杨树(Populus)是林木中的模式树种，溃疡病是杨树的一种重要病害。转录因子受到多种生物和非生物胁迫的调控，尤其是在植物抵御病原物侵害的抗病反应中具有重要的调控作用。当植物受到不同病原，如病毒、细菌、真菌和卵菌侵染时，其基因的转录、蛋白合成及结合活性都有显著变化，从而调节不同的抗性反应。在烟草花叶上被烟草花叶病毒诱导的部位，有WRKY基因表达(Yoda et al.，2002)；WRKY33 在拟南芥(Arabidopsis thaliana)抗病反应中发挥重要作用(Lai et al.，2011)；杨祥燕等(2009)在研究菠萝锌指蛋白基因的克隆与表达时，指出锌指蛋白作为转录因子参与植物的抗逆境代谢调控； Aoun等(2010)利用SSH-cDNA研究病原菌(Ophiostoma novo-ulmi)诱导美国榆(Ulmus americana)时，共获得638个克隆，其中转录因子占3%。

目前关于杨树溃疡病的研究还主要集中在溃疡病菌的鉴定、防治以及诱导后microRNA的鉴定、与病程相关的一些差异蛋白的表达等(崔晓琦，2012；高瑞岐，2010；陈磊，2012；理永霞，2011)，为了更好地了解杨树抗病防御的分子机制，必须鉴定抗性信号途径中的转录调控成分，阐明它们在抗病机制建立中的调节作用。本文运用SSH-cDNA 文库、生物信息学和RT-qPCR技术研究杨树溃疡病致病菌侵染后转录因子及其相关基因的表达响应，探讨转录因子在杨树抗病防御反应中的功能，为阐明杨树对溃疡病的抗性机制提供线索，为杨树优良抗病品种的选育提供科学依据。

毛白杨(Populus tomentosa)：高抗树种，15年生，感病指数为0～6.0(杨俊秀等，1990)，生长于中国林业科学研究院院内。采集1年生、外观无病无损伤的健康毛白杨枝条进行扦插。扦插后1个月左右苗木基本生根，挑选生长良好，生长状态较为一致的幼苗进行定植。幼苗长至7月龄时选择100株用于试验，此时毛白杨苗高105.87 cm±2.90 cm，地径0.75 cm±0.03 cm。

试验菌株：葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)菌株，菌株号CXY001，分离于北京杨(P.beijingensis)溃疡病斑，然后经单孢培养鉴定，再回接，以此确认致病性(致病力中等)。菌株保存于中国林科院菌种保藏中心。

试验前，先将病原菌活化，参考赵仕光等(1999)的接种方法并稍加修改。采用针刺菌饼接种法对温室内盆栽的7月龄毛白杨干部进行接种。对照采用接种无菌培养基。接种在苗木根颈处向上15 cm左右，每株苗木选3个接种点，间隔大约30 cm，每个样本重复3次。

接种72 h后取样，采用锋利的无菌刻刀截取接种点周围0.5 cm×1 cm长条形树苗干部树皮(带形成层)，约每500 mg样品用锡铂纸包好后，迅速投入液氮中，保持样品的新鲜，于-80 ℃贮存备用。

采用鼎国公司的植物RNA提取试剂盒对杨树树皮的总RNA进行提取，用该公司的Plant RNAzol试剂盒提取真菌的总RNA。

通过微量紫外分光光度计测出RNA量，利用Promega公司提供的分离纯化试剂盒[PolyA Tract SystemsⅢ(Z5300)]从总RNA中分离并纯化mRNA，然后电泳检测mRNA的完整性。

按照Clontech公司提供的试剂盒PCR-Select^TMcDNA Subtraction Kit进行构建。以真菌处理的毛白杨树皮作为试验方，参照方一部分来源于培养基处理的毛白杨树皮的mRNA，另一部分来源于培养的真菌mRNA，建立正向差减cDNA 文库。

将正向差减的所有PCR产物与 pMD-19T载体连接，导入感受态细胞，进行克隆。在所有的克隆中将白色克隆挑取出来，加入96孔细胞培养板中(含有Amp/LB液体培养基)，摇床培养。吸取菌液，扩增，检测插入片段的大小。

