光合作用是植物生长发育的基础。果树干物质的90%~95%来源于光合作用，光合效率的高低可以反映出果树的生长发育水平(李天忠等，2008)。叶片是果树进行光合作用的主要器官，其生长发育和性状特征直接影响着果树的基本行为和功能。常绿植物在储存养分、适应贫瘠生境上有很大优势，主要原因是其叶片寿命可有效减少营养损失(Aerts，1995)。但常绿植物叶片由于其形成的年份、经历的环境条件及所处的发育阶段存在差异，使其资源分配模式和性状特征随叶龄变化而产生差别(Reich et al., 1991)。随着叶龄的增加，叶片的光饱和点(LSP)、光补偿点(LCP)、表观量子效率(AQY)均呈下降趋势(李勇等，2013)。凌丽俐等(2013)研究表明，纽荷尔脐橙(Citrus sinensis)2龄秋梢叶的叶绿素含量、光合相对电子传递速率均低于1龄春梢叶。叶片随叶龄变化的物质投资和分配格局是植物适应环境的重要途径之一(Silvertown et al., 1997)。叶片生长早期，为最大程度地获取光资源，需投资较多的生物量以优化同化器官，如扩展平均叶面积(mean leaf area，MLA)(Tilman，1988；Sulan，2000)；相反，与早期生长的叶片相比，后期生长的叶片要经历更多复杂多变的环境胁迫，需要在抗机械胁迫和结构建造方面投资更多的生物量，从而维持叶片的停留和存活时间(Wilson et al., 1999；Gratani et al., 2000；Westoby et al., 2002)。植物叶片的氮含量与光合能力有很强的正相关性(Evans，1989；1996；Reich et al., 1994；张亚杰等，2004)，老叶光合速率低是由于其叶氮含量、Rubisco/Chl比值低造成的(Warren et al., 2001)。因此，不同叶龄资源分配模式(尤其是氮素)对常绿植物的生长发育具有重要意义。

香榧(Torreya gr and is)是我国特有的珍稀干果，是集材用、药用、果用、油用和观赏于一体的经济树种。香榧是榧树的一个优良自然变异类型，常绿植物，叶片可以在枝干上存活较长时间，甚至几年。近年来有关研究主要集中在药用价值上(王向阳等，2005；Chen et al., 2006；徐超等，2012)，香榧叶片光合特性的研究相对较少。Shen等(2014)对香榧幼苗光合作用与水分亏缺之间的关系进行了研究，但对不同叶龄叶片光合特性的差异及其与氮含量及分配关系的研究鲜见报道。明确香榧不同叶龄叶片光合特性差异及其形成机制，探寻通过调节物质投资和分配格局，对改善叶片光合性能、增加香榧果实产量具有重要意义。为此，本研究通过对不同叶龄香榧叶片的光响应和CO₂响应曲线、叶绿素含量、叶氮含量及光合氮利用率等生化指标的测定，从表观光合特性和光合内部机构系统地揭示香榧叶片光合特性的生理机制，为进一步提高其丰产栽培技术提供理论依据。

试验于2013年10月在浙江省临安市浙江农林大学香榧山基地进行。试验区位于浙江省西北部，东临杭州余杭区，地理位置118°51′—119°52′ E，29°56′—30°23′ N，属于亚热带季风气候区，温暖湿润，光照充足，雨量充沛。供试材料为20年生香榧，对样地进行每木测量，计算出平均胸径和平均树高。选择胸径和树高与标准样地的平均胸径和平均树高比较接近、树冠良好的香榧植株为本研究的标准木。分别从树冠外围向东南伸展的顶枝(A)、侧枝(S)上选择当年生(C)叶片(萌芽后5个月)、1年生(C+1)叶片(萌芽后17个月)和2年生(C+2)叶片(萌芽后29个月)为代表性样枝。

2013年10月选择晴朗天气，采用Li-6400便携式光合仪(美国Li-cor公司)测定不同叶位、不同叶龄香榧叶片的光响应曲线。测定时CO₂浓度为400 μmol·mol^-1(由CO₂小钢瓶控制CO₂浓度)，叶室温度23~27 ℃，相对湿度约50%。采用自制人工光源，设定气体流速为500 μmol·s^-1，光合有效辐射强度(PAR)梯度为1 904，1 573，1 262，959，763，575，433，198，130，0 μmol·m^-2s^-1。测定前用763 μmol·m^-2s^-1光强对叶片进行光诱导，使叶片活化。每个光强下稳定4 min记录数据，重复3~4次，取平均值作为测定结果。根据光合助手计算出光响应曲线饱和光强(LSP)、最大净光合速率(P_max)、光补偿点(LCP)和暗呼吸速率(R_d)。所有的气体交换测定均在9：00—11：00完成。

