林业科学  2015, Vol. 51 Issue (2): 80-89   PDF    
DOI: 10.11707/j.1001-7488.20150210
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文章信息

魏晓玲, 程龙军, 窦锦青, 徐凤华
Wei Xiaoling, Cheng Longjun, Dou Jinqing, Xu Fenghua
巨桉EgrDREB2A基因结构及表达特性分析
The Structure and Expression Characteristics of EgrDREB2A Gene in Eucalyptus grandis
林业科学, 2015, 51(2): 80-89
Scientia Silvae Sinicae, 2015, 51(2): 80-89.
DOI: 10.11707/j.1001-7488.20150210

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收稿日期：2014-04-21
修回日期：2014-05-23

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魏晓玲
程龙军
窦锦青
徐凤华

引用本文
魏晓玲, 程龙军, 窦锦青, 徐凤华. 2015. 巨桉EgrDREB2A基因结构及表达特性分析[J]. 林业科学, 51(2): 80-89.
Wei Xiaoling, Cheng Longjun, Dou Jinqing, Xu Fenghua. 2015. The Structure and Expression Characteristics of EgrDREB2A Gene in Eucalyptus grandis. Scientia Silvae Sinicae, 51(2): 80-89.  DOI: 10.11707/j.1001-7488.20150210
巨桉EgrDREB2A基因结构及表达特性分析
魏晓玲, 程龙军, 窦锦青, 徐凤华    
浙江农林大学 亚热带森林培育国家重点实验室培育基地 临安 311300
收稿日期：2014-04-21；修回日期：2014-05-23
基金项目：国家"863"项目子项目"白桦、桉树等分子育种与品种创制"(2011AA100202)；国家自然科学基金项目"巨桉锌指结构蛋白基因EgrZPCT在抗冷胁迫中功能和调控机制研究"(31270657)。
通讯作者：程龙军
摘要：【目的】 从低温条件下巨桉mRNA抑制消减杂交(SSH)文库中筛选得到一个受低温诱导的基因 EgrDREB2A (Eucgr. G03094)，通过对其蛋白序列特征、亚细胞定位特点以及低温、ABA和盐胁迫逆境处理条件下基因表达方式的分析，讨论 EgrDREB2A 在巨桉非生物逆境响应中所发挥的作用。【方法】 使用SMART，MatInspector和MEGA等生物信息学软件，分析 EgrDREB2A 的序列和编码蛋白特征，搜寻启动子上的重要顺式作用元件并构建其蛋白序列进化树； 亚细胞定位采用基因枪轰击洋葱表皮的方法； EgrDREB2A 组织表达特异性及低温、ABA和盐胁迫条件下的基因表达分析分别采用半定量和定量RT-PCR方法进行； 在4 ℃低温下随处理时间(0.5，2，6，12，24，48 h)的基因数字表达谱基础上，用WGCNA和Cytoscape软件对 EgrDREB2A 进行基因共表达分析。【结果】 EgrDREB2A 编码的蛋白序列含有1个典型的AP2结构域，且结构域内部包含YRG和RAYD 2个保守区，属于DREB2类基因，进化树构建结果表明该基因属于DREB2类基因的亚型Ⅰ。 EgrDREB2A 启动子序列上含有多个与植物逆境响应相关的顺式作用元件。该基因有明显的核定位区，亚细胞定位结果也表明其编码蛋白主要在核中表达。正常条件下，根、茎和叶中 EgrDREB2A 都有表达，但叶片中表达水平相对较高。在不同低温(0，2，4，6，8 ℃)下 EgrDREB2A 被强烈诱导，4 ℃低温下随处理时间(0.5，2，6，12，24，48 h)的延长，其表达量呈上升趋势，不同时间处理下与 EgrDREB2A 具有共表达关系的基因多属于参与植物对逆境响应的基因。ABA(100 μmol·L-1)对 EgrDREB2A 的表达表现为先促进而后抑制，而NaCl(200 mmol·L-1)的处理则表现为先抑制后促进。昼夜节律同样影响 EgrDREB2A 的表达，光照下基因表达升高，黑暗条件下基因表达降低。【结论】 巨桉 EgrDREB2A 属于DREB2类基因，其表达受低温诱导，同时受ABA、盐和昼夜节律的影响。该基因启动子序列上启动子元件及与其共表达基因大多与植物逆境响应有关。这些结果表明 EgrDREB2A 可能在巨桉抵抗非生物逆境因子的过程中发挥比较重要的作用。
关键词： 巨桉    EgrDREB2A    基因表达    非生物胁迫    昼夜节律    
The Structure and Expression Characteristics of EgrDREB2A Gene in Eucalyptus grandis
Wei Xiaoling, Cheng Longjun, Dou Jinqing, Xu Fenghua    
The Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture Zhejiang A&F University Lin'an 311300
Abstract: [Objective] A gene, EgrDREB2A , was isolated from the mRNA suppression subtractive hybridization library of Eucalyptus grandis (Eucgr. G03094). Based on the analysis of structure, subcellular localization of EgrDREB2A protein and gene expression under different treatments of low temperature, ABA and salt, the roles of EgrDREB2A in the resistance to abiotic stresses of Eucalyptus grandis were discussed. [Method] SMART and MatInspector softwares were used to analyze the protein structure of EgrDREB2A and the cis-elements in promoter sequence of the gene. Phylogenetic tree of DREB proteins was constructed by MEGA software. Subcellular localization of EgrDREB2A was characterized with the method of introducing EgrDREB2A-GFP fused genes into onion epidermal cells via gene gun bombardment. And, gene expression analysis in different tissue, under treatments of low temperature, ABA, salt and circadian rhythm were carried out by semi-quantitative and quantitative RT-PCR method respectively. For the gene co-expression of EgrDREB2A under different time treatment at 4 ℃, WGCNA and Cytoscape softwares were used. [Result] EgrDREB2A was classed into DREB2 group because the protein it encodes containing one AP2 domain which including a YRG and a RAYD conserved regions. The phylogenetic tree based on homology comparison showed it belonging to subtypeⅠof DREB2 group. Several cis-elements related with plant stress response were found in the EgrDREB2A promoter sequence. Nuclear localization with DREB2 merged protein with GFP implied EgrDREB2A mainly located in the nucleus. qRT-PCR result of EgrDREB2A under 0 ℃, 2 ℃,4 ℃, 6 ℃ and 8 ℃ revealed it was induced. Time course (0.5, 2, 6, 12, 24, 48 h) treatments to E. grandis seedlings at 4 ℃ also increased its expression as the time delayed. The genes co-expressed with EgrDREB2A under different time treatment at 4 ℃ were mostly associated with plant response to abiotic stresses. EgrDREB2A expression increased at the first and then decreased under 100 μmol·L-1 ABA treatment. However, under the salt stress (200 mmol·L-1), it was inhibited firstly and then induced. Circadian rhythm also regulates the EgrDREB2A expression, and the transcription level of it was promoted under light and hampered in the darkness. [Conclusion] EgrDREB2A is a transcriptional factor which was classified into DREB2 group. The expression of it was induced by low temperature and ABA, salt treatments and circadian rhythm also changed its transcription level. Most of cis-elements found in the promoter of EgrDREB2A and genes co-expressed with it were all associated with plant stress response. All these results showed EgrDREB2A possibly played an important role in the process of resistance to aboitic stresses in E. grandis.
Key words: Eucalyptus grandis    EgrDREB2A    gene expression    abiotic stress    circadian rhythm    

