杨树是一个种类繁多、分布广泛的重要经济树种和工业用材树种。由于其人工林林分结构单一，极易受到虫害的影响。面对虫害带来的巨大损失以及难以用常规方法培育杨树抗虫新品种，利用基因工程培育抗虫新品种成为现在研究的热点。目前已有许多研究将抗虫基因导入杨树中，经抗虫性试验，筛选出抗虫植株。Tian等(2000)将部分改造后的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)杀虫蛋白基因和慈菇蛋白酶抑制剂(API)基因构建于一个植物表达载体转化741杨[Populus alba×(P.davidiana +P.simonii)×P.tomentosa]，对筛选的再生植株进行分子生物学检测及抗虫试验，最后获得对杨扇舟蛾(Clostera anachoreta)具有高抗虫性的转基因741杨，这是国内外首次报道的转双抗虫基因的抗虫741杨。姜静等(2004)将蜘蛛杀虫肽与Bt基因C肽序列的融合基因导入小黑杨(P.×xiaohei)，经Southern及抗虫试验检测，筛选出具有显著抗虫效果的抗性株系。张冰玉等(2005)将BtCry3A基因与水稻(Oryza sativa)巯基蛋白酶抑制剂基因转化到银腺杂种杨(Populus alba×P.glandulosa)中，获得的转基因植株经室内抗虫试验测定初步表明，有2个转基因株系对光肩星天牛(Anoplophora glabripennis)幼虫具有毒杀作用，4个株系对光肩星天牛幼虫有不同程度的抑制作用，但其余的转基因株系对幼虫的毒杀作用不明显。范海娟等(2006)利用转蜘蛛杀虫肽与Bt毒蛋白C肽融合蛋白基因小黑杨对杨扇舟蛾进行抗性试验，结果表明转基因小黑杨能够明显延长杨扇舟蛾幼虫的发育历期，降低化蛹率及蛹质量。甄志先等(2007)对转抗虫基因(BtCry3A)741杨对鞘翅目(Coleoptera)昆虫的抗虫性进行了研究，结果表明转基因株系对桑天牛(Apriona germari)幼虫的致死率很低，但对幼虫的发育具有明显的抑制作用。康薇(2013)通过室外人工接虫，研究表达Cry1A杀虫蛋白的中嘉8号杨树(Populus deltoides ‘I-63×I-69’)对杨扇舟蛾的田间抗性和对非靶标生物的影响，结果表明转基因杨树对杨扇舟蛾幼虫具有明显的抗性，而对非靶标生物无明显的毒害作用。多种研究表明转抗虫基因杨树对鳞翅目(Lepidoptera)或鞘翅目害虫的抗虫性得到一定提高。

本研究将BtCry1Ac基因与慈菇蛋白酶抑制剂基因(API)构建的双抗虫基因表达载体，通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法转化欧美杨优良品种107杨(Populus × euramericana cv.‘74/76’)，获得一批转基因株系，对其进行PCR鉴定，并在DNA水平、转录水平和翻译水平上进行分子检测，确定外源基因是否已整合至植物基因组中，并对转基因株系进行饲虫试验，筛选出高抗株系。

参试植物材料为转双抗虫基因的欧美杨107杨无性系PB系列，是将部分改造的Bt基因Cry1Ac基因与慈姑蛋白酶抑制剂API基因构建成双抗虫基因表达载体，通过农杆菌介导法转化107杨叶片，共获得10个转基因株系，未转基因107杨为对照，均为2年生大田苗。

测试昆虫为鳞翅目的美国白蛾(Hlyphantria cunea)幼虫和杨扇舟蛾幼虫。

美国白蛾又名美国灯蛾、秋幕毛虫、秋幕蛾，属鳞翅目，灯蛾科(Arctiidae)。它食性杂，繁殖量大，适应性强，传播途径广，是危害严重的世界性检疫害虫。共7个龄期，进入4龄以后取食量增大。