选择光响应测定的叶片，控制光强为饱和光强以上(光强为763 μmol·m^-2s^-1)，并在400 μmol·mol^-1 CO₂浓度下光诱导30 min，CO₂浓度设置为：400，300，200，100和50 μmol ·mol^-1，400，800，1 200，1 600和2 000 μmol ·mol^-1CO₂ 浓度下测定P_n(净光合速率)。V_cmax(最大RuBP羧化速率)和J_max(RuBP再生的光合电子传递速率)根据CO₂响应曲线求得(Long et al., 2003)。所有的气体交换测定均在9：00—11：00完成。

称取0.02 g鲜质量的不同叶龄叶片浸入盛有8 mL提取液(95%乙醇)的离心管中，密封避光低温浸提至叶片无色(高俊凤，2006)。用紫外分光光度计(UV2500，岛津)检测波长在665，649，470 nm处的吸光度值。记录所测叶片的鲜质量和面积，计算以叶片面积为基础的叶绿素含量。

气体交换测定完成后，将所测叶片收集，用扫描法测定叶面积(张小全等，2000)，即将测定枝上的披针叶全部剪下，用透明胶带粘贴于复印纸上，并通过扫描仪(Epson扫描仪Perfection V370 Photo)求算出按针叶面积。然后将披针叶在85 ℃烘干至恒重，称量干质量。比叶质量(specific leaf weight，SLW，g·m^-2)=干质量/叶面积。

用凯氏定氮法测定单位干质量上的叶氮含量(N_M)。以饱和最大光合速率(P_max)与N_M的比值表示光合氮利用效率(photosynthetic nitrogen utilization efficiency，PNUE)(Qing et al., 2012)。PNUE=P_n/N_M。

植物叶氮在光合机构中的分配主要可分为3部分，即分配到RuBP羧化作用的氮素(N_C，g·g^-1)、分配到RuBP再生作用的氮素(N_B，g·g^-1)和分配到捕光组分的氮素(N_L，g·g^-1)。计算公式(Niinemets et al., 1997)如下：

$\begin{align} & {{N}_{\text{C}}}={{V}_{\text{cmax}}}/(6.25\times {{V}_{\text{cr}}}\times {{N}_{\text{M}}}\times \text{SLW}); \\ & {{N}_{\text{B}}}={{J}_{\text{max}}}/(8.06\times {{J}_{\text{mc}}}\times {{N}_{\text{M}}}\times \text{SLW}); \\ & {{N}_{\text{L}}}={{C}_{\text{C}}}/({{N}_{\text{M}}}\times {{C}_{\text{B}}}); \\ & {{N}_{\text{T}}}={{N}_{\text{C}}}+{{N}_{\text{B}}}+{{N}_{\text{L}}}. \\ \end{align}$

采用SPSS软件进行统计分析，用光合助手(Photosynthesis)拟合曲线，采用Sigmaplot10.0作图。

无论是顶枝(A)或侧枝(S)，当年生(C)、1年生(C+1)和2年生(C+2)叶片对PAR的响应曲线基本一致(图 1)。当PAR在0～433 μmol·m^-2s^-1时，P_n随PAR的增强迅速增加，此时PAR是香榧叶片光合作用的主要限制因子；当PAR＞433 μmol·m^-2s^-1时，P_n随PAR的增大其上升速度开始减慢，并逐渐趋于平缓，达到光饱和状态。

图 1 不同叶龄香榧叶片的光响应曲线 Fig. 1 Photosynthetic response curves of net photosynthetic rate (Pn) in leaves of different leaf age of T.grandis A-C：顶枝当年生叶片；A-C+1：顶枝1年生叶片；A-C+2：顶枝2年生叶片；S-C：侧枝当年生叶片；S-C+1：侧枝1年生叶片；S-C+2：侧枝2年生叶片。A-C: Current leaf of the apical branch; A-C+1: Current leaf +1 of the apical branch; A-C+2: Current leaf +2 of the apical branch; S-C: Current leaf of the side branch; S-C+1: Current leaf +1 of the side branch; S-C+2: Current leaf +2 of the side branch.