低温、干旱、高盐以及高温等非生物逆境因子是影响植物生长和发育的重要限制因子。为应对这些逆境胁迫，植物在长期进化中逐渐形成了复杂的调控系统，使其面对逆境胁迫时能够通过逆境响应基因的表达调节，实现在生理生化和发育等方面的适应性改变，提高其对非生物逆境胁迫的抵抗能力。在逆境响应的生物学过程中，转录因子发挥着重要作用，如ABF(ABRE binding factor)，NAC，MYB等(Nakashima et al., 2009)，它们往往处于逆境信号或者生理代谢响应及调控的核心位置。

DREB(dehydration responsive element binding protein)是其中一类重要的转录因子，它通过与干旱应答元件DRE(dehydration responsive element)/CRT(C-repeat)结合，广泛参与植物对低温、干旱、高盐等非生物胁迫的应答和响应(Agarwal et al., 2006)。DREB基因编码的蛋白都含有一个由50～70个氨基酸组成的AP2/EREBP保守结构域，属于植物中所特有的转录因子AP2/ERF基因家族的成员。根据氨基酸序列差异，DREB家族又分为6个子群A1至A6，而参与逆境胁迫响应的基因主要集中在A1和A2两个子群中(Mizoi et al., 2012; Sakuma et al., 2002)。A1子群中的基因又称为DREB1类基因，该类基因最早在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中发现，参与低温逆境响应的CBF1，CBF2和CBF3都属于该类基因。这些转录因子通过与低温诱导的下游基因(如COR，LT1，RD和KIN等)启动子区域的DRE/CRT元件结合，调控它们的表达，应对逆境胁迫(Jaglo-Ottosen et al., 1998; Novillo et al., 2007; Stockinger et al., 1997; Zhao et al., 2007)。除了参与植物低温逆境响应外，DREB1类基因还参与干旱、高盐等其他非生物逆境因子的响应。如巨桉(Eucalyptus gr and is)中EgrCBF1，EgrCBF2除了受低温强烈诱导外，还参与了高盐和干旱的胁迫响应(王京京等，2012)。拟南芥中组成型超表达DREB1类基因的转基因植株对低温、干旱和高盐的耐受力都得到了有效提高。A2子群中的基因又称为DREB2类基因，依据拟南芥和水稻(Oryza sativa)中发现的DREB2类基因编码蛋白保守性，该类基因分为3个亚型(Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ)(Matsukura et al., 2010)。大多数DREB2类基因与干旱、高盐胁迫逆境有关。在拟南芥中，DREB2A和DREB2B被干旱、高盐和高温诱导，DREB2C也被高温诱导，但诱导时间迟于DREB2A和DREB2B(Sakuma et al., 2002)。另外，DREB2C，DREB2D和DREB2F都能被高盐逆境诱导，DREB2F的表达还受ABA(脱落酸)的促进(Lim et al., 2007)。尽管多种逆境条件都能强烈上调DREB2A的表达，但研究发现，转全长DREB2A的拟南芥转基因植株在植株生长、下游调控基因表达和逆境响应方面与野生型相比并没有明显的变化；而将该基因中表达负调控结构域(NRD)的序列删除后，重新进行转基因组成型超表达，转基因植株表现出生长迟缓，脱水响应基因表达上调，对干旱、高盐逆境条件抵抗能力提高等现象，表明DREB2A存在转录后调控(Sakuma et al., 2006)。目前发现的DREB2A的转录后调控主要有泛肽降解、蛋白磷酸化途径以及选择性剪切3种途径，不同植物中转录后调控模式也不同(Agarwal et al., 2007; Egawa et al., 2006; Matsukura et al., 2010; Qin et al., 2008; Sakuma et al., 2006)。