使用7月龄苗木进行试验。试验分对照和测试方，把不接种溃疡病菌作为对照，而接种溃疡病菌的作为测试方。分别于接种后12，24，48，72，96和144 h 取样，剪取对照和接种材料的树皮置于液氮中，-80 ℃保存备用。每个接种时间处理5株毛白杨，重复3次。

以Elongation factor 1 alpha(EF-1α)作为内参，根据内参基因设计特异性引物，依此来设计PCR反应的循环数及目的基因扩增的模板量。荧光实时定量RT-PCR采用SYBR GREEN PCR MasterMix(TOYOBO)试剂盒，在7500循环仪上(Biorad)进行。Real-time PCR 反应体系包括2 × SYBR Green Supermix(Qiagen Inc.)15 μL，正向和反向引物各0.5 μL，cDNA 2 μL。PCR 反应条件：95 ℃ 10 min，94 ℃ 20 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，在72 ℃采集荧光信号，45个循环；循环结束后进行溶解曲线分析，每个样品做3个平行样，每次试验设置阴性对照。

由鼎国(北京)测序公司完成。测序完成后，将获得的EST序列进行EST前处理，剔除不符合要求的序列，然后递交NCBI，通过NCBI上的BLAST(或者BLASTN)序列比对工具，在GenBank 的dbEST数据库上对EST序列进行同源检索分析。

从总RNA中分离纯化得到mRNA(图 1-a，b)。经微量紫外分光光度计计算可知28S：18S接近2：1；经琼脂糖电泳检测，没有DNA污染且未被降解，完整性较好。因此，所获得的mRNA可以用于差减文库的构建。

	图 1 总RNA及mRNA电泳 Fig. 1 Electrophoresis of total RNA and mRNA preparation J:真菌Fungi; D:对照Control；T:处理CK；M: Marker DL2000.

经2轮抑制PCR后，在tester与Tester Control二者的样品中都扩增出弥散条带，消去了tester与driver共有的转录产物，只有tester特有的基因或表达增强的基因被选择性留下。因此，经过消减杂交后，PCR扩增的条带要比未经消减杂交时扩增的条带亮度弱，表明抑制差减杂交的效果较好，可以进行产物的克隆和转化(图 2)。

图 2 经2次抑制的PCR产物电泳 Fig. 2 Secondary PCR products electrophoresis E1：第1次正向差减PCR；1-c：第1次正向未差减PCR；E2：第1次反向差减PCR；2-c：第1次反向未差减PCR。 pE1第2次正向差减PCR；p1-c：第2次正向未差减PCR；pE2：第2次反向差减PCR；p2-c：第2次反向未差减PCR。 E1：Forward subtractive first PCR product; 1-c:Forward not subtractive first PCR product; E2:The reverse subtractive first PCR product; 2-c Reverse is not subtractive first PCR product; pE1:Forward subtractive second PCR products; p1-c: Forward not subtractive second PCR products; pE2: Reverse subtractive second PCR products; p2-c: Not reverse subtractive second PCR products.

将PCR产物与 pMD-19T载体连接，导入感受态细胞，进行克隆(图 3)。克隆的插入片段大小均有差异，由标准分子量(DL2000)可知，插入片段300~500 bp。因此，与四碱基内切酶(RsaⅠ理论酶切片段小于600 bp)的理论酶切结果相符。

	图 3 差减cDNA文库部分克隆的PCR扩增结果 Fig. 3 PCR amplification results of cDNA library partial clones subtractive M：Marker DL2000

在GenBank 的dbEST数据库上对EST序列进行同源检索分析，分析显示有10个ESTs与GenBank现有的已知植物基因(蛋白)的转录因子具有不同程度的相似性，同时还发现3个ESTs(NAD激酶、DGDG合酶2和甘油醛-3-磷酸脱氢酶)与转录因子紧密相关(表 1)。

表 1 溃疡病菌侵染毛白杨SSH-cDNA文库中筛选出的转录及相关基因 Tab.1 Transcription related gene during the interaction with Botryosphaeria dothidea based on differential screening