对光合-光响应曲线采用非直角双曲线方程进行拟合，结果见表 1。同一叶位、不同叶龄之间，随着叶龄的增加，P_max，LSP均呈逐渐下降趋势，其中2年生(C+2)叶片显著低于当年生(C)叶片。同一叶龄、不同叶位之间，除侧枝1年生(C+1)叶片的LSP显著高于顶枝1年生(C+1)叶片外，其余叶龄的顶枝(A)与侧枝(S)叶片之间的LSP无显著差异。

表 1 不同叶龄香榧叶片光合-光响应曲线特征参数^① Tab.1 Simulation parameters of light response curves of net photosynthetic rate in leaves of different leaf age of T. grandis

表 1 不同叶龄香榧叶片光合-光响应曲线特征参数① Tab.1 Simulation parameters of light response curves of net photosynthetic rate in leaves of different leaf age of T. grandis μmol·m-2 s-1 叶龄Leaf age 叶位Leaf site Pmax Rd LCP LSP ①不同字母表示在0.05水平上差异显著。小写字母表示同一叶位、不同叶龄之间,大写字母表示同一叶龄不同叶位之间。Different letters denote significant differences under different position at the same leaf age (uppercase letters), and at different leaf age at the same position (lowercase letters).下同。The same below. C 顶枝Apical branch(A) 6.82±0.72aA 0.79±0.14aA 21.87±1.73aA 513.97±36.74aA 侧枝Side branch(S) 6.75±0.77aA 0.75±0.07aA 17.35±1.69aB 452.39±25.86aB C+1 顶枝Apical branch(A) 5.26±0.44bA 0.81±0.16aA 24.13±2.18aA 415.68±41.50bA 侧枝Side branch(S) 5.60±0.48bA 0.71±0.2aA 20.78±4.71aA 438.68±52.18aA C+2 顶枝Apical branch(A) 3.87±0.68cA 0.59±0.09aA 23.65±3.47aA 375.15±56.34bA 侧枝Side branch(S) 4.02±0.27cA 0.71±0.13aA 23.05±2.78aA 345.97±38.04bA

同一叶位、不同叶龄之间，随着叶龄的增加，叶片的Chla，Chlb及Chl(a+b)含量均呈下降趋势，其中顶枝(A)2年生(C+2)和1年生(C+1)叶片的Chl(a+b)含量分别比当年生(C)叶片下降了23.6%和12.1%；侧枝(S)2年生(C+2)和1年生(C+1)叶片的Chl(a+b)含量分别比当年生(C)叶片下降了18.7%和10.7%。同一叶龄、不同叶位之间，除侧枝(S)2年生(C+2)叶片显著高于顶枝(A)2年生(C+2)叶片外，其他叶龄的顶枝(A)与侧枝(S)叶片之间的Chla，Chlb及Chl(a+b)含量无显著差异(图 2)。

	图 2 不同叶龄香榧叶片的叶绿素含量 Fig. 2 The chlorophyll contents in leaves of different leaf age of T. grandis ●: Chla;○: Chlb. 不同字母表示在0.05水平上差异显著。 Different letters denote significant differences at 0.05 level.

同一叶位、不同叶龄之间，随着叶龄的增加，叶片的V_cmax呈下降趋势，其中顶枝(A)中，1年生(C+1)和2年生(C+2)叶片分别比当年生(C)叶片下降了13.86%和37.62%；侧枝(S)中，1年生(C+1)和2年生(C+2)叶片分别比当年生(C)叶片下降9.2%和27.56%。同一叶位、不同叶龄之间，随着叶龄的增加，叶片的J_max呈下降趋势，其中顶枝(A)中，1年生(C+1)和2年生(C+2)叶片分别比当年生(C)叶片下降13.06%和39.45%；侧枝(S)中，1年生(C+1)和2年生(C+2)叶片分别比当年生(C)叶片下降了9.7%和27.42%。同一叶龄、不同叶位之间，顶枝(A)与侧枝(S)叶片之间的V_cmax，J_max无显著差异(表 2)。

表 2 不同叶龄香榧叶片CO₂响应曲线模拟的光合参数 Tab.2 The modeled photosynthetic parameters based on analysis in response of photosynthetic rate to intercellular CO₂ concentration in leaves of different leaf age of T.grandis

表 2 不同叶龄香榧叶片CO2响应曲线模拟的光合参数 Tab.2 The modeled photosynthetic parameters based on analysis in response of photosynthetic rate to intercellular CO2 concentration in leaves of different leaf age of T.grandis μmol·m-2s-1 叶龄Leaf age 叶位Leaf site Vcmax Jmax C A 44.5±1.02aA 102±1.98aA S 44.2±1.41aA 103±9.08aA C+1 A 38.4±3.76bA 88.3±4.28aA S 40.2±2.85bA 93.1±5.44aA C+2 A 27.8±1.73cA 61.5±7.85bA S 32.0±2.54cA 74.8±10.07bA

