油橄榄(Olea europaea)为原产地中海地区的珍贵木本油料树种。我国引种油橄榄始于1964年，经过多年、多点试验确定了白龙江低山河谷区、金沙江干热河谷区和长江三峡低山河谷区3个适宜引种区(施宗明等，2011)，其中，以甘肃武都为中心的白龙江低山河谷区现已成为中国最大的油橄榄种植基地(邓煜等，2015)。目前，该区油橄榄陆续进入盛果期，出现了一些单株或单位面积的高产纪录，但与原产地相比，存在产量偏低且大小年结果严重的问题(大年树结果较多，小年树无花芽形成或有极少花芽形成)，这也是目前国内油橄榄适生区所面临的共性问题。现有研究对油橄榄花芽发端及花芽形态建成过程的认识已基本清晰(Rosa et al., 2000；Mert et al., 2013)。在我国，油橄榄花芽发端最早出现在开花当年2月下旬，花芽形态建成过程约持续2～3个月(邓明全等，1988)。而有关油橄榄成花诱导期的界定目前仍无统一认识。Lavee(1996)在前人研究(Pinney et al., 1990)的基础上，提出了油橄榄成花诱导“两步走”假设，认为： 第1次“诱导”出现在开花前一年的夏天，第2次要有必备的冷积温诱导。

植物激素在果树花芽形成过程中起着关键性作用(Hoad，1983；McLaughlin et al., 1991)。营养芽突变为花芽是各种激素在时间、空间上的相互作用产生的综合结果，取决于促进开花和抑制开花2类激素的平衡(Luckwill，1974)。多数研究认为赤霉素(GAs)对果树成花具有抑制作用(Prang et al., 1997)，细胞分裂素(CTK)促进果树花芽分化(牛辉陵等，2015)，脱落酸(ABA)对果树成花有重要作用(Al-Shdiefat et al., 2008；王海波等，2014)，生长素(IAA)对果树花芽分化的作用目前还未取得一致观点。但随着研究的不断深入，越来越多的研究发现，果树花芽分化的不同阶段内源激素的水平并不一致(高英等，2009)。在花芽分化的不同时期使用外源生长调节物质的效应也是不同的(曹尚银等，2001)。枇杷(Eriobotrya japonica)成花诱导期ABA含量持续上升，GA₃含量明显下降；花序原基分化期ABA含量继续上升，GA₃含量显著下降(刘宗莉等，2007)。紫丁香(Syringa oblata)和什锦丁香(Syringa×chinensis)花叶中玉米素核苷与脱落酸比值(ZRs/ABA)在花芽诱导期达到峰值，在花芽分化期逐渐下降(张姝媛，2008)。油橄榄为多年生常绿果树，花芽分化全过程历时较长，现有研究对油橄榄成花诱导与花芽分化期间内源激素变化尚无系统报道。本研究以甘肃武都主栽品种典型的大、小年树为试材，在划分成花诱导和花芽分化时期的基础上，研究花芽形成全过程中侧芽内源激素含量变化，以期更深入、系统地探讨内源激素对油橄榄花芽分化和大小年结果的调控作用。

试验于2012—2013年在甘肃省武都区油橄榄科技示范园(104°53′E，33°24′N)进行。该区海拔1 079.1 m，年平均气温14.9 ℃，最冷月(1月)平均气温4.1 ℃，年平均相对湿度为61%，年平均降水量483 mm，降水量主要集中在夏季6—8月(降水占全年的51%左右)，年降水日数平均为105天，年日照时数1 923 h，无霜期在280天以上。试验地土壤属侵蚀性褐土类，pH值8.2。试验材料选用当地主栽品种‘鄂植8号’和‘莱星’，树龄16年，栽植株行距4 m×5 m。2个品种大、小年结果现象严重。