杨扇舟蛾属鳞翅目，舟蛾科(Notodontidae)，别名杨树天社蛾。共5个龄期，3龄前集中缀叶成苞，在内咀食叶肉，3龄后分散取食全叶，发生严重时可将叶片吃光。

2013年5月，采取大田中各转基因株系和对照的叶片，采用CTAB法提取叶片的DNA。并选用Cry1Ac和API基因的特异性引物进行PCR检测。以含目的基因的质粒为阳性对照，未转基因107杨为阴性对照。

Cry1Ac基因的引物为F1/R1，片段大小为546 bp。F1： 5′-ATGGATAACAATCCGAACATCA-3′； R1： 5′-C CACCTTTGTCCAAACACTGAA-3′。

API基因的引物为F2/R2，片段大小为500 bp。F2： 5′-GCTGAATTCGACCATGGCGGCCTCCAACG CT-3′； R2： 5′-CGATGCCCAGCAAGGTTTTT-3′。

2013年8月，采集各转基因株系和对照大田苗叶片(3次重复，每次称量0.1 g叶片组织)，采用康为世纪超纯RNA提取试剂盒提取总RNA，采用北京艾德莱公司的TUREscript 1st Str and cDNA Synthesis Kit 进行cDNA第1链的反转录(步骤参照说明书)。根据Cry1Ac基因的全序列信息设计绝对荧光定量PCR引物(F3： 5′-GAATTTTTGGTCCCTCTCAAT-3′； R3： 5′-AGGATCTGCTTCCCACTCTCT-3′)，退火温度为55 ℃，采用2 × Sybr Green qPCR Mix进行绝对荧光定量PCR(体系参照说明书)。

2013年8月，采集10个转基因株系和对照大田苗自上而下的第3片叶片(每个株系3次重复)，选用Agdia公司的Bt-Cry1Ac ELISA试剂盒进行Bt毒蛋白检测(方法参照说明书)。

参试昆虫为鳞翅目的美国白蛾幼虫和杨扇舟蛾幼虫。为防止有寄生蜂致死现象，参试昆虫均为在室外采集(美国白蛾成虫于2013年6月底在河北农业大学苗圃捕捉，杨扇舟蛾于2013年5月底在保定市南二环路边采集到5龄幼虫)。收集的2种幼虫均在室内饲养，经化蛹、羽化、交配、产卵等阶段后，用卵孵化出的下一代幼虫用于饲虫试验。由于试验内容为不同龄期的抗虫性比较，未用于转基因株系饲喂的幼虫，继续用非转基因的107杨叶片饲养至不同龄期。

采集有毒蛋白表达的8个转基因株系及对照叶片，分别用1～6龄美国白蛾幼虫进行饲虫试验。试验设置3个重复，1～3龄每个重复为30头，4龄以后每个重复15头左右。1龄幼虫为从卵孵化出且未饲喂过叶片的幼虫，3～6龄幼虫为上一龄刚刚脱皮完成的幼虫。每天根据取食情况更换叶片，观察并记录死亡情况。选取相同部位的8个转基因株系及对照叶片，分别用1～4龄杨扇舟蛾幼虫进行饲虫试验。1～2龄幼虫每次重复设置30头，设3个重复； 3～4龄幼虫每次设置5头幼虫，设4个重复。每天根据取食情况更换叶片，观察各试验中幼虫的发育情况，记录幼虫的死亡情况。

试验结束后，计算幼虫的逐日死亡率、累积死亡率、平均死亡率等。逐日死亡率=每天死亡个数/初期饲养总数×100%； 累积死亡率=饲养末期的死亡总数/初期饲养总数×100%； 平均死亡率=各个重复的累积死亡率之和/重复次数×100%。

整理分子生物学检测及抗虫性试验数据，用Excel和DPS进行统计检验及图表分析。

对Cry1Ac基因进行PCR检测，琼脂糖电泳分析见图 1，10个转基因株系与阳性质粒pBtiA均扩增出大小为546 bp的条带，未转基因107杨未检测到。

	图 1 转基因株系的Cry1Ac基因检测 Fig. 1 PCR detection of Cry1Ac of transgenic plants

对API基因进行PCR检测，电泳分析如图 2，10个转基因株系与阳性对照均扩增出大小约500 bp的条带，而未转基因107杨未检测到。

	图 2 转基因株系的API基因检测 Fig. 2 PCR detection of API of transgenic plants M: (自上而下From up to down)2 000，1 000，750，500，250，100 bp.