由此可见，DREB2类基因与逆境因子之间的关系非常复杂，不同植物中DREB2类基因的作用和调控可能有很大不同。目前，DREB2类基因功能及其与逆境响应之间关系的研究主要集中在模式植物中，木本植物中这类研究的报道很少。桉树是一种重要的经济林木，既可以用材，在海岸防护林构建中也发挥了一定的作用，但低温和高盐胁迫是限制其栽培范围和作为海岸防护林树种的一个重要因子。从分子层面上研究其抵抗逆境环境的能力对将来利用分子生物技术手段提高其种植范围具有重要意义。本文以巨桉为材料，对1个EgrDREB2A基因结构特征及其在不同逆境环境下的表达规律进行了分析，为进一步对其功能的研究及利用奠定了基础。

1 材料与方法 1.1 材料

巨桉幼苗取自浙江临安浙江农林大学的苗圃地。幼苗在生长室中培养，培养条件：日照16 h，日温28 ℃，夜温22 ℃，光强150 μmol·m-2s-1，相对湿度70%，种植在3 L塑料盆里。根、茎和叶取材于3月龄的巨桉幼苗，并迅速放入液态氮中冷冻以便用于RNA的提取和植物组织特异性表达的分析。

1.2 DREB2A基因、蛋白序列及启动子元件分析

将序列在http://www.phytozome.net/search.php网站上与巨桉基因组序列数据库进行blast比对，获得基因的全长序列及基因编号。利用蛋白质保守结构域推测工具SMART(http://smart.embl-heidelberg.de)分析EgrDREB2A蛋白的结构，并将该基因氨基酸序列与网站数据库中其他物种基因进行blast分析，搜寻其同源序列。对不同植物的DREB类蛋白序列与巨桉DREB2A蛋白序列进行多序列联配，并用MEGA4.0软件(http://www.megasoftware.net/)构建1 000个自举重复的无根邻接树。

启动子元件分析则根据基因EgrDREB2A在基因组上所在的位置，以起始密码子ATG为起点，截取其上游1.5 kb序列作为EgrDREB2A的启动子序列，利用在线软件MatInspector(http://www.genomatix.de/cgi-bin//matinspector_prof)对序列进行分析。

1.3 冷胁迫

对于不同低温胁迫下的诱导，分别以25 ℃生长条件下的幼苗作为对照(CK)。不同低温处理试验中将巨桉幼苗分不同处理组，每组3个重复，分别于8：00开始置于0，2，4，6，8 ℃的低温培养箱(Microclima1000，Snijders)中黑暗培养。处理2 h后，取3株处理组幼苗叶片，提取RNA备用。在4 ℃低温下不同处理时间试验中，于8：00开始将处理苗放入4 ℃低温培养箱中，随后间隔24，40，44，46，47.5 h再依次放入处理苗分别作为48，24，8，4，2，0.5 h的低温处理组，每组处理3个重复。处理完成后统一提取处理苗的RNA作进一步的基因表达分析。

1.4 共表达分析

将4 ℃不同处理时间中提取的RNA送诺禾致源公司进行数字表达谱(DGE)测序，所获结果用WGCNA软件分析EgrDREB2A基因与其他基因的共表达关系，根据获得的与EgrDREB2A具有共表达特性的相关基因皮尔森相关系数(Parson)进行排序，取包括EgrDREB2A基因在内的20个基因用Cytoscape(Version 2.8.3)软件构建共表达模式图。

1.5 昼夜节律、盐胁迫和ABA处理

昼夜节律试验中，将桉树幼苗放生长箱中培养，培养条件为：白天25 ℃12 h，晚上22 ℃ 12 h，相对湿度80%。以光照开始为起点，分别在0，4，8，12，16，20，24 h时间点收获处理植株叶片。盐处理试验根据Kayal等(2006)的方法进行。从巨桉幼苗完整的完全展开的叶片上剪下直径1.5 cm的叶盘，在200 mmol·L-1 NaCl溶液中处理2，6，12，24 h，以去离子水培养的同一无性系幼苗叶盘作为对照。ABA处理试验，叶盘获得和培养条件与NaCl处理一致，同样参考Kayal等(2006)的方法。ABA浓度为100 μmol·L-1(DMSO作为ABA溶剂，终浓度为10%)，并且将叶盘浸入含有10%DMSO的蒸馏水作为对照，处理时间段为2，6，12，24 h。以上所有处理均在结束后提取叶片RNA，逆转录后用于基因表达的研究。

1.6 RNA的提取、cDNA合成及基因定量表达分析

根据王亚红等(2010)的方法进行材料RNA的提取采样。提取的RNA的浓度和质量通过琼脂糖凝胶电泳检测和分光光度计检测，检测成功的RNA反转录成cDNA通过PrimeScript®RT reagent Kit(TaKaRa，大连，中国)试剂盒合成。

