐菌Phlebia sp. MG-60,可以在有氧状态下去除木材的木质素,在无氧状态下降解纤维素并糖化发酵生产乙醇。Liew等(2011)利用马占相思木屑对几种热带白腐菌的生物制浆和木质素降解酶活进行研究,结果显示云芝栓孔菌(Trametes versicolor)和针层孔菌(Phellinus sp.)的木质素降解能力更强。

目标区域扩增多态性(TRAP)分子标记技术是利用已知目标基因序列设计固定引物,选择性扩增目的基因的某一特定区域(Miklas et al., 2006)。该技术的优点在于能够产生围绕目标基因序列的多态性标记(Li et al., 2011)。目前已广泛应用于遗传多样性分析、基因定位、遗传图谱构建等方面的研究(Xiao et al., 2010Devarumath et al., 2013张丽群等,2012)。

本研究以帽儿山采集的云芝栓孔菌、火木层孔菌和松杉灵芝为对象,测定其生长速度及几种主要木质纤维素酶活性变化,并采用TRAP-PCR技术探讨3种白腐菌木质纤维素酶相关基因序列间的遗传差异。目的是从分子水平上了解3种白腐菌木质纤维素酶的表达与相关基因多样性的关系,为以后高产木质纤维素酶菌种选育和白腐菌木材降解分子机制的研究提供科学依据。

1 材料与方法 1.1 试验材料

本试验所使用的3种白腐菌均可造成木材海绵状白色腐朽(图 1),即云芝栓孔菌、火木层孔菌和松杉灵芝(Ganoderma tsugae),均采自黑龙江省尚志市东北林业大学帽儿山实验林场。

图 1 云芝栓孔菌(a)、火木层孔菌(b)和 松杉灵芝(c) Fig. 1 Trametes versicolor(a), Phellinus igniarius (b) and Ganoderma tsugae (c)
1.2 菌种的分离与纯化

在无菌的条件下,用含75%的酒精棉擦拭菌体表面,用解剖刀切取子实体中有生命力的菌块(约1 cm2),用75%酒精表面消毒2 min,次氯酸钠溶液消毒1 min,无菌水冲洗3次,然后将组织块切成2 mm2大小,滤纸吸干后接入PDA平板培养基上,置于28 ℃下恒温培养,待菌丝体覆盖整个平板后用接种针挑取尖端菌丝转接到新的PDA培养基上,如此反复使菌株纯化。将纯的白腐菌株转接到白桦(Betula platyphylla木屑麦麸培养基上,置于28 ℃培养箱中继续培养,待菌丝体长满试管放入4 ℃冰箱中保存。

1.3 3种白腐菌生长特性比较

用打孔器取直径约0.75 cm大小的菌饼接种到PDA培养基中,分别放入23,28 ℃培养箱中培养,每12 h测量记录培养基中的菌落直径,每个菌种设3个重复。每20 mL马铃薯-葡萄糖液体培养基(200 g·L-1马铃薯,20 g·L-1葡萄糖)接入一个直径约0.75 cm的菌饼,在28 ℃、150 r·min-1摇床中震荡培养,每隔48 h取出,过滤并用蒸馏水冲3次,放入100 ℃烘箱中烘至恒质量后称量,每个菌种设3个重复。

1.4 木质纤维素降解相关酶活性检测 1.4.1 木质素酶粗酶液制备

白桦木屑的处理: 干燥的白桦木屑经粉碎机粉碎后用蒸馏水多次冲洗,经6层纱布过滤最后放入烘箱中烘干备用。

在20 mL马铃薯-葡萄糖液体培养基中加入1 g白桦木屑,分别接种3种白腐菌菌饼1块(直径约0.75cm),无白桦木屑的马铃薯-葡萄糖液体培养基为对照,每个菌种设3个重复。分别培养3,6,9天后取出,培养液在10 000 r·min-1离心10 min,上清液即为粗酶液。

1.4.2 纤维素酶粗酶液制备

麦麸的处理: 干燥的麦麸用蒸馏水多次冲洗,经4层纱布过滤后,放入烘箱中烘干,经粉碎机粉碎后备用。

培养液中各物质的质量分数分别为: 2%(NH4)2SO4,0.1% KH2PO4,0.5% MgSO4·7H2O,0.01%CaCl2,0.01%NaCl,0.005%FeSO4·7H2O,0.001 6%MnSO4·H2O,0.001 4%ZnSO4·7H2O,0.002% CoCl2