Cry1Ac基因的绝对荧光定量PCR分析结果见表 1，不同转基因株系Cry1Ac的转录丰度存在差异。PB1，PB2，PB6，PB9和PB10的转录丰度较高，为1.72×10⁸～7.91×10⁹，PB3，PB7和PB8次之，PB4和PB5没有检测到转录表达。

表 1 荧光定量PCR检测Cry1Ac基因的转录丰度^① Tab.1 Transcription abundance of Cry1Ac detected by FQ-PCR

表 1 荧光定量PCR检测Cry1Ac基因的转录丰度① Tab.1 Transcription abundance of Cry1Ac detected by FQ-PCR 株系Lines 转录丰度Transcription abundance ①在同一列相同的字母表示在0.05水平没有显著差异(费舍尔的LSD多重比较)。下同。Within each column，means with the same letter are not significantly different(P=0.05)(ANOVA FISHER’s LSD test). The same below. PB1 7.91×109±6.09×108 a PB2 1.72×108±1.08×107 c PB3 2.35×107±3.42×106 c PB4 0 d PB5 0 d PB6 2.04×108±3.86×107 c PB7 1.03×107±1.20×106 c PB8 2.31×107±2.36×106 c PB9 8.12×108±8.15×107 b PB10 7.92×108±3.73×107 b CK 0 d

Cry1Ac毒蛋白检测结果见表 2，8月份，PB1，PB2，PB6，PB9和PB10 5个株系的毒蛋白含量显著高于其他株系，为110.56～665.11 ng·g^-1，其中PB1最高； PB3，PB7和PB8 3个株系的毒蛋白含量较低，为16.38～53.85 ng·g^-1； PB4，PB5和CK均未检测到毒蛋白。

表 2 8月份各转基因株系的Cry1Ac毒蛋白含量 Tab.2 Cry1Ac toxic protein content of various transgenic lines in August

表 2 8月份各转基因株系的Cry1Ac毒蛋白含量 Tab.2 Cry1Ac toxic protein content of various transgenic lines in August 株系Lines 毒蛋白含量Toxic protein content/(ng·g-1) PB1 665.11±20.38 a PB2 472.45±17.2 b PB3 53.85±5.07 e PB6 261.20±22.22 c PB7 16.38±1.03 f PB8 17.81±3.08 f PB9 110.56±3.08 d PB10 112.11±3.48 d CK 0 f

用8个有毒蛋白表达的转基因株系和对照的叶片对美国白蛾的1～6龄幼虫进行室内饲喂试验，不同株系对不同龄期幼虫的累积致死率见图 3和图 4，饲喂一定天数后各转基因株系对各龄期幼虫的致死率均可达到100%，随着龄期的增长，幼虫的死亡时间逐渐后延。1龄幼虫在取食的第2天，转基因株系的幼虫致死率明显高于对照，最高致死率为100%，取食第3天时，8个转基因株系的致死率均达到100%； 2龄幼虫和3龄幼虫在取食的第2天和第3天死亡率较高，到第4天时取食8个株系的死亡率均达到100%； 4龄幼虫在取食的第5天死亡数量最多，到第7天时取食8个株系的幼虫全部死亡； 5龄幼虫在第6天和第7天的死亡数量最多，到第9天时取食8个株系的幼虫死亡率均为100%； 6龄幼虫则集中死亡于第7～9天，部分株系的致死率于第9天达到100%，其余株系则在第11～13天达到100%。对照107杨叶片饲喂的各龄美国白蛾幼虫死亡率均低于5%。

	图 3 各转基因株系对不同龄期美国白蛾幼虫的累积致死率 Fig. 3 The cumulative mortality of every transgenic lines on H.cunea larvae in different instars

	图 4 美国白蛾2龄和4龄幼虫取食1天后的叶片 Fig. 4 One-day-eating leaves by L2 and L4 H.cunea CK-2：2龄幼虫取食CK叶片1天后的情况；PB1-2：2龄幼虫取食PB1叶片1天后的情况； CK-4：4龄幼虫取食CK叶片1天后的情况； PB1-4：4龄幼虫取食PB1叶片1天后的情况。CK-2: One-day-eating leaf of CK by L2 H. cunea larvae; PB1-2: One-day-eating leaf of PB1 by L2 H. cunea larvae; CK-4: One-day-eating leaf of CK by L4 H. cunea larvae; PB1-4: One-day-eating leaf of PB1 by L4 H. cunea larvae.