定量表达分析中，反应通过使用荧光染料SYBR-Green(TaKaRa，大连，中国)和BIO-RAD CFX96实时PCR系统(Bio-Rad，USA)进行。Egr18SrRNA的扩增作为该试验的内参。所有生物学样品均做3个重复，并且每个重复均做3次定量分析。根据BIO-RAD CFX96的Bio-Rad CFX Manager(Version 1.5.534)计算基因相对表达量。引物序列见表 1。

表 1 实时荧光定量、半定量所用的引物序列 Tab.1 List of primer sequences used in RT-PCR and qRT-PCR
1.7 EgrDREB2A蛋白表达的亚细胞定位

利用PCR扩增包含已经去掉终止密码子的EgrDREB2A基因完整开放阅读框的序列，并插入到35S-sGFP载体(插有pS1aGFP-8的sGFP片段的pCAMBIA1300载体)上。以反转录获得的巨桉cDNA为模板进行PCR扩增(表 2)。回收扩增的片段，酶切后连入载体，挑取含有EgrDREB2A插入序列的阳性克隆，测序验证正确后，提取质粒做亚细胞定位。通过PDS-1000/He型基因枪法(Xu et al., 1998)转化洋葱(Allium cepa)表皮细胞，转化细胞用激光共聚焦扫描显微镜观察，成像。

表 2 亚细胞定位所用引物 Tab.2 The primers used in subcellular localization
2 结果与分析 2.1 EgrDREB2A基因及蛋白序列分析

通过对巨桉低温(4 ℃)条件下mRNA SSH(suppression subtractive hybridization)文库的构建，从中筛选到一个低温条件下特异表达的EST序列。在http://www.phytozome.net/search.php网站上与巨桉基因组序列数据库进行blast比对，发现该序列对应的巨桉基因序列号为Eucgr.G03094，该基因转录本长度为1 355 bp，开放阅读框长762 bp，编码只含有1个AP2结构域包含253氨基酸残基的蛋白。通过蛋白序列结构分析和同源比对，发现该基因编码蛋白的AP2结构域为69—127位氨基酸，有一个较为典型的核定位序列VERKRSRSRKE；其含有典型的YRG和RAYD 2个保守区，在YRG保守区有V和E 2个与DRE顺式作用元件结合的重要氨基酸位点，是与DRE元件结合的关键位点。AP2结构域的C末端即RAVD区域则含有一个由16个氨基酸组成的双亲性 α 螺旋(Liu et al., 1998; Okamuro et al., 1997)。编码蛋白结构特点表明该基因属于AP2基因家族中DREB类亚家族(图 1)；同时该基因编码蛋白氨基酸序列与其他物种中DREB类蛋白序列的比对及系统进化树的构建表明，该基因编码的蛋白属于DREB类亚家族中的DREB2类子群，因此该基因命名为EgrDREB2A。在系统进化树中，EgrDREB2A与毛白杨(Populus tomentosa)中的PtDREB2A氨基酸序列相似程度最高，达到了52%，与其他序列氨基酸相似程度均在43%以下(图 2)。

图 1 巨桉EgrDREB2A蛋白序列与其他植物同源蛋白序列的比对 Fig. 1 Multiple alignment of DREB2A in E. grandis and its homologus proteins from other plants CsERF1： 甜橙Citrus sinensis(KC215407.1)； StDREB1： 马铃薯Solanum tuberosum(HM641796)； PtDREB2A： 毛白杨Populus tomentosa(HQ665006.1)； AtDREB2A： 拟南芥Arabidopsis thaliana(BA33794)； OsDREB2A： 水稻Oryza sativa(Os01g0165000). 黑色下划线表示AP2结构域，大括号分别表示YRG和RAYD基序，黑色方框内为核定位序列，双亲性α螺旋结构用*号标明。AP2 signature motif is marked with a line, YRG and RAYD motif are marked with two braces.The nuclear localization signal sequence is boxed and the amphiphilic α helix structure is marked with asterisk.
图 2 植物DREB蛋白的系统发育树 Fig. 2 Phylogenetic tree of DREB protein in different plants
2.2 EgrDREB2A启动子顺式作用元件分析

通过对启动子上顺式作用元件(表 3)的分析，结果发现在分析序列中含有1个TATA-box序列、2个脱落酸(ABA)响应元件(ABRE)、1个油菜素内酯响应元件(BRRE)、1个干旱应答元件(DREB)、1个AP2/EREBP转录因子结合元件(EREF)、1个热击响应元件(HSF)和3个昼夜节律相关的顺式作用元件(CCA)；另外，还有4个MYB、2个NAC、3个WRKY转录因子结合的顺式作用元件序列。该启动子序列中含有多个与植物逆境胁迫响应相关的顺式作用元件，暗示EgrDREB2A基因的表达与逆境因子有密切的关系，同时多种不同转录因子结合序列的存在也说明该基因的表达受复杂因素的影响。

表 3 EgrDREB2A启动子的顺式作用元件 Tab.3 List of cis-element in the promoter of EgrDREB2A
2.3 EgrDREB2A蛋白表达的亚细胞定位

目前在其他植物中发现的DREB类基因均为转录因子，它们的编码蛋白主要在细胞核中表达，为此构建了EgrDREB2A∷GFP表达载体，利用基因枪轰击洋葱表皮的方法对EgrDREB2A表达蛋白的亚细胞定位特性进行了研究。结果表明在洋葱细胞中，EgrDREB2A蛋白主要在细胞核中表达，间接证明了其转录因子的特性(图 3)。