同一叶位、不同叶龄之间，随着叶龄的增加，香榧叶片N_M呈逐渐下降趋势。同一叶龄、不同叶位之间，顶枝(A)与侧枝(S)叶片之间的N_M无显著差异。同一叶位、不同叶龄之间，随着叶龄的增加，P_C和N_B均呈下降趋势。在顶枝(A)中，N_L在不同叶龄之间无显著差异，但是侧枝(S)中，1年生(C+1)和2年生(C+2)的N_L显著低于当年生(C)叶片。同一叶龄、不同叶位之间，顶枝(A)与侧枝(S)叶片之间的N_C，N_B，N_L无显著差异(表 3)。

表 3 不同叶龄香榧叶片的氮素分配情况 Tab.3 Nitrogen allocation in leaves of different leaf age of T. grandis

表 3 不同叶龄香榧叶片的氮素分配情况 Tab.3 Nitrogen allocation in leaves of different leaf age of T. grandis 参数Parameters C C+1 C+2 A S A S A S NM/(mg·g-1) 21.6±0.84aA 22.7±1.91aA 18.4±1.33bA 18.5±1.73bA 14.2±1.22cA 14.6±1.52cA NC/(g·g-1) 0.068±0.01aA 0.070±0.01aA 0.047±0.002bA 0.050±0.001bA 0.039±0.004bA 0.046±0.01bA NB/(g·g-1) 0.020±0.002aA 0.021±0.003aA 0.015±0.000 4bA 0.016±0.001bA 0.011±0.002cA 0.015±0.002bA NL/(g·g-1) 0.044±0.01aA 0.05±0.002aA 0.036±0.004aA 0.039±0.001bA 0.037±0.004aA 0.037±0.000 4bA NT/(g·g-1) 0.13±0.02aA 0.14±0.02aA 0.10±0.001bA 0.10±0.003bB 0.09±0.01bA 0.10±0.01bA

香榧叶片P_max与N_C，N_B，N_L，N_T均呈极显著相关(表 4)，表明随着叶龄的增加，香榧叶片的光合速率下降与其氮素含量及其分配到光合机构的氮素少有关。

表 4 N_M,N_C,N_B,N_L与P_max之间的回归分析 Tab.4 Regression and correlation coefficients between N_M,N_C,N_B,N_L,N_T and P_max

表 4 NM,NC,NB,NL与Pmax之间的回归分析 Tab.4 Regression and correlation coefficients between NM,NC,NB,NL,NT and Pmax 参数Parameters 斜率Slope 截距Intercept 相关系数Correlation coefficient(R) P NM-Pmax 0.003 -0.033 0.95 0.001 0 NC-Pmax 0.920 -0.021 0.97 0.000 4 NB-Pmax 3.070 -0.022 0.90 0.003 6 NL-Pmax 2.000 -0.053 0.85 0.009 2 NT-Pmax 0.530 -0.031 0.97 0.000 4

同一叶位、不同叶龄之间，随着叶龄的增加，叶片SLW呈增大趋势，其中当年生(C)叶片的SLW显著低于1年生(C+1)和2年生(C+2)叶片，而1年生(C+1)与2年生(C+2)之间无显著差异。同一叶龄、不同叶位之间，顶枝(A)与侧枝(S)叶片之间的SLW无显著差异(图 3)。

	图 3 不同叶龄香榧叶SLW的变化 Fig. 3 SLW changes of different leaf age of T. grandis 不同字母表示同一叶位、不同叶龄之间在0.05水平上差异显著, ns表示同一叶龄、不同叶位之间无显著性差异。Different letters denote significant differences under different leaf age at the same position at 0.05 level, ns denote no significant differences under different position at the same leaf age.下同。The same below.

同一叶位、不同叶龄之间，随着叶龄的增加，叶片的PNUE呈下降趋势，其中当年生(C)叶片的PNUE显著高于1年生(C+1)和2年生(C+2)叶片，1年生(C+1)与2年生(C+2)叶片之间的PNUE无显著差异；顶枝(A)和侧枝(S)之间的PNUE同样无显著差异(图 4A)。香榧叶片的PNUE与其SLW呈显著负相关关系(图 4B)。

	图 4 不同叶龄香榧叶片PNUE及其与SLW之间的相关性 Fig. 4 PNUE and its relationship to SLW in leaves of different leaf age of T.grandis