在50 mL三角瓶中加入1 g烘干的麦麸碎屑或白桦木屑及10 mL培养液,灭菌后接入菌饼(直径约0.75 cm),分别培养3,6,9天后,向培养物中加入5倍质量的蒸馏水,盖上封口膜浸泡12 h,随后用2~3层纱布过滤,培养液在6 000 r·min-1离心10 min,取上清即为粗酶液。

1.4.3 酶活测定

木质素过氧化物酶(LiP)活性测定参见文献(董旭杰等,2007),锰过氧化物酶(MnP)活性测定参见文献(徐淑霞等,2007),漆酶(Lac)活性测定参见文献(李慧蓉,2005)。内切纤维素酶活测定参见文献(Deswal et al., 2011),外切纤维素酶活测定参见文献(Li et al., 2007)。

1.5 3种白腐菌木质纤维素酶相关基因的TRAP-PCR检测

利用CTAB法提取3种白腐菌的基因组DNA,紫外分光光度计(UV-1800,Japan)检测DNA浓度。引物设计: 来自NCBI数据库的木质纤维素降解相关酶基因为靶标基因序列,设计固定引物用于TRAP-PCR,筛选出产生多态性条带的引物用于PCR扩增(PTC-100,Germany)。PCR反应条件: 在20 μL反应体系中,ddH2O11.2 μL、10×buffer 2 μL、Mg2+(25 mmol·L-1)2.0 μL、dNTP(10 mmol·L-1)0.6 μL、固定引物(10 μmol·L-1)1.5 μL、随机引物(10 μmol·L-1)1.5 μL、模板DNA 100 ng、TaqDNA聚合酶0.2 μL。PCR程序为: 94 ℃ 5 min; 94 ℃ 1 min,35 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,5个循环; 94 ℃ 1 min,56 ℃ 1 min,72 ℃ 90 s,35个循环; 4 ℃保存。PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶,以100 V缓冲电压,1×TAE缓冲液电泳分离,使用UPS凝胶成像系统(Universal HoodⅡ,BioRad)检测结果。

1.6 数据处理与统计分析方法

采用SPSS17.0统计学软件进行木质纤维素酶间方差(单因素和双因素)和显著性分析。

多态位点比率(PPB): PPB=多态位点数/检测到的位点总数×100%。

2 结果与分析 2.1 3种白腐菌在PDA固体培养基中生长速度的比较

在不同温度下,3种白腐菌的生长情况见图 2。28 ℃时,云芝栓孔菌、火木层孔菌和松杉灵芝的菌落平均生长速度(直径变化)分别为7.0,3.6和2.6 mm·d-1; 而在23 ℃培养条件下,3种白腐菌的生长速度分别为6.0,3.4和3.2 mm·d-1。说明云芝栓孔菌生长受温度变化影响较大,28 ℃更适合其生长; 火木层孔菌菌丝体长满平板需要12天,温度差异对这种真菌影响不明显; 松杉灵芝是3种白腐菌中生长最慢的菌株,生长天数也相对较长一些,但与其他菌种相比,23 ℃更适合其生长。

图 2 3种白腐菌在28 ℃(a)、23 ℃(b)PDA培养基生长情况 Fig. 2 Growth rate of three white-rot fungi in PDA medium at 28 ℃(a) and 23 ℃(b)
2.2 3种白腐菌在液体培养基中生物量比较

3种木材白腐菌生物量变化如图 3所示,它们在液体培养基中的生物量变化很大,云芝栓孔菌从第2天开始进入对数期,生长速度比较快,在第10天生物量达到最大值后迅速进入衰亡期; 火木层孔菌延迟期为0~4天,随后生物量直线上升,到第10天时达到同期云芝栓孔菌的42.36%,对数期时间较长,16天还未到达平台期; 松杉灵芝的生物量最低,延迟期为0~6天,第10天仅达到同期云芝栓孔菌的9.27%,第12天达到其生物量最大值248 mg,随后逐渐下降,第16天降到135.8 mg。

图 3 液体培养基中3种白腐菌生物量的变化 Fig. 3 Biomass changes of three white-rot fungi in liquid culture
2.3 3种白腐菌木质纤维素降解相关酶活性变化 2.3.1 3种白腐菌木质素降解相关酶活性变化