图 3 EgrDREB2A的亚细胞定位 Fig. 3 Subcellular localization of EgrDREB2A
2.4 巨桉EgrDREB2A的组织特异性表达分析

半定量RT-PCR分析结果(图 4)表明，正常条件下DREB2A基因在叶、茎、根中都有一定程度的表达，但叶中表达量相对较高。

图 4 巨桉EgrDREB2A基因在根、茎、叶中的表达分析 Fig. 4 Analysis of EgrDREB2A gene expression in root, stem and leaf in E. grandis
2.5 低温条件下EgrDREB2A的表达分析

EgrDREB2A是从低温诱导的mRNA差异表达文库中筛选出来的，因此对不同低温(0，2，4，6，8 ℃)条件下该基因的表达特性进行了分析(图 5)，结果发现与正常温度条件(25 ℃)下生长的植株相比，在不同低温条件下，该基因都被强烈的诱导。同时，在4 ℃条件下不同时间梯度(0.5，2，6，12，24，48 h)处理的试验结果(图 6)也表明，随着处理时间的延长，EgrDREB2A基因的表达受诱导的程度越强烈，在处理48 h时，表达强度达到最高点，为处理最初该基因表达量的113.2倍，表明在巨桉中，EgrDREB2A基因参与了低温逆境胁迫的响应，在低温环境中，其表达受到强烈诱导，并随处理时间的延长这种效应得到强化。

图 5 不同低温下EgrDREB2A的表达 Fig. 5 Relative expression of EgrDREB2A under different low temperatures
图 6 4 ℃不同时间EgrDREB2A的相对表达差异 Fig. 6 Relative expression of EgrDREB2A under time course treatment at 4 ℃
2.6 4 ℃不同处理条件下，基于数字表达谱的EgrDREB2A基因共表达分析

4 ℃条件下，对不同处理时间下的数字表达谱中差异表达(差异表达倍数>2)的基因进行共表达分析，Parson相关系数大于0.20的19个基因中(图 7)，包括3个NAC(Eucgr.I00059，Eucgr.I00100，Eucgr.G02486)、1个MYB(Eucgr.F00031)、1个C2H2锌指结构(Eucgr.B02395)类转录因子基因。NAC类转录因子中，相当一部分成员参与了非生物逆境响应调节(Puranik et al., 2012；Nakashima et al., 2012)，部分MYB转录因子在ABA介导的逆境响应中发挥重要的作用(Chinnusamy et al., 2004)；而最近的研究则表明，巨桉中某些编码具C2H2型锌指结构蛋白的基因表达也被低温和高盐逆境因子所促进(Wang et al., 2014)。水苏糖合成酶基因(Eucgr.H00997)、海藻糖合成酶基因(Eucgr.C00201)、天冬酰胺合成酶基因(Eucgr.D00640)也与EgrDREB2A有密切的共表达关系。这几类基因编码蛋白在细胞内参与催化合成的产物，一方面通过影响植物糖代谢过程调节细胞渗透胁迫，甚至可以进而改变细胞壁的组成成分来应对逆境环境，如海藻糖(Avonce et al., 2004; Paul et al., 2008)、水苏糖(Usadel et al., 2008)；另一方面，则通过改变逆境条件下的氮代谢过程来协调植物的抗逆效应，如天冬酰胺(Herrera-Rodriguez et al., 2007; Wang et al., 2005)。

图 7 4 ℃不同处理时间下的数字表达谱中差异表达基因的共表达分析 Fig. 7 Co-expression analysis of the EgrDREB2A with the data from digital gene expression profiling under time course treatment at 4 ℃ Eucgr.I00059, Eucgr.I00100, Eucgr.G02486： NAC类转录因子基因 NAC-like transcriptional factor genes； Eucgr.B03984： 植物中性转化酶家族类基因 Plant neutral invertase family gene； Eucgr.K02611： NDR1/HIN1类基因 NDR1/HIN1-like； Eucgr.A01061： 生长素响应基因 Auxin-responsive family gene； Eucgr.G03106： 衰老相关基因 Senescene associated gene； Eucgr.F00031： myb类转录因子基因 myb-like transcriptional factor gene; Eucgr.H02454： WD40 重复家族基因 Transducin/WD40 repeat-like superfamily gene; Eucgr.F04257： 组氨酸脱羧酶基因 Histidine decarboxylase gene； Eucgr.C00201： 海藻糖磷酸酶/合酶基因 Trehalose phosphatase/synthase gene; Eucgr.D00640： 天冬酰胺合成酶基因 Asparagine synthetase； Eucgr.J01950： 母体效应显性胚胎发育停滞基因 Maternal effect embryo arrest genes； Eucgr.B02273： 硫胺素C基因 Thiamin C gene； Eucgr.B02395： C2H2型锌指结构转录因子基因 C2H2 type zinc finger gene； Eucgr.H00997： 水苏糖合成酶基因 Stachyose synthase gene； Eucgr.G02098： F-box转录因子类基因 F-box gene； Eucgr.E00330： 淀粉酶基因 Beta-amylase gene； Eucgr.J00449： 多药抗性基因6 Pleiotropic drug resistance gene 6.
2.7 ABA、盐和昼夜节律对EgrDREB2A表达的影响