供试2个品种各选择典型的小年树(当年结果极少或无结果树)3株，每树选择基部粗度为2.5～3 cm的大枝8个，每大枝上有当年生春梢50～70个，全部进行标记。从2012年7月20日—2013年2月18日，每隔约30天进行1次去叶处理，共8次，每次处理3个大枝，处理时每个当年生春梢只保留顶部3片叶(2片大叶和1片小叶)，其余全部摘除，同时以不摘叶为对照(20个)。于2013年4月上旬(花序轴伸长前期)统计所有摘叶枝及留叶枝上花芽形成率(以萌发花序侧芽占所有侧芽的百分数表示)。

2012年7月上旬(果实中果皮硬化之前)，参照树体以往结果习性和当年开花状况(表 1)，选择典型的大、小年树各3株，每种树体标记基部粗度为3.5～4 cm的大枝10个。于2012年7月至2013年4月期间，每隔30天左右采集标记大枝上侧芽约1.5 g，3次重复，共采集10次，每次采集1个标记大枝。采集样品经液氮速冻后置于－80 ℃冰箱中保存，采集完成后集中测定各时期样品中的玉米素核苷(ZR)、赤霉素(GA₃)、生长素(IAA)和脱落酸(ABA)含量。

表 1 供试树前3年结果及当年开花状况^① Tab.1 Yield of fruits in the previous three years and flowers in the current year of experimental trees

表 1 供试树前3年结果及当年开花状况① Tab.1 Yield of fruits in the previous three years and flowers in the current year of experimental trees 品种Varieties 树体Trees 产量 Yield/(kg·tree-1) 每个结果枝上小花个数Number of flowers per fruit branch 2009 2010 2011 2012 ①“—”号表示无果实或花形成。“—”indicates no fruits or flowers formation. ‘鄂植8号’ Olea europaea ‘Ezhi 8’ 小年树‘Off’-year trees 21.0 — 19.5 — 大年树‘On’-year trees — 20.3 — 116.3 ‘莱星’ Olea europaea ‘Leccino’ 小年树‘Off’-year trees 22.7 — 22.1 — 大年树‘On’-year trees — 20.9 — 98.7

参照Al-Shdiefat等(2006；2008)的方法，有所改进。准确称取样品1.000 g，在冰浴下研磨至匀浆，加入80%的预冷甲醇(MeOH)40 mL放入4 ℃冰箱里冷浸过夜。次日收集上清液，残渣用20 mL纯MeOH浸提1 h，合并2次上清液，冷冻离心(10 000 r·min^-1，4 ℃)10 min，上清液在40 ℃下减压蒸发至无MeOH残余，剩余水相用1%NaOH调至pH8，然后用等体积乙酸乙酯(EtoAc)萃取3次，合并上层酯相(约24 mL)，在40 ℃下减压蒸发至干，残渣保存在4 ℃冰箱中，待用；下层水相(约8 mL)用1% HCl调节pH=3，加入等体积EtoAc萃取3次，合并上层液(约24 mL)，上清液在40 ℃下减压蒸干，加入5 mL 80%甲醇溶解后过C₁₈固相萃取小柱，洗脱液在40 ℃下减压蒸干后得生长素(IAA)、赤霉素(GA₃)和脱落酸(ABA)提取液，提取液用100% MeOH定容至0.5 mL(样品1)，保存于4 ℃冰箱中。

在之前保存的样品残渣中加入25 mL 80% MeOH溶液，40 ℃下减压蒸发至无MeOH残留(约5 mL)，用1%HCl调节pH=3，加入等体积EtoAc萃取3次，弃上层酯相；下层水相用1%NaOH调至pH=5.5，加入饱和正丁醇萃取3次，合并醇相(约15 mL)，在40 ℃下减压蒸发至干，用5 mL 80%甲醇溶解后过C₁₈固相萃取柱，洗脱液在40 ℃下减压蒸干后得玉米素核苷(ZR)提取液，提取液用100% MeOH定容至0.5 mL(样品2)。

将样品1和样品2混合，混合液过0.25 μm微孔滤膜，保存于4 ℃冰箱中，在1周内测定完成。

使用Agilent 1200液相色谱仪(美国Agilent公司)，包括紫外检测器、Agilent 1200色谱工作站等测定样品中ABA，ZR，GA₃和IAA含量。色谱条件： 色谱柱为ODS-C₁₈，流动相为甲醇∶0.075%冰醋酸水溶液=45∶55(V/V)，检测波长254 nm，流速为0. 25 mL·min^-1，柱温25 ℃，进样量为10 μL。