木质素过氧化物酶活性如图 4a所示,云芝栓孔菌受木屑诱导处理与对照间的差异极显著,F=34.859***(表 1),在相同培养条件下,云芝栓孔菌表达的木质素过氧化物酶活性最强。3种白腐菌的锰过氧化物酶活性与生长天数关系紧密,随着培养时间的增加而递增,之后持平或略有下降(图 4b)。其中,火木层孔菌木屑诱导处理与对照间的差异显著,F=10.424*。3种白腐菌漆酶活性表达量最高,变化较大(图 4c)。其中,云芝栓孔菌漆酶活性最高,松杉灵芝基本没有漆酶产生。3种白腐菌的漆酶活性受木屑诱导显著提高,且随生长天数递增。3种酶活性均随培养时间的增加而增强。

图 4 3种白腐菌木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶活性 Fig. 4 Activities of lignin peroxidase, manganese peroxidase and laccase of three white-rot fungi
表 1 3种白腐菌漆酶、锰过氧化物酶、木质素过氧化物酶活性方差分析 Tab.1 The variance analysis of the activities of three main lignin degradation enzymes
2.3.2 3种白腐菌纤维素降解相关酶活性变化

图 5所示,3种白腐菌在麦麸作为碳源诱导产生的内切β-葡聚糖酶酶活性均高于木屑碳源样品。火木层孔菌产酶能力最强,云芝栓孔菌产酶能力最低,但不同菌种间差异不明显。3种白腐菌在麦麸作为碳源诱导产生的外切β-葡聚糖酶活性均高于木屑碳源样品,松杉灵芝受木屑诱导处理与对照间的差异极显著,F=69.894**(表 2)。3种白腐菌在培养第3天时EC酶活最强,之后随着培养天数的增加而降低,云芝栓孔菌降幅最为明显,火木层孔菌降幅居中,松杉灵芝降幅最小。

图 5 3种白腐菌内切β-葡聚糖酶和外切β-葡聚糖酶活性 Fig. 5 Activities of endoglucanase(EG) and exoglucanase(EC) by three white-rot fungi
表 2 3种白腐菌内切β-葡聚糖酶、外切β-葡聚糖酶活性方差分析 Tab.2 The variance analysis of the activities of endoglucanase (EG) and exoglucanase(EC)
2.4 3种白腐菌木质纤维素酶相关基因的TRAP标记的遗传变异 2.4.1 TRAP引物筛选

经预试验扩增筛选,从64对TRAP引物中确定了扩增后条带清晰、多态性高的17对引物: LiP2-me2,MnP1-me1,MnP2-em3,Lac1-em2,Lac1-em3,Lac2-em3,CBHⅠ1-em2,CDH1-em2,CDH1-em3,CDH2-em3,EG1-em2,EG1-em3,EG2-me2,β1-em2,β1-em3,β2-em2,β2-me1。引物序列如表 3所示(王玉英等,2012应正何,2006)。

表 3 3种白腐菌TRAP-PCR引物序列 Tab.3 TRAP-PCR primers of three white-rot fungi
2.4.2 3种白腐菌木质纤维素酶相关基因的TRAP-PCR的多态性

3种白腐菌木质素相关酶基因的TRAP-PCR结果见图 6。采用LiP编码基因引物对3种白腐菌基因组DNA扩增后共产生15条条带,云芝栓孔菌多态性比率为83.33%,火木层孔菌50%,松杉灵芝85.71%,物种间多态性比率为80%。MnP编码基因的2对引物对3种白腐菌基因组DNA扩增后共产生22条条带,云芝栓孔菌多态性比率为80%,火木层孔菌为87.5%,松杉灵芝88.89%,物种间多态性比率为86.36%。Lac编码基因引物的TRAP-PCR结果显示,共产生72条条带,云芝栓孔菌多态性比率71.43%,火木层孔菌60%,松杉灵芝80%,物种间多态性比率为66.67%。由此得出3种白腐菌的LiP基因、MnP基因和Lac基因在种内和种间均存在较高的遗传差异(表 4)。

图 6 木质素相关基因TRAP-PCR电泳 Fig. 6 TRAP-PCR Electrophoresis of ligninase-related genes 1,2,7,8,13,14,19,20:云芝栓孔菌T.versicolor;3,4,9,10,15,16,21,22:火木层孔菌 P.igniarius;5,6,11,12,17,18,23,24:松杉灵芝 G.tsugae;M:DL 2000 Marker.
表 4 木质素酶相关基因TRAP-PCR的多态位点百分率 Tab.4 Polymorphic loci percentage of the ligninase-related genes by TRAP-PCR