从图 8可以看出，100 μmol·L-1 ABA处理条件下，处理早期，ABA对EgrDREB2A的表达有一定的促进作用，处理2 h后，基因表达量是对照的1.99倍；但6 h之后，ABA对EgrDREB2A的表达开始发挥抑制效应，24 h时，ABA处理条件下EgrDREB2A的表达水平仅为对照的0.28倍。而在200 mmol·L-1的高盐环境(图 9)中，EgrDREB2A的表达随处理时间的延长表现出先受抑制(6 h前)而后又被促进的现象，处理24 h时，EgrDREB2A的表达量已为对照的2.92倍。这表明巨桉中DREB2A基因功能的发挥不仅与ABA有密切的关系，同时与高盐胁迫的逆境响应途径之间也存在复杂的互作关系。

图 8 ABA处理下EgrDREB2A的相对表达差异 Fig. 8 Relative expression of EgrDREB2A with ABA
图 9 盐胁迫下EgrDREB2A的相对表达差异 Fig. 9 Relative expression of EgrDREB2A under salt stress

很多DREB类基因的表达会受昼夜节律的调控。在常温条件下，对巨桉苗进行了24 h的处理，结果(图 10)发现，光照(0 ～ 12 h)对EgrDREB2A基因表达有促进作用，但随处理时间的延长，呈先上升后下降的趋势，在光照处理8 h时，基因表达的诱导达到最高水平。黑暗(12 ～ 24 h)条件下相对于光照对EgrDREB2A基因有一定的抑制作用。

图 10 在昼夜节律下 EgrDREB2A的相对表达差异 Fig. 10 Relative expression of EgrDREB2A under circadian rhythm
3 讨论

EgrDREB2A蛋白序列结构分析表明，它具有典型的AP2结构域，结构域中包含YRG和RAYD 2个保守区，这些都是典型的DREB类基因的特征(Liu et al., 1998; Mizoi et al., 2012; Okamuro et al., 1997)。根据拟南芥、水稻中对DREB分类的标准，不同物种之间DREB类基因编码蛋白进化树的构建结果表明编码EgrDREB2A的基因属于DREB2类中的亚型I，目前发现的该亚型中的基因都与植物的抗逆性有密切的关系，如AtDREB2A，AtDREB2B，AtDREB2C，AtDREB2E；OsDREB2A，OsDREB2B等。EgrDREB2A氨基酸序列与其他物种中同源基因编码蛋白氨基酸序列的相似性总体上较低，暗示巨桉中该基因在功能上可能与其他物种有较大分化。另外，在EgrDREB2A启动子序列上含有ABRE，DREB，WRKY，HSF，MYB，NAC 等多个逆境响应相关转录因子结合的顺式作用元件，也表明大量与逆境响应相关的转录因子参与了对EgrDREB2A的调控。因此推测该基因很可能像其他同类基因一样参与巨桉的非生物逆境响应。

参与植物抵抗非生物逆境分子途径的DREB2型基因大部分属于亚型I，同时研究表明该类基因主要参与干旱、高盐逆境胁迫的响应，但禾本科(Gramineae)植物中的DREB2类基因对低温胁迫也有响应(Egawa et al., 2006; Matsukura et al., 2010; Shen et al., 2003)。而EgrDREB2A为低温条件下mRNA差减文库中筛选得到的基因，暗示在巨桉中该基因也很可能参与了低温逆境胁迫的响应。正常条件下，地上部分不同组织中，根、茎和叶片中EgrDREB2A也都有表达，叶片中表达量要高于根和茎中表达量，表明该基因作用的发挥可能主要在叶片中进行。在不同低温条件下(0，2，4，6，8 ℃)以及4 ℃条件下不同时间梯度(0.5，2，6，12，24，48 h)处理的试验结果也表明，不同程度的低温都能诱导EgrDREB2A的表达，而且随低温处理时间的延长，基因被诱导的程度不断得到增强。这些都明确说明不仅在禾本科植物中存在低温响应的DREB2类基因，而且巨桉中也存在此类基因。EgrDREB2A的亚细胞定位分析也表明，该基因表达的蛋白定位在细胞核中，这与其蛋白序列预测的其转录因子特性是一致的。低温条件下，其很可能作为重要的上游调控因子调控巨桉抵抗低温胁迫相关基因的表达，提高其低温耐受能力。

同时，低温不同时间的处理条件下，与EgrDREB2A共表达的基因中NAC、MYB以及C2H2锌指结构类转录因子类基因的出现，暗示EgrDREB2A基因的调控与这些基因可能有密切的关系。水苏糖合成酶、海藻糖合成酶和天冬酰胺合成酶基因与EgrDREB2A的共表达关系说明了这些基因与EgrDREB2A在低温条件下协同作用，共同参与了巨桉的低温响应过程，作为代谢相关基因，水苏糖合成酶、海藻糖合成酶和天冬酰胺合成酶基因极有可能在EgrDREB2A基因的下游发挥功能。