数据分析采用SPSS19.0软件，ANOVA模块下Duncan法分析处理间的差异显著性，数据制图采用Excel 2003软件。

油橄榄‘鄂植8号’和‘莱星’未摘叶枝条(对照)上花芽形成率较高(表 2)，分别达88.6%和83.6%。7月20日摘叶处理枝上无花芽形成，说明此时还未进入成花诱导期，摘叶可完全抑制营养芽向花芽的转变；从8月21日(‘莱星’)和9月23日(‘鄂植8号’)开始，摘叶枝上开始有少量花芽形成，说明此时已有少量花芽完成其成花诱导；之后，至2012年11月18日之前较长的一段时期，2个品种摘叶枝花芽形成率均较低，介于0～10.5%之间；从11月18日开始至次年1月25日一段时期内，2个品种摘叶枝上花芽形成率持续大幅增加，意味着此段时期应为油橄榄2个品种的成花诱导关键期；之后，摘叶枝上花芽形成率增长明显减慢，至2013年2月18日，2个品种摘叶枝花芽形成率基本达到各自对照水平，说明此时2个品种成花诱导期基本结束，之后将进入花芽分化期。油橄榄2个品种成花诱导期持续时间略有差异。‘鄂植8号’从9月 23日开始，至次年2月18日结束，约持续150天；‘莱星’从8月21日开始，至次年2月18日结束，约持续180天。但2个品种成花诱导关键期(11月18日至次年1月15日)及成花诱导结束期(次年2月15日)一致。

表 2 摘叶对油橄榄花芽形成率的影响^① Tab.2 The influence of defoliation on rates of flower buds in O.europaea

表 2 摘叶对油橄榄花芽形成率的影响① Tab.2 The influence of defoliation on rates of flower buds in O.europaea 摘叶日期 Date of defoliation 花芽形成率 Rate of flower buds(%) ‘鄂植8号’‘Ezhi 8’ ‘莱星’‘Leccino’ ①同列不同小写字母表示处理间差异显著(P＜0.05)。Different small letters in the same column mean significant difference at P < 0.05. 2012-07-20 — — 2012-08-21 — 1.3±0.01 e 2012-09-23 0.8±0.09 d 6.7±0.12 d 2012-10-20 1.2±0.17 d 8.2±0.25 d 2012-11-18 1.4±0.15 d 10.5±1.31 d 2012-12-20 23.4±4.11 c 37.2±0.11 c 2013-01-15 75.7±5.10 b 63.3±4.82 b 2013-02-18 80.2±2.61 ab 77.8±8.53 ab CK 88.6±1.61 a 83.6±2.31 a

成花诱导与花芽分化期间，油橄榄‘鄂植8号’和‘莱星’大年树侧芽ABA含量基本维持稳定(图 1)，小年树侧芽ABA含量在成花诱导关键期(2012年11月至2013年1月)急剧升高后又下降至最初水平。成花诱导关键期，小年树侧芽ABA含量显著高于大年树。

	图 1 油橄榄大、小年树侧芽中ABA含量的变化 Fig. 1 Changes of free ABA content in the lateral buds in‘on’-year and‘off’-year olive trees 不同小写字母代表各时期大、小年树间在0.05水平上差异显著。下同。 For each date, values with different lowercase letters mean ‘on’-year and‘off’-year trees differ significantly at P < 0.05. The same below.