8个转基因株系对美国白蛾幼虫抗虫性上差异不明显，对各龄幼虫的致死率均能达到100%，但致死时间存在一定差异，PB1和PB2对各龄幼虫的致死时间均较短，其余株系对高龄幼虫的致死相对缓慢。

用8个有毒蛋白表达的转基因株系和对照的叶片对杨扇舟蛾1～4龄幼虫进行室内饲喂试验，不同株系对不同龄期幼虫的累积致死率见图 5，饲喂一定天数后部分株系对部分龄期幼虫的致死率可达100%，随着龄期的增长，幼虫的死亡时间逐渐后延。1龄幼虫在取食的第2天，取食转基因株系的幼虫死亡率高于对照，最高死亡率为96.67%，取食的第4天时8个转基因株系的致死率达到100%； 2龄幼虫在取食的第2 天死亡率明显低于1龄幼虫，到第4天时死亡率达到60%以上，到第12天时8个株系对幼虫的致死率达到100%； 3龄幼虫在取食的前4天均未死亡，到第8天时部分株系的致死率达60%以上，PB3，PB7和PB8的致死率较低，到第16天时，部分株系的致死率达到100%，而对2龄幼虫致死率均为100%的PB3，PB7和PB8这3个株系对3龄幼虫的致死率分别为15%，5%和15%； 4龄幼虫在取食的第6天的死亡数量最多，到第8天时取食部分株系的幼虫全部死亡，PB3，PB7和PB8的致死率较低，最高仅为22.22%。对照107杨叶片饲喂的各龄杨扇舟蛾幼虫死亡率均低于1.11%。

	图 5 各转基因株系对不同龄期杨扇舟蛾幼虫的累积致死率 Fig. 5 The cumulative mortality of every transgenic lines on C.anachoreta larvae in different instars

8个转基因株系对杨扇舟蛾幼虫抗虫性上存在显著差异，各株系对1龄和2龄幼虫的致死率均达到100%，但致死时间存在一定差异，PB3，PB7和PB8的致死时间相对缓慢；而只有部分株系对3龄和4龄幼虫的致死率达到100%，PB3，PB7和PB8对高龄幼虫的致死率较低。

本研究对转双抗虫基因欧美杨107杨10个株系和对照进行外源基因表达检测和抗虫试验，鉴定并筛选出对鳞翅目美国白蛾和杨扇舟蛾幼虫具有高抗性的转基因株系。PCR检测表明外源基因BtCry1Ac和API均已稳定地插入杨树基因组中。绝对荧光定量PCR检测表明，8月份PB1，PB2，PB6，PB9和PB10的转录丰度较高，PB3，PB7和PB8次之，PB4，PB5与对照一样未检测到转录表达。ELISA毒蛋白检测表明，毒蛋白的表达量与转录丰度大小一致。PB1，PB2，PB6，PB9和PB10 5个株系的毒蛋白含量较高； PB3，PB7和PB8 3个株系的毒蛋白含量较低； PB4，PB5与对照一样未检测到毒蛋白表达。室内饲虫试验表明转基因株系对美国白蛾幼虫的杀虫效果高于杨扇舟蛾幼虫。8个转基因株系对1～6龄美国白蛾幼虫的致死率均为100%； PB1，PB2，PB6，PB9和PB10对1～4龄杨扇舟蛾幼虫的致死率均为100%，PB3，PB7和PB8对1～2龄杨扇舟蛾幼虫的致死率为100%，对3龄和4龄的致死率最高为22.22%。综合抗虫对比试验结果，可以将8个转基因株系划分为2个抗性水平： PB1，PB2，PB6，PB9和PB10为高抗株系，对美国白蛾和杨扇舟蛾均表现高抗； PB3，PB7和PB8为中抗株系，对杨扇舟蛾表现出中抗，但对美国白蛾表现出高抗。