表 1溃疡病菌侵染毛白杨SSH-cDNA文库中筛选出的转录及相关基因 Tab.1 Transcription related gene during the interaction with Botryosphaeria dothidea based on differential screening 毛白杨EST P.tomentosa EST 总数Total number 功能预测Putative function E 与转录相关Implication in transcription CXY1421 CXY0118 CXY0147 CXY0543 CXY0134 CXY1218 CXY0113 3 3 3 1 1 1 1 锌指蛋白Zinc finger protein(Cys/His-rich)[辐射松 Pinus radiata] 类CONSTANS蛋白CONSTANS-like protein [欧洲云杉 Picea abies] 普通转录因子Transcription factor[蓖麻 Ricinus communis] WRKY21转录因子 WRKY 21[( Populus tomentosa×P. bolleana)×P. tomentosa] NAD激酶NAD kinase[Ricinus communis] DGDG合成酶2Digalactosyldiacylglycerol synthase 2 甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH 2E-29 2E-39 3E-06 8E-13 5E-07 8E-27 2E-139 含EAR转录区域Containning the EAR transcriptional repressor 编码核蛋白Encoding a nuclear protein 调节转录Regulate transcription 参与防御信号转录WRKY participate in the plant defense 催化NAD和NADHCatalyzing NAD and NADH DGDG 合酶基因DGDG synthase genes 细胞死亡信号Cell death signalling pathway

经过多系列比对结果，发现杨树的锌指蛋白与辐射松(Pinus radiata)锌指蛋白具有较高的同源性，达到94%，都有一个半胱氨酸富含区；CONSTANS-like protein与欧洲云杉(Picea abies)中该蛋白同源性为91%；WRKY21与[Populus tomentosa×P. Bolleana]×P. tomentosa中的WRKY21具有较高同源性。已有研究证实，有很多植物来源的转录因子在抗逆信号中发挥着重要功能(Ryu et al.，2006；van Verk et al.，2008；彭喜旭等，2011；刘志伟等，2010)。因此，在接种溃疡病菌后，这些转录因子作为调控因子在抗病信号传导途径中起重要作用。

对6个基因在6个时间点(12，24，48，72，96和144 h)的Real-time PCR验证结果如表 2所示。

表 2 6个时间点不同基因的表达量变化 Tab.2 Expression change of the 6 time points of different genes

表 26个时间点不同基因的表达量变化 Tab.2 Expression change of the 6 time points of different genes 基因Gene 12 h 24 h 48 h 72 h 96 h 144 h CXY1421 ↓ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑(50倍50 times) CXY0118 ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑(2.5倍2.5 times) CXY0543 → ↓ → ↓ ↑ ↓(0.94倍0.94 times) CXY0134 ↓ ↑ ↓ ↑ ↑ ↑(2倍2 times) CXY1218 ↓ ↑ ↓ ↓ ↓ ↓(0.8倍1.8 times) CXY0113 ↑ ↓ ↓ ↓ ↑ ↑(2倍2 times)

由此可见，CXY1421[zinc finger protein(Cys/His-rich)]基因在溃疡病菌诱导初期，表达量下降，随后表达量升高，当诱导144 h后，表达量是初始量的50倍(图 4)。

	图 4 基因表达与诱导时间的关系 Fig. 4 CXY1421 Gene expression and relationship between induction time

CXY0543(WRKY21)基因未诱导时有一定量的本底表达，溃疡病菌诱导12 h 后，表达量基本没变；在以后时间内其表达量有升有降，始终接近本底表达量，诱导144 h后，表达量仅为初始量的0.94倍(图 5)。

	图 5 WRKY21基因表达与诱导时间的关系 Fig. 5 Gene expression and relationship between induction time

当溃疡病菌诱导12 h 后，CXY0113(GAPDH)表达水平缓慢升高；诱导24~96 h内，随着诱导时间的延长，基因表达量呈下降趋势；诱导96 h 后，表达水平升高；诱导144 h后，表达量是初始量的2倍。

当溃疡病菌诱导12 h 后， CXY0134(NAD kinase)基因的表达量下降；诱导24 h 后，表达量有逐渐升高的趋势；诱导48 h 后，表达水平又下降；诱导 72 h 后，表达水平迅猛升高；诱导 96 h 后，表达水平基本保持不变。基因的表达量在诱导72 h内，一直在本底水平上下浮动；72 h后升高，直至144 h，表达水平处于平稳状态，是初始量的2倍。