3种白腐菌纤维素相关酶基因的TRAP-PCR结果见图 7。用CBH编码基因引物对3种白腐菌基因组DNA扩增后共产生31条条带,云芝栓孔菌多态性比率57.14%,火木层孔菌66.67%,松杉灵芝58.33%,物种间多态性比率为61.29%; 用CDH编码基因引物对3种白腐菌基因组DNA扩增后共产生38条条带,云芝栓孔菌多态性比率88.89%,火木层孔菌92.85%,松杉灵芝86.67%,种群间多态位点比率为72.91%; 用EG编码基因引物对3种白腐菌基因组DNA扩增后共产生50条条带,云芝栓孔菌多态性比率63.15%,火木层孔菌58.82%,松杉灵芝50%,物种间多态性比率为58%; 用β-葡萄糖苷酶编码基因引物对3种白腐菌基因组DNA扩增后共产生72条条带,多态性条带为58条,云芝栓孔菌多态性比率72%,火木层孔菌70.83%,松杉灵芝57.5%,物种间多态性比率72.45%。由此得出3种白腐菌间的纤维素降解相关基因的遗传多样性较高(表 5)。

图 7 纤维素酶相关基因TRAP-PCR电泳 Fig. 7 TRAP-PCR electrophoresis of cellul-related genes (1,2,7,8,13,14,19,20:云芝栓孔菌T. versicolor; 3,4,9,10,15,16,21,22:火木层孔菌P.igniarius; 5,6,11,12,17,18,23,24:松杉灵芝G.tsugae;M:DL 2000 Marker.
表 5 纤维素酶相关基因TRAP-PCR的多态位点百分率 Tab.5 Polymorphic loci percentage of the cellulase-related genes by TRAP-PCR
3 结论与讨论

本研究得出云芝栓孔菌和火木层孔菌的最适宜生长温度是28 ℃,松杉灵芝的最适培养温度为23 ℃,这与国家食用菌最适培养温度的参考值不一致。刘欣等(2008)研究也表明木蹄层孔菌(Fomes fomentarius)更适合在23 ℃下培养。尽管本研究菌种均采自黑龙江,并且长时间生长在较低温环境下,但不同的菌种却有着不同的温度适应性。

3种白腐菌木质素相关酶活性受木屑诱导显著提高,玉米秸秆为碳源诱导产生的纤维素酶活性均高于木屑碳源样品,原因可能在于纤维素酶属于糖苷水解酶类,是专门催化水解纤维素链中 β-1,4-糖苷键的一类酶的总称,单个纤维素酶的作用是独立的,而不同酶分子之间的作用是相互补偿的,各酶组分之间存在复杂的协同反应关系,因此对不同碳源的响应也十分复杂(张小梅等,2013)。而且,纤维素酶酶活的表达量与菌种的生长速度和生物量没有直接关系,如松杉灵芝生长速度和生物量最低,但其纤维素的表达量却高于其他2菌种。云芝栓孔菌更偏好于木质素酶的表达,而火木层孔菌和松杉灵芝则更偏好于纤维素酶的表达。该结果可以为今后相关酶生产的候选菌种的选择提供依据。

松杉灵芝生长速度较慢,菌丝体较薄、量少,不容易收集,因此严重影响松杉灵芝基因组DNA提取量和效果。本研究选用液体培养基培养菌种,并用于基因组DNA提取,提取效果理想。

在木质素过氧化物酶的研究中,云芝栓孔菌与松杉灵芝的酶活差异较大,但酶基因多态性均在80%左右,差异不大。3种白腐菌的锰过氧化物酶活性为云芝栓孔菌>火木层孔菌>松杉灵芝,但它们的锰过氧化物酶基因多态性变化趋势相反,云芝栓孔菌最低而松杉灵芝最高。在漆酶活性的测定中,松杉灵芝几乎没有产生漆酶,但其漆酶基因多态性却和其他2种白腐菌大致相同。由此可见,3种菌木质素酶活性的大小与其酶基因多态性之间没有明显的对应关系。而3种白腐菌纤维素酶活性大致相同,其基因多态性也比较一致,两者可能存在某种联系,但还有待于进一步研究。

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