本研究利用转基因欧美杨107杨叶片对美国白蛾和杨扇舟蛾进行饲虫试验结果表明，转双价基因的107杨对2种害虫都具有较明显的抗性，筛选出的5个高抗株系对2种害虫都具有高抗性，另外3个株系PB3，PB7和PB8对美国白蛾具有很高的抗性，而对杨扇舟蛾则表现出中低抗性。有研究表明转基因植株对2种害虫的抗虫性不同(李立等，2009； 王颖等，2007)。转基因三倍体毛白杨对杨扇舟蛾幼虫的校正死亡率为100%的3个株系对舞毒蛾(Lymantria dispar)幼虫的致死率分别为79.1%，91.6%和87.5%，而对舞毒蛾幼虫校正死亡率为100%的株系对杨扇舟蛾幼虫的致死率为89.8%(李立等，2009)。

本研究中转基因107杨与转入BtCry1Ac和API基因的741杨相比，部分转基因107杨对美国白蛾1龄和4龄幼虫的死亡率达到100%的致死时间较转基因741杨pB29短(王桂英等，2012)； 转基因107杨对杨扇舟蛾1龄幼虫的致死率均达到100%，而转基因741杨最高为91.2%(田颖川等，2000)，对3、4龄高龄幼虫的致死率，转基因107杨部分株系达到100%，而转基因741杨最高仅为65.3%(Yang et al.，2003)。由此可见，在抗虫性方面，转基因107杨较转基因741杨高。在转基因杨树方面，因为没有单转API基因的欧美杨107杨来作对照，所以本试验无法与其作比较。但Guo等(2003)研究发现，转BtCry1Ac基因和API基因的双价植株比转单一的BtCry1Ac基因的植株在抗虫性方面具有明显的提高。

许多研究表明，外源基因整合到植物的基因组后，其表达和稳定性与转基因的失活或沉默有关(Stam et al.，1997； Kilby et al.，1992； Wu et al.，2002)。转基因失活的机制有很多种，如DNA甲基化、共抑制等(Wang et al.，2008； Meyer et al.，1994)。转基因沉默是指外源基因存在于生物体内，并未丢失或损伤，但该基因不表达或表达量极低的现象。本研究中PB4和PB5在毒蛋白检测中未检测到表达量，在荧光定量PCR检测中也未检测到BtCry1Ac基因的转录，这可能是由于BtCry1Ac基因的表达量较低或该基因在转化后发生失活或者转录后水平的基因沉默。中抗株系的PB3，PB7和PB8在毒蛋白和荧光定量PCR检测过程中，均检测到表达量，但表达量不高，这也可能与BtCry1Ac基因在转化过程中插入在基因组DNA的位置有关。因此，抗性不同的真正原因还需进一步研究。

目前转基因作物商品化的种类比较多，而转基因林木种类较少，特别是对转基因成年树木外源基因表达研究较少。由于林木生长周期长，遗传组成复杂，杂合度高且树体高大，外源基因的表达是否受到影响，以及在时间和空间上的表达差异，需要进行连续监测才可以获得。牛小云等(2011)对转BtCry3A抗虫基因741杨毒蛋白进行了时空表达研究，结果表明木质部中毒蛋白含量在时间上呈现了一定的规律性，而叶部和根中毒蛋白表达规律不明显； 在空间上叶部和根部毒蛋白表达量呈现较强的规律性，叶部毒蛋白表达表现为从树冠上部到下部依次递减的趋势。胡建军等(2007)连续多年对转Bt基因欧洲黑杨(Populus nigra)进行抗虫性调查，结果发现7年生的转Bt基因杨树抗虫效果明显，Bt基因能够稳定表达，未发现害虫产生耐受性。外源基因在时间和空间上的表达差异将是今后转基因林木研究的重点。