文章信息
- 孙化雨, 陈颖, 赵韩生, 董丽莉, 王丽丽, 娄永峰, 高志民
- Sun Huayu, Chen Ying, Zhao Hansheng, Dong Lili, Wang Lili, Lou Yongfeng, Gao Zhimin
- 毛竹β-胡萝卜素羟化酶基因的分子特征及其功能
- Molecular Characteristics and Functional Analysis of β-Carotene Hydroxylase Gene from Phyllostachys edulis
- 林业科学, 2015, 51(10): 53-59
- Scientia Silvae Sinicae, 2015, 51(10): 53-59.
- DOI: 10.11707/j.1001-7488.20151007
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文章历史
- 收稿日期:2014-10-20
- 修回日期:2014-12-02
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作者相关文章
β-胡萝卜素羟化酶(BCH)是植物类胡萝卜素合成代谢途径中的关键酶之一,催化β-胡萝卜素经中间产物β-隐黄素合成玉米黄质(Tian et al., 2004)。在强光胁迫下,玉米黄质通过参与植物过量光能的非放射性释放过程,帮助植物释放掉多余的能量,降低集中到反应中心的激发能,减少自由基的形成,抑制光破坏的发生,从而起到光保护的作用(Demmig et al., 1987)。BCH广泛存在于植物、蓝藻和细菌等生物中,拟南芥(Arabidopsis thaliana)(Sun et al., 1996)、甜橙(Citrus sinensis)(徐昌杰等,2003)、南丰蜜橘(Citrus reticulata var. kinokuni)(冯唐锴等,2007)等多种植物的β-胡萝卜素羟化酶基因相继被克隆。在拟南芥中β-胡萝卜素羟化酶基因的过量表达,能够提高植物的抗逆性(Davison et al., 2002)。而利用反义抑制或者 T-DNA突变的方法,获得了抑制β-胡萝卜素羟化酶基因表达的拟南芥株系,它们合成隐黄素、玉米黄质等类胡萝卜素的能力下降,抗逆性也随之下降(Pogson et al., 2000; Tian et al., 2003)。甜橙中Csβ-CHX基因沉默导致果实表型为深黄色,其果汁中的β胡萝卜素含量显著增加(最高可达36倍)(Pons et al., 2014)。因此,开展BCH基因研究对了解植物的光保护能力以及β胡萝卜素的生物合成具有重要意义。
竹子是重要的森林资源之一,主要分布在低纬度的热带或亚热带季风气候区,种植区在春季、夏季和秋季常出现持续的高温强光天气,这会直接影响竹子的生长,尤其是存在其他胁迫的条件下,竹子很容易产生光抑制,甚至光破坏。而适应各种光照环境是植物生存的本能,为适应复杂多变的光胁迫环境形成了多种保护机制,如通过改变叶片的角度以减少光能的吸收,从而避免吸收过量的光能(Powles,1984);提高核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶的活性或数量来增加碳同化的能力,从而减少过量激能的形成,避免植物受到光破坏的危害(Spreitzer et al., 2002);通过叶黄素循环将过量光能以无害的热能形式耗散掉(Hieber et al., 2004)等。本研究以毛竹(Phyllostachys edulis)为对象,从合成玉米黄质的另一关键酶基因——β-胡萝卜素羟化酶基因入手,在分析其结构特点、表达特征的基础上,通过在拟南芥中异位表达对其功能进行了初步验证,以期从分子水平上揭示β-胡萝卜素羟化酶基因在毛竹光破坏防御中的作用,为采用基因工程手段培育抵抗强光胁迫的植物新品种提供参考。
1 材料与方法 1.1 试验材料毛竹盆栽实生苗(0.5年生),培养于本实验室的培养室,培养温度25 ℃,光照145 μmol·m-2s-1,光周期为16 h/8 h。采集毛竹新根及新生枝条的幼茎、节、叶片和叶鞘,用于试验。
分别对毛竹苗采取黑暗、不同光照(100,300,500,1 000,1 500 μmol·m-2s-1)处理2 h,每个处理重复3次,同时以培养室光照下的竹苗为对照,处理完成之后,采取顶端第3片叶用于后续试验。