CXY1218(Digalactosyldiacylglycerol synthase 2)基因在溃疡病菌诱导12 h 后，表达量开始下降；诱导24 h 后，表达水平又有升高的趋势；诱导48 h 后，随着诱导时间的延长，表达量逐渐下降，直至诱导144 h，表达量是初始的1.8倍。

CXY0118(CONSTANS-like protein)基因在溃疡病菌诱导初期有一定量的本底表达，整个诱导过程的表达量一直处于升高的趋势，直到诱导至144 h，表达量达到初始量的2.5倍(表 2)。

本研究表明：上述6个基因的表达都受到溃疡病菌的诱导，表达量最高的增至50倍。因此，这些基因可响应溃疡病菌诱导并且在诱导过程中起潜在的重要作用。

转录因子在植物防卫反应基因的表达调控中起关键作用，特别是单个植物防御反应基因的超表达可增强植物对特定病原物的抵抗能力，而一个转录因子基因的超表达能够激活多个下游抗病基因的表达。因此，利用防御反应相关转录因子基因来改良植物的综合抗病性，是一条很有潜力的分子育种途径(李蕾，2006)。

目前，锌指蛋白(CXY1421)主要集中用于逆境研究(Martin et al.，2012；Huang et al.，2008；李晓君等，2011)，抗病研究应用比较少。本试验中，毛白杨树皮经溃疡病原菌感染后，CXY1421接受了溃疡病原菌传递的胁迫信号，并同时调控溃疡病菌基因的表达。CXY1421基因的表达水平随诱导时间延长而提高，在诱导初期增长缓慢，诱导48 h后逐渐升高，到144 h达到最高，此时毛白杨抗溃疡病反应可能达到最高潮。

当植物受到病原菌侵染后，会启动自身免疫应答系统来防卫病原菌的侵害，这个过程中涉及一系列抗病相关基因的转录表达，其中WRKY起了重要的转录调节作用(李冉等，2011)。在植物抗病方面，Dong等(2003)研究了72个拟南芥WRKY的作用，发现其中的49个WRKY会受到病原菌 Pseudomonas syringae pv. tomato和SA(salicylis acid)的诱导，从而使表达产生变化，进而调节相关基因来参与拟南芥的抗病过程。本研究中 WRKY(CXY0543)转录因子随着诱导时间的延长，表达量先升高(诱导12~24 h)，然后降低(诱导24~96 h)，可能是因为诱导96 h时后，WRKY参与的抗溃疡病防御反应逐渐结束，表达水平又逐渐回到初始状态，即接近本底表达量。

NAD激酶(CXY0134)，NAD是NADK作用的底物，NADK催化NAD与ATP生成NADP，NAD与NADP是细胞溶质中起关键作用的氧化剂，二者含量的改变不仅引起细胞氧化还原状态的改变，而且引起细胞信号转导途径的改变(Graham，2006)。 GAPDH(CXY0113)属于结合酶，需要NAD或NADP辅酶的参与才有活性。Tien等(2012)首次分析了水稻(Oryza sativa)胞质OsGAPDH晶体结构，并通过对菠菜(Spinacia oleracea)叶绿体GAPDH(SoGAPDH)晶体结构的比较研究，提出了高等植物中GAPDH与NAD或NADP特异性互作的机制。GAPDH除了与抗氧化有关系，还与抗病性有关，如马铃薯(Solanum tuberosum)的GAPDH基因受病原物侵染诱导表达(Laxalt et al.，1996)；大豆疫霉(Phytophthora sojae)的PsGapdh在病原菌侵染早期转录水平提高了3倍，表明该蛋白可能参与了大豆疫霉的早期侵染过程(曾娟等，2006)。由于在植物与病原菌互作过程的早期，氧暴发是最重要的事件之一，GAPDH可能参与了溃疡病菌对氧化压力的抵抗过程。

CONSTANS-like protein(CXY0118)的基因编码锌指蛋白，是拟南芥光周期调控开花途径的关键性组分(Putterill et al.，1995)；Digalactosyldiacylglycerol synthase 2在拟南芥中促进花的器官发育(Botté et al.，2011)。

由此可见，植物防御侵染的过程不单一基因的调节过程，而是多种基因参与、相互交叉又相对独立的复杂过程，表现了生物体生命活动协调性和完整性的统一。