DREB2类基因编码的蛋白往往参与多个逆境因子的响应，而且有的还受到脱落酸(ABA)的影响(Dubouzet et al., 2003; Liu et al., 2008)。EgrDREB2A除了受低温的诱导外，研究中发现它还受高盐条件(200 mmol·L-1 NaCl)的影响，试验处理前期，基因受到强烈的抑制作用，但随着处理时间的延长，抑制作用逐渐减弱，在12 h之后，基因反而呈现为诱导效应。而ABA处理则表现为早期诱导、逐渐变为抑制的规律。在DREB1类基因中，人们发现昼夜节律对该类基因的表达也有重要的影响，在白天表达量上升，夜间表达量下降(Bieniawska et al., 2008; Fowler et al., 2005)，而对DREB2类基因表达受昼夜节律影响的研究却很少。本文对正常条件下EgrDREB2A表达受昼夜节律影响的试验结果表明，EgrDREB2A的表达同样受昼夜节律的影响，光照促进其表达，黑暗则抑制其表达，同时无论光照还是黑暗该基因的表达还有自己的节律性，呈现先升后降的规律。这与其启动子上含有响应昼夜节律影响的顺式作用元件CCA也是相呼应的，说明不仅DREB1类基因受到昼夜节律的影响，DREB2类基因表达同样与昼夜变化有密切的关系。该特性与ABA、高盐逆境影响的互作可能是其表达规律具有摆动性变化的一个原因，这从另一方面说明了植物对逆境因子的响应受多种环境因素的影响。

本研究中有关EgrDREB2A的结果表明，在巨桉中该基因具有响应低温胁迫的特性，同时其表达还受ABA和高盐条件的影响，这表明巨桉EgrDREB2A在低温逆境响应方面的功能，与禾本科植物中DREB2类亚型Ⅰ基因可能有一定的相似性。同时其对高盐和ABA的响应规律在其他植物中该类基因的表达特性上还未发现，这些都表明EgrDREB2A响应逆境因子的过程具有一定的复杂性，可能与其他植物中的同类基因在应对逆境功能发挥方面有很大的不同。对其进一步的深入研究，有利于揭示巨桉耐低温、高盐的分子机制，协助桉树抗逆分子辅助育种工作的开展。