1.2 基因克隆与生物信息学分析以玉米β-胡萝卜素羟化酶基因BCH1(GQ131287)(Li et al., 2010)为诱饵,采用同源比对方法从NCBI数据库中调取毛竹的同源序列,根据该序列利用Primer Premier 5.0软件设计PCR引物(BCH-F:5′-ATGGCCGCAGGACTCTCCG-3′和BCH-R: 5′-AACACTCCTGTTCCGGTTGATTCTC-3′),由北京六合华大基因科技有限公司合成。
采用Trizol法(Gao et al., 2006)分别提取毛竹新根及新生枝条的幼茎、节、叶片和叶鞘的RNA以及光照处理植株叶片的RNA,按照RNA反转录试剂盒说明合成cDNA。采用CTAB法(高志民等,2006)提取毛竹叶片基因组DNA,用分光光度计测定浓度,检测质量,用琼脂糖凝胶电泳检测DNA分子量大小。
分别以叶片cDNA和基因组DNA为模板,扩增编码区及其对应的基因组序列。PCR反应体系为:DNA(0.04 μg·L-1)1 μL,正向引物(10 μmol·L-1)1 μL,反向引物(10 μmol·L-1)1 μL,dNTP(各2.5 mmol·L-1)1.6 μL,5×Primer STARTM Buffer 4 μL,Primer STARTM酶(2.5 U·μL -1)0.2 μL,补加 ddH2O至总体积20 μL。PCR反应条件:95 ℃ 30 s,64 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,共32个循环。PCR产物电泳分析后,用BIOMIGA试剂盒回收,按照pGEM-T easy载体快速连接试剂盒操作流程,将回收的DNA片段连接到载体上,转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α菌株,经蓝白斑筛选,挑取阳性克隆并经酶切图谱分析后,由北京六合华大科技有限公司测序。
利用在线软件Spidey(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/spidey/)分析基因组结构。分别利用ProtScale(http://web.expasy.org/protscale)、TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)、FoldIndex(http://bip.weizmann.ac.il/fldbin/findex)、GOR(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html)、Phyre 2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)预测蛋白的疏/亲水性、跨膜结构域、折叠状态、二级结构、三级结构;利用ProDom(http://prodom.prabi.fr/prodom/current/html/form.Php)和ScanProsite(http://prosite.expasy.org/scanprosite/)预测蛋白结构域和模体。
1.3 基因表达检测根据目的基因序列设计实时荧光定量PCR引物(QBCH-F:5′-GACTCTCCGGCGCCGCTAT-3′和QBCH-R:5′-TTCCTCCAGGGCCGAAGCAG-3′)。分别以毛竹根、茎、叶片、叶鞘和节,以及光照处理植株叶片的cDNA为模板,采用LightCycler®480 SYBR Green I Master实时荧光定量PCR试剂盒,进行实时荧光定量PCR扩增。
反应体系(10 μL):Mix 5 μL,H2O 3.2 μL,cDNA 1 μL,QBCH-F/QBCH-R各0.4 μL(10 μmol·L-1)。PCR反应在qTOWER仪器上进行,反应程序:95 ℃预变性10 min;95 ℃变性20 s,62 ℃退火10 s,40个循环。同时,以NTB作为内参(Fan et al., 2013)。反应结束后,应用2-ΔΔCt算法分析试验结果(Livak et al., 2001)。