成花诱导期，侧芽ZR含量‘鄂植8号’总体呈先略有升高后持续下降趋势，‘莱星’总体呈先持续下降后略有升高趋势(图 2)。成花诱导期大部分时间中，2个品种小年树侧芽ZR含量显著高于大年树。花芽分化期，2个品种大年树ZR含量总体上略有升高，小年树ZR含量‘鄂植8号’持续升高，‘莱星’在较高水平上略有下降。花芽分化期，2个品种小年树ZR含量显著高于大年树。

	图 2 油橄榄大、小年树侧芽中ZR含量变化 Fig. 2 Changes of free ZR content in lateral buds in‘on’-year and‘off’-year olive trees

成花诱导期，2个品种大年树侧芽GA₃含量总体呈下降趋势(‘鄂植8号’持续下降，‘莱星’呈先下降后稳定再急剧下降趋势，图 3)，小年树侧芽GA₃含量均在诱导初期明显升高，之后维持与大年树一致的变化趋势。成花诱导初期大年树GA₃含量显著高于小年树。花芽分化期，2个品种大年树侧芽GA₃含量变化较剧烈(均先逐步升高之后急剧下降)，小年树侧芽GA₃含量变化较缓慢(‘鄂植8号’先缓慢升高后又略有下降，‘莱星’基本维持稳定)。大部分时期中，大年树侧芽GA₃含量显著高于小年树。

	图 3 油橄榄大、小年树侧芽中GA3含量的变化 Fig. 3 Changes of free GA3 content in the lateral buds in‘on’-year and‘off’-year olive trees

成花诱导期，‘鄂植8号’大年树侧芽IAA含量基本维持稳定，小年树侧芽IAA含量先出现一个小高峰后亦基本维持稳定(图 4)；‘莱星’大、小年树侧芽IAA含量均形成一个明显的高峰，峰值出现在成花诱导关键期。大部分时期2个品种大年树IAA含量显著高于小年树。花芽分化期，‘鄂植8号’大年树侧芽IAA含量持续升高，小年树侧芽IAA含量总体略有下降；‘莱星’大年树侧芽IAA含量先急剧升高后略有下降，小年树侧芽IAA含量出现小幅度升高。花芽分化期大部分时间大年树侧芽IAA含量显著高于小年树。

	图 4 油橄榄大、小年树侧芽中IAA含量的变化 Fig. 4 Changes of free IAA content in the lateral buds in‘on’-year and‘off’-year olive trees

成花诱导期，‘鄂植8号’侧芽ABA/GA₃，IAA/GA₃和(ABA+IAA)/GA₃比值均出现一个高峰，峰值与成花诱导关键期重合(图 5A，B，C)；‘莱星’小年树ABA/GA₃，IAA/GA₃和(ABA+IAA)/GA₃比值总体上升，大年树则先下降后又基本上升至最初水平；大部分时期中2个品种小年树ABA/GA₃，IAA/GA₃和(ABA+IAA)/GA₃比值显著高于大年树。花芽分化期，‘鄂植8号’大年树侧芽ZR/GA₃和ZR/ABA比值先下降后基本维持稳定，ZR/IAA持续下降(图 5D，E，F)；小年树侧芽ZR/GA₃和ZR/ABA比值逐渐上升，ZR/IAA先出现一个小高峰后持续下降；2个品种小年树侧芽ZR/GA₃，ZR/ABA和ZR/IAA比值显著高于大年树。由此推断，高水平的ABA/GA₃，IAA/GA₃和(ABA+IAA)/GA₃有利于油橄榄花芽诱导；高水平的ZR/GA₃，ZR/ABA和ZR/IAA有利于油橄榄花芽形态分化。

	图 5 油橄榄大、小年树侧芽中激素比值的变化 Fig. 5 Changes of the ratio of several hormones in lateral buds in‘on’-year and‘off’-year olive trees

定期摘叶是研究果树成花诱导期常用的方法(曹尚银，2000；张姝媛，2008)。叶片在果树成花过程中起重要作用。当摘叶不能抑制花芽形成时，表明此时花芽已完成成花诱导。果树花芽分化完成的关键在于，一是枝梢生长和成熟达到具备接受成花诱导的能力，二是接受低温诱导之后营养芽成为花芽(陈厚彬等，2014)。油橄榄‘鄂植8号’和‘莱星’成花诱导关键期和结束期基本一致，这与2个品种来自同一试验园区(外界环境条件相同)，且花期相同(5月上旬)相符合。但2个品种成花诱导期起始时间略有差异，可能的原因为摘叶初期枝梢分化程度不同所致。另外，2个品种成花诱导起始时间在花后10周左右，这与Fernández-Escobar等(1992)的研究结果基本一致，而2个品种成花诱导关键期在11月至次年1月期间，亦符合低温诱导油橄榄成花的条件(Fabbri et al., 2000)。