衡量叶片光合能力的重要指标是最大净光合速率(张小全等，2001；霍宏等，2007)。研究表明，18年生杉木(Cunninghamia lanceolata)中龄林不同季节和部位针叶的P_max均表现为当年生大于1年生、1年生大于2年生的趋势(张小全等，2001)。王兵等(2006)研究表明，随着叶龄的增加，丝栗栲(Castanopsis fargesii)叶片和苦槠栲(C.sclerophylla)叶片的净光合速率显著下降。本研究也发现，随着叶龄的增加，香榧叶片的P_max呈下降趋势(表 1)，这表明当年生叶片的光合能力较强，并且在傍晚和早晨等弱光条件仍能有效地进行光合作用，这对香榧产量形成具有重要的意义。植物叶片的LCP和LSP反映了植物对光照条件的要求，是判断植物耐阴性的重要指标。大体上阴性植物的LCP小于20 μmol·m^-2s^-1，LSP为500~1 000 μmol·m^-2s^-1或更低，而阳性植物的LCP为50~100 μmol·m^-2s^-1，LSP为1 500~2 000 μmol·m^-2s^-1或更高(蒋高明，2004)。本研究结果表明，香榧叶片的LCP为17.35~24.13 μmol·m^-2s^-1，LSP为345.97~513.97 μmol·m^-2s^-1，表现出阴生植物的光合特性，且当年生叶片的LSP值较高，表明当年生叶片对强光的适应能力强。

叶片光合能力的大小，通常与叶绿素含量、酶活性有关。随着叶龄的增加，纽荷尔脐橙叶片的叶绿素含量呈降低趋势(凌丽俐等，2013)。本研究中，1年生和2年生叶片的叶绿素含量显著低于当年生叶片，且顶枝叶片随叶龄增加的下降幅度大(图 2)，这可能是顶枝叶片光合速率下降快的原因之一。研究表明，V_cmax与Rubisco含量具有显著相关性(Björkman，1968；1981；von Caemmerer et al., 1981)。与当年生叶片相比，1年生叶片的V_cmax下降了42%~44%(Whitehead et al., 2011)。本研究结果显示，与当年生叶片相比，1年生和2年生叶片的V_cmax，J_max有明显的下降趋势，表明随着叶龄的增加，香榧叶片中的Rubisco含量逐渐降低、RuBP的再生速率受到抑制(表 2)，这可能也是P_max随叶龄增加降低的主要原因之一。而且，随着叶龄的增加，顶枝叶片的V_cmax，J_max的下降幅度大于侧枝叶片，这可能是由于侧枝是结果枝，随着叶龄的增加，顶枝会先将氮素等营养元素优先供给侧枝叶片，导致顶枝叶片较侧枝叶片衰老速率较快的缘故。

植物叶片的氮含量与光合能力有很强的正相关性，因为通常叶氮含量中约有一半分配到光合机构中，如卡尔文循环和类囊体相关的酶(Evans，1989； 1996；Reich et al., 1994；张亚杰等，2004)。叶片单位干质量的氮含量与叶片寿命呈显著的正相关关系(Reich et al., 1999)。Yamashita等(2002)研究发现，叶片成熟后光合速率和叶氮含量逐渐降低。本研究中，随着叶龄的增加，香榧叶片的N_M呈下降趋势，且叶片的N_C，N_B，N_T均呈下降趋势，这表明分配到光合机构的氮素减少。另外，香榧叶片光合速率与氮素及其各组分均呈显著正相关(表 4)，表明随着叶龄的增加，香榧叶片的光合速率下降主要由于其体内的N元素含量降低，从而降低PNUE(图 4A)。侧枝的N_M要略高于顶枝，这可能是顶枝叶片较侧枝叶片衰老速率相对较快的原因。

理论上讲，高SLW植物叶片的细胞壁组分和碳含量较高，而其水分含量、叶片氮含量较低，因此大部分研究认为叶片光合与氮含量均与SLW相关(Meziane et al., 2001； Takashhna et al., 2004)。本研究结果显示，随着叶龄的增加，香榧叶片的SLW呈增加趋势(图 3)，这可能是由于1年生和2年生叶片中大量氮素会流向其细胞壁上(Takashhna et al., 2004)，使细胞获得更多的机械保护以抵御外界环境的变化，从而导致分配到Rubisco、捕光色素蛋白的氮元素减少(Onoda et al., 2004)，这从香榧叶片的PNUE与其SLW呈显著负相关关系的分析(图 4B)中得到了进一步证实，与前人的研究结论(Hikosaka，2004；Onoda et al., 2004；Takashhna et al., 2004)一致。因此，随着叶龄的增加，香榧叶片分配到细胞壁的氮素增加，而分配到光合机构的氮素减少，可能是导致香榧不同叶龄叶片的P_n，PNUE产生差异的主要原因。