1.4 基因植物表达载体构建根据本实验室保存的植物表达载体pC1301-35S-OCS(由pCAMBIA1301改造引入启动子35S和章鱼碱合成酶终止序列OCS而成)的多克隆位点以及目的基因序列的酶切位点特征设计特异引物(BCHFs:5′-ggtaccATGGCCGCAGGACTCTCCG-3′,BCHRs:5′-ggatccAACACTCCTGTTCCGGTTGATTC TC-3′),在目的基因编码区的5′和3′端分别添加KpnⅠ和BamHⅠ酶切位点,采用高保真酶进行PCR扩增,回收的扩增产物加A后连接到pGEM-T easy载体上,经测序验证后,用KpnⅠ和BamHⅠ双酶切将测序正确的克隆连入植物表达载体。
1.5 拟南芥转化、检测采用电击法将目的基因的植物表达载体质粒转入农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105感受态细胞中,转化拟南芥(Clough et al., 1998)。经连续抗性(潮霉素50 mg·L-1)筛选植株,获得不分离的T3代植株,提取总RNA并反转录成cDNA,采用RT-PCR方法对目的基因的表达进行检测,同时以质粒和野生型拟南芥作为对照。
1.6 转基因拟南芥植株色素含量、荧光参数分析对转基因植株进行色素含量的测定,采集长势好的叶片,黑暗下称取约0.10 g叶片,剪成长、宽约为0.2~0.4 cm的碎片置于10 mL的离心管中,加入5 mL的萃取液[丙酮:酒精=1:1(V/V)混合液],避光浸泡,至叶片完全失去绿色,期间黑暗下颠倒混匀2~3次。以萃取液为空白对照,用分光光度计测定其在462.5,470,474,485,665 nm波长下的吸光值,并计算色素的含量(许元明等,2013)。用Imaging PAM测定转基因植株叶片的叶绿素荧光参数Y(Ⅱ)和NPQ,测定5株数据进行分析。
2 结果与分析 2.1 毛竹PeBCH基因编码区及其对应基因组序列的获得通过搜寻比对,获得了1个玉米(Zea mays)BCH1基因的毛竹同源序列(FP098087),命名为PeBCH。该基因的全长1 385 bp,5′和3′非编码区的长度分别为37 bp和421 bp,编码区的长度为927 bp。以毛竹叶片cDNA为模板,用引物BCH-F和BCH-R扩增,PCR产物电泳结果显示,在1 000 bp左右有1条清晰条带,与目的基因片段大小一致。测序结果分析表明,获得的序列与FP098087的编码区完全一致。
以毛竹叶片基因组DNA为模板的PCR扩增产物电泳显示,在1 500 bp左右有1条清晰条带,测序结果目的片段为1 566 bp。基因组序列结构分析显示,该基因组序列包含6个外显子,5个内含子分别位于403—517 bp,580—673 bp,879—1015 bp,1142—1296 bp和1354—1491 bp(图 1),内含子完全符合GT-AG剪接原则(Moore et al., 1993)。
PeBCH编码的蛋白含308个氨基酸,分子量和理论等电点分别为33.8 kDa和9.78。疏/亲水性预测表明,PeBCH蛋白N端为疏水区,C端为亲水区,总体呈现亲水性。PeBCH包含3个保守结构域PDA0W9I6(9—65 aa)、PD095142(111—175 aa)和PD011050(173—268 aa),其中PD095142和PD011050是β-胡萝卜素羟化酶家族中的特征结构域。另外,该蛋白中还含有10个保守的组氨酸残基,这些组氨酸残基能够形成2组“HXXXXH”和“HXXHH”模体,构成一个具有催化作用的结构域,可能是该酶的催化位点。
结构预测显示,PeBCH蛋白存在4个跨膜结构,分别位于105—127 aa,142—164 aa,194—211 aa,215—237 aa;含有无规则卷曲、延伸链和α螺旋共3种二级结构,其中无规则卷曲覆盖144个氨基酸残基(46.75%),α螺旋覆盖119个氨基酸残基(38.64%),延伸链覆盖45个氨基酸残基(14.61%);折叠状态显示该蛋白具有比较稳定的三级结构。
2.3 毛竹PeBCH基因表达分析实时荧光定量PCR结果表明,PeBCH基因在毛竹的新根、幼茎、叶片、叶鞘、节中均检测到表达,但表达丰度存在着明显的差异,其中在叶片中的相对表达丰度最高,叶鞘、幼茎和节中依次减少,而根中的表达丰度最低(图 2)。