参考文献(References)
[1] 王京京, 童再康, 黄程前, 等. 2012. 巨桉EgrCBF 1和EgrCBF2 基因的克隆和胁迫响应表达分析. 林业科学, 48(10): 41-48.
(Wang J J, Tong Z K, Huang C Q, et al. 2012. Cloning of EgrCBF 1 and EgrCBF2 genes from Eucalyptus grandis and their expression under stresses. Scientia Silvae Sinicae, 48(10):41-48[in Chinese]).(1)
[2] 王亚红, 刘 缙, 王玉国. 2010. 高质量提取银杏种仁总 RNA 的改良方法. 中国农学通报, 26(15): 48-52.
(Wang Y H, Liu J, Wang Y G. 2010. An improved method RNA isolation from seeds of Ginkgo biloba L. Chinese Agricultural Science Bulletin, 26(15):48-52[in Chinese]).(1)
[3] Agarwal P K, Agarwal P, Reddy M K, et al. 2006. Role of DREB transcription factors in abiotic and biotic stress tolerance in plants. Plant Cell Rep, 25(12): 1263-1274.(1)
[4] Agarwal P, Agarwal P K, Nair S, et al. 2007. Stress-inducible DREB2A transcription factor from Pennisetum glaucum is a phosphoprotein and its phosphorylation negatively regulates its DNA-binding activity. Mol Genet Genomics, 277(2): 189-198.(1)
[5] Avonce N, Leyman B, Mascorro-Gallardo J O, et al. 2004. The Arabidopsis trehalose-6-P synthase AtTPS1 gene is a regulator of glucose, abscisic acid, and stress signaling. Plant Physiol, 136(3): 3649-3659.(1)
[6] Bieniawska Z, Espinoza C, Schlereth A, et al. 2008. Disruption of the Arabidopsis circadian clock is responsible for extensive variation in the cold-responsive transcriptome. Plant Physiol, 147(1): 263-279.(1)
[7] Chinnusamy V, Schumaker K, Zhu J K. 2004. Molecular genetic perspectives on cross-talk and specificity in abiotic stress signalling in plants. Journal of experimental botany, 55(395): 225-236.(1)
[8] Dubouzet J G, Sakuma Y, Ito Y, et al. 2003. OsDREB genes in rice, Oryza sativa L., encode transcription activators that function in drought-, high-salt- and cold-responsive gene expression. Plant J, 33(4): 751-763.(1)
[9] Egawa C, Kobayashi F, Ishibashi M, et al. 2006. Differential regulation of transcript accumulation and alternative splicing of a DREB2 homolog under abiotic stress conditions in common wheat. Genes Genet Syst, 81(2): 77-91.(2)
[10] Fowler S G, Cook D, Thomashow M F. 2005. Low temperature induction of Arabidopsis CBF1, 2, and 3 is gated by the circadian clock. Plant Physiol, 137(3): 961-968.(1)
[11] Herrera-Rodriguez M B, Perez-Vicente R, Maldonado J M. 2007. Expression of asparagine synthetase genes in sunflower (Helianthus annuus) under various environmental stresses. Plant Physiol Biochem, 45(1): 33-38.(1)
[12] Jaglo-Ottosen K R, Gilmour S J, Zarka D G, et al. 1998. Arabidopsis CBF1 overexpression induces COR genes and enhances freezing tolerance. Science, 280(5360): 104-106.(1)
[13] Kayal E W, Navarro M, Marque G, et al. 2006. Expression profile of CBF-like transcriptional factors genes from Eucalyptus in response to cold. Journal of Expression Botany, 57(10): 2455-2496.(2)
[14] Lim C J, Hwang J E, Chen H, et al. 2007. Over-expression of the Arabidopsis DRE/CRT-binding transcription factor DREB2C enhances thermotolerance. Biochem Biophys Res Commun, 362(2): 431-436.(1)
[15] Liu L, Zhu K, Yang Y, et al. 2008. Molecular cloning, expression profiling and trans-activation property studies of a DREB2-like gene from chrysanthemum (Dendranthema vestitum). J Plant Res, 121(2): 215-226.(1)
[16] Liu Q, Kasuga M, Sakuma Y, et al. 1998. Two transcription factors, DREB1 and DREB2, with an EREBP/AP2 DNA binding domain separate two cellular signal transduction pathways in drought- and low-temperature-responsive gene expression, respectively, in Arabidopsis. Plant Cell, 10(8): 1391-1406.(2)
[17] Matsukura S, Mizoi J, Yoshida T, et al. 2010. Comprehensive analysis of rice DREB 2 -type genes that encode transcription factors involved in the expression of abiotic stress-responsive genes. Mol Genet Genomics, 283(2): 185-196.(3)
[18] Mizoi J, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K. 2012. AP2/ERF family transcription factors in plant abiotic stress responses. Biochim Biophys Acta, 1819(2): 86-96.(2)
[19] Nakashima K, Ito Y, Yamaguchi-Shinozaki K. 2009. Transcriptional regulatory networks in response to abiotic stresses in Arabidopsis and grasses. Plant Physiology, 149(1): 88-95.(1)
[20] Nakashima K, Takasaki H, Mizoi J, et al. 2012. NAC transcription factors in plant abiotic stress responses. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Gene Regulatory Mechanisms, 1819(2): 97-103.(1)
[21] Novillo F, Medina J, Salinas J. 2007. Arabidopsis CBF1 and CBF3 have a different function than CBF2 in cold acclimation and define different gene classes in the CBF regulon. Proc Natl Acad Sci USA, 104(52): 21002-21007.(1)
[22] Okamuro J K, Caster B, Villarroel R, et al. 1997. The AP2 domain of APETALA2 defines a large new family of DNA binding proteins in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci USA, 94(13): 7076-7081.(2)
[23] Paul M J, Primavesi L F, Jhurreea D, et al. 2008. Trehalose metabolism and signaling. Annu Rev Plant Biol, 59: 417-441.(1)
[24] Puranik S, Sahu P P, Srivastava P S, et al. 2012. NAC proteins: regulation and role in stress tolerance. Trends in Plant Science, 17(6): 369-381.(1)
[25] Qin F, Sakuma Y, Tran L S, et al. 2008. Arabidopsis DREB2A-interacting proteins function as RING E3 ligases and negatively regulate plant drought stress-responsive gene expression. Plant Cell, 20(6): 1693-1707.(1)
[26] Sakuma Y, Liu Q, Dubouzet J G, et al. 2002. DNA-binding specificity of the ERF/AP2 domain of Arabidopsis DREBs, transcription factors involved in dehydration- and cold-inducible gene expression. Biochem Biophys Res Commun, 290(3): 998-1009.(2)
[27] Sakuma Y, Maruyama K, Osakabe Y, et al. 2006. Functional analysis of an Arabidopsis transcription factor, DREB2A, involved in drought-responsive gene expression. Plant Cell, 18(5): 1292-1309.(2)
[28] Shen Y G, Zhang W K, He S J, et al. 2003. An EREBP/AP2-type protein in Triticum aestivum was a DRE-binding transcription factor induced by cold, dehydration and ABA stress. Theor Appl Genet, 106(5): 923-930.(1)
[29] Stockinger E J, Gilmour S J, Thomashow M F. 1997. Arabidopsis thaliana CBF1 encodes an AP2 domain-containing transcriptional activator that binds to the C-repeat/DRE, a cis-acting DNA regulatory element that stimulates transcription in response to low temperature and water deficit. Proc Natl Acad Sci USA, 94(3): 1035-1040.(1)
[30] Usadel B, Blasing O E, Gibon Y, et al. 2008. Multilevel genomic analysis of the response of transcripts, enzyme activities and metabolites in Arabidopsis rosettes to a progressive decrease of temperature in the non-freezing range. Plant Cell Environ, 31(4): 518-547.(1)
[31] Wang S, Wei X L, Cheng L J, et al. 2014. Identification of a C2H2-type zinc finger gene family from Eucalyptus grandis and its response to various abiotic stresses. Biologia Plantarum, 58(2): 385-390.(1)
[32] Wang H, Liu D, Sun J, et al. 2005. Asparagine synthetase gene TaASN 1 from wheat is up-regulated by salt stress, osmotic stress and ABA. J Plant Physiol, 162(1): 81-89.(1)
[33] Xu S P, Wei Z M. 1998. Introduction to method of microprojectile bombardment and its application. Plant Physiology Communications, 34(1):41-43.(1)
[34] Zhao J, Ren W, Zhi D, et al. 2007. Arabidopsis DREB1A/CBF3 bestowed transgenic tall fescue increased tolerance to drought stress. Plant Cell Rep, 26(9): 1521-1528.(1)