ABA被看作是一种促进果树成花的重要激素。苹果(Malus domestica)成花诱导期花芽中ABA含量显著增加，并长期处于较高水平，而叶芽中ABA水平较低(曹尚银等，2000)。ABA在枇杷成花中扮演主导角色，没有ABA的持续升高就不能导向成花(刘宗莉等，2007)。枣(Ziziphus jujuba)吊发育前期ABA出现明显峰值(牛辉陵等，2015)。本研究中油橄榄2个品种小年树侧芽ABA峰值出现时间恰值成花诱导关键期，而同期大年树ABA含量基本未变，且大年树ABA含量水平显著低于小年树，说明高水平的ABA对油橄榄花芽诱导具有促进作用，这与Al-Shdiefat等(2008)的研究结果基本一致。Luckwill(1980)指出，苹果花芽诱导期，木质液中若有足够的细胞分裂素，则顶芽会分化出花芽来，相反木质液中无细胞分裂素时，则不会有花芽产生。Andreini等(2008)利用免疫细胞化学技术观察到油橄榄小年树侧芽玉米素(Zeatin，ZT)含量在中果皮硬化期(7月)显著积累，因此认为ZT可能在油橄榄成花诱导中扮演着重要的作用。油橄榄‘鄂植8号’和‘莱星’尽管也出现在花芽诱导初期小年树玉米素核苷(ZR)含量显著高于大年树的现象，但就整个成花诱导期变化来看，大、小年树侧芽ZR含量均呈下降变化趋势，且在成花诱导关键期二者ZR含量水平接近，因此，无法明确判断ZR与油橄榄成花诱导的关系。ZT和ZR可能在油橄榄成花诱导中所起的作用并不相同，还需进一步研究。Chen(1991)的研究认为果树营养芽内高水平的细胞分裂素与花芽发端数之间呈正相关关系。本试验中大年树侧芽ZR含量在花芽分化期基本维持未变，小年树ZR含量却大幅升高，且小年树ZR含量显著高于大年树，说明高水平的ZR对油橄榄花芽形态分化具有促进作用，与已有结论一致。成花诱导初期，大年树侧芽GA₃含量显著高于小年树，但之后大、小年树侧芽GA₃含量均急剧下降，GA₃对油橄榄花芽诱导和大小年结果的影响可能是由正在发育果实种子输向叶片的特定信号，引起叶片内的代谢发生改变而引起的(Lavee，1989)，并非直接抑制成花诱导(Proietti et al., 2002)。GA₃对果树花芽形态分化的作用，目前并无一致认同。本试验中2个品种大年树侧芽GA₃含量在花芽形态分化期总体呈上升趋势，小年树侧芽GA₃含量则基本维持稳定，且大年树侧芽GA₃含量水平显著高于小年树，表明高水平的GA₃对油橄榄花芽形态分化具有抑制作用。IAA对油橄榄成花诱导的促进作用和花芽分化的抑制作用与其他果树(王姗等，2013)及油橄榄(Al-Shdiefat et al., 2008)的研究结果一致。

果树花芽形成过程中，不同类型激素间的平衡状况比单一激素的作用更重要。油橄榄成花诱导及花芽分化过程可能与各激素间的平衡有关。成花诱导期小年树ABA/GA₃，IAA/GA₃和(ABA+IAA)/GA₃出现一个高峰，峰值与成花诱导期重合，且显著高于大年树，而在花芽分化期，小年树ZR/GA₃，ZR/ABA和ZR/IAA比值均有明显上升趋势，且显著高于大年树。

高水平的ABA，IAA，ABA/GA₃，IAA/GA₃和(ABA+IAA)/GA₃有利于油橄榄成花诱导；高水平的ZR，ZR/GA₃，ZR/ABA和ZR/IAA有利于油橄榄花芽分化。