不同光照处理后,叶片中基因表达分析表明:随着光强(<1 500 μmol·m-2s-1)的增大,PeBCH基因的表达丰度呈现上升的趋势;与对照组相比,黑暗处理PeBCH基因的表达丰度最低;光强100 μmol·m-2s-1处理后基因的表达丰度与对照相接近,光强300 μmol·m-2s-1处理后基因表达上升不明显,而光强500,1 000 μmol·m-2s-1处理后基因的表达丰度则上升明显,比对照组高0.5~1.0倍;但光强1 500 μmol·m-2s-1处理后,PeBCH基因的表达丰度显著下降,仅为对照的5%,明显受到强光的抑制(图 3)。
为了进一步验证基因的功能,将PeBCH基因克隆到植物表达载体pC1301-35S-OCS的多克隆位点,形成基因的过量表达载体pC1301-35S-PeBCH-OCS(图 4),并在拟南芥中异位表达。经连续抗性筛选获得了T3代抗性植株4个单株,RT-PCR检测结果表明,转基因植株中均含有与阳性对照一致的目的片段,而野生型拟南芥中没有检测到(图 5),表明PeBCH基因在转基因植株中得到了表达。
表型分析发现,与野生型拟南芥相比,转PeBCH基因植株生长健壮,叶色较深。色素含量测定结果表明,转基因植株的叶绿素、类胡萝卜、胡萝卜素和叶黄素含量比野生型植株分别增加了5.0%±0.7%,26.9%±4.5%,38.3%±5.7%,26.9%±8.5%。
叶绿素荧光参数测定结果表明,在实验室环境光强(145 μmol·m-2s-1)下,转PeBCH基因植株的实际光化学速率Y(Ⅱ)虽比野生型有所增加,但没有明显差异,而转基因植株的非光化学猝灭系数NPQ明显高于野生型植株,达到极显著水平(P<0.01)(图 6)。在强光(530 μmol·m-2s-1)条件下,转PeBCH基因植株与野生型的Y(Ⅱ)也没有明显差异,而NPQ的动力学曲线显示,转PeBCH基因植株的NPQ明显高于野生型植株,且稳定后差异达到极显著水平(P<0.01)(图 7)。
全球环境的变化使得高产、优质、抗逆林木品种的选育工作显得尤为重要。自然条件下,光效率的调节随时在发生,植物PSⅡ光化学效率下降的发生和玉米黄质的积累之间存在着密切联系(Demmig-Adams et al., 2012)。BCH是叶黄素循环之外的又一个玉米黄质生物合成的重要酶基因,基因的分子特征决定着其编码蛋白的结构和功能。对毛竹叶黄素循环关键酶基因——紫黄质脱环氧化酶基因的研究表明,该基因的体外表达产物具有将紫黄质经中间体花药黄质转化为玉米黄质的生物学活性(Gao et al., 2013)。本研究虽然对PeBCH编码蛋白进行了生物信息学分析,但其生物活性如何,尚需要通过试验进一步验证。
启动子是参与特定基因转录及其调控的序列,通过其所含作用元件的分析可以预测影响基因表达的环境因素。对PeBCH启动子序列(转录起始位点上游2 000 bp序列)中作用元件的分析发现,其中存在3-AF1 binding site,Box Ⅰ,GAG-motif,GATA-motif,GT1-motif,Ⅰ-box,Sp1,as-2-box,Box 4和LAMP-element等多种光应答元件,以及参与光应答的ACE和G-box顺式作用元件,因此推测PeBCH在毛竹中的表达可能受到光的调节。不同光处理后对PeBCH表达检测结果表明,该基因的表达受到光照的诱导,随着处理强度增加(0~1 000 μmol·m-2s-1)而呈现上升的趋势,但光强1 500 μmol·m-2s-1处理2 h后,其表达受到严重抑制,这可能是光照强度过强引起的。
NPQ是反映逆境胁迫条件下植物热耗散能力的重要荧光参数。本研究中,过量表达PeBCH的转基因拟南芥植株的NPQ明显增加,这意味着转基因植株热耗散的能力提高,抵抗强光逆境的自我保护能力相对增强,这与过量表达BCH基因DSM2的水稻(Oryza sativa)的表现一致(Du et al., 2010)。究其原因,在拟南芥中有3个催化β-胡萝卜素生成玉米黄素的相关基因(BCH1,BCH2,CYP97A3),但它们之间功能存在冗余(Kim et al., 2009),而毛竹PeBCH基因的过量表达促进了胡萝卜素向玉米黄素的转化,使得其含量增加,抗光胁迫能力增强。同时,转PeBCH基因拟南芥植株叶片的叶绿素、类胡萝卜、胡萝卜素和叶黄素含量比野生型植株均有所增加,使得PSⅡ中的天线色素含量增加,吸收光能的总量提高,有助于增强光化学效率,其Y(Ⅱ)值略有增加证明了这一点。本研究为培育抵抗强光胁迫的植物新品种提供了新的基因资源,对于今后竹类植物的分子育种具有重要参考价值。
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