林业科学  2015, Vol. 51 Issue (10): 126-133   PDF    
DOI: 10.11707/j.1001-7488.20151016
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文章信息

李艳艳, 杨艳芳, 王俊青, 王帅, 刘洪伟, 邱德有
Li Yanyan, Yang Yanfang, Wang Junqing, Wang Shuai, Liu Hongwei, Qiu Deyou
红豆杉TcLBDs基因的克隆与表达分析
Cloning and Expression of Lateral Organ Boundaries Domain Genes (TcLBDs) in Taxus chinensis
林业科学, 2015, 51(10): 126-133
Scientia Silvae Sinicae, 2015, 51(10): 126-133.
DOI: 10.11707/j.1001-7488.20151016

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收稿日期:2015-02-04
修回日期:2015-03-25

作者相关文章

李艳艳
杨艳芳
王俊青
王帅
刘洪伟
邱德有

红豆杉TcLBDs基因的克隆与表达分析
李艳艳1, 杨艳芳1, 王俊青2, 王帅1, 刘洪伟1, 邱德有1    
1. 中国林业科学研究院林业研究所 林木遗传育种国家重点实验室 北京 100091;
2. 湖北襄阳市林业科学研究所 襄阳 441052
摘要【目的】 LBD(LATERAL ORGAN BOUNDARIES DOMAIN)转录因子在植物次生生长中具有潜在的作用。克隆红豆杉LBD基因,研究LBD在红豆杉剥皮后树皮再生过程中的表达状况,以揭示其调控作用。【方法】 在红豆杉剥皮再生组织转录组数据库中搜索LBD基因,根据获得的基因序列设计引物,利用RT-PCR方法克隆得到 2个红豆杉TcLBDs基因的cDNA片段,分别命名为TcLBD1TcLBD6。进一步利用生物信息学工具对其进行分析,最后利用半定量 RT-PCR 对红豆杉不同组织、利用qRT-PCR技术对其剥皮再生不同时期的TcLBDs的表达进行分析。【结果】 TcLBD1的cDNA包含 549 bp开放阅读框(ORF),编码182个氨基酸; TcLBD6的 cDNA包含 687 bp开放阅读框,编码228个氨基酸。TcLBD1TcLBD6编码的蛋白质分子量分别为 19.97,25.13 kDa,序列分析表明二者在N端存在着LBD类转录因子特有的LOB结构域,都属于第1类(Class Ⅰ)LBD; 二者在核酸序列和氨基酸序列水平上分别有 55.2%和 57.9%的相似性,且蛋白质二级结构也具有较高的相似性。系统进化树结果显示TcLBD1与北美云杉的蛋白(ABK21479)聚为一簇,亲缘关系最近; TcLBD6与拟南芥的AS2/LBD6聚在一起。组织表达谱分析表明TcLBD1在茎和木质部(含形成层)中表达量明显高于根、叶片和韧皮部(含形成层)中的表达量; TcLBD6主要在根和茎中表达。2 个TcLBDs 基因在红豆杉剥皮再生不同时期再生组织间的表达模式结果显示,在其剥皮再生过程中TcLBD1基因表达量在6天时达到最高,整体呈上调表达; TcLBD6表达水平在18天后显著上调。【结论】 克隆 2 个红豆杉TcLBDs基因,TcLBD1TcLBD6,这2个基因在红豆杉剥皮再生过程中均有响应,推测二者在红豆杉剥皮后树皮再生过程中起调控作用。
关键词红豆杉    LBD    转录因子    生物信息学分析    基因表达    
Cloning and Expression of Lateral Organ Boundaries Domain Genes (TcLBDs) in Taxus chinensis
Li Yanyan1, Yang Yanfang1, Wang Junqing2, Wang Shuai1, Liu Hongwei1, Qiu Deyou1    
1. State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding Research Institute of Forestry, CAF Beijing 100091;
2. Xiangyang Institute of Forestry Science in Hubei Province Xiangyang 441052
Abstract: [Objective] LBD(LATERAL ORGAN BOUNDARIES DOMAIN) transcription factors play a potential role in plant secondary growth. The aims were to clone the cDNA of LBDs from Taxus chinensis and reveal their potential regulatory role in tissues regeneration after bark girdling by investigating the expression profiles of these LBDs. [Method] According to the sequences of TcLBDs genes obtained from the transcriptome database of the regeneration tissues after bark girdling in T. chinensis, specific primers were designed. The two LBD genes were isolated using reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). Bioinformatic characteristics of the cloned TcLBDs were analyzed using online service. Lastly, the expression profiles of these genes in different tissues and at different regeneration stages after bark girdling were analyzed by semi-quantitative RT-PCR and quantitative real-time PCR (qRT-PCR) respectively. [Result] The results showed that the cDNA of TcLBD1 contained a 549 bp open reading frame (ORF) in length which encoded polypeptide of 182 amino acids, and TcLBD6 contained a 687 bp ORF encoding 228 amino acid residues. The molecular weights of TcLBD1 and TcLBD6 encoded protein were 19.97 kDa and 25.13 kDa, respectively. The sequences analysis showed that the amino acid sequences of TcLBD1 and TcLBD6 contained one specific conserved LOB motifs in N-terminal and were classified into class Ⅰ of LBD transcription factors, both of them shared 55.2% and 57.9% sequence similarity in nucleotide and amino acid, respectively, and had high identity with each other in secondary structure of protein. Phylogenetic tree analysis suggested that TcLBD1 could be clustered together with protein (ABK21479) of Picea sitchensis and they are closest in genetic relationship, TcLBD6 could be clustered with protein ASYMMETRIC LEAVES2/LBD6 of Arabidopsis thaliana. The analysis of tissues expression patterns showed that the transcript abundance of TcLBD1 was higher in stems and xylem with cambium than that in roots, leaves, phloem with cambium; while TcLBD6 was mainly expressed in roots and stems. Through analysis of the expression patterns in regeneration tissues after bark girdling, the mRNA expressions of TcLBD1 appeared sharply expression after 6 days bark girdling and showed a continuously upregulated pattern, that of TcLBD6 were found to increase notably after 18 days and show a rising trend in the following periods.[Conclusion] Three TcLBDs genes were cloned from T. chinensis, and their expressions were regulated in regeneration processes after bark girdling. Our results demonstrated that TcLBD1 and TcLBD6 might play a regulatory role in bark regeneration after bark girdling in T. chinensis.
Key words: Taxus chinensis    LBD    transcription factor    bioinformatics analysis    gene expression    

LBD(LATERAL ORGAN BOUNDARIES DOMAIN)/ASL(ASYMMETRIC LEAVES 2-Like)蛋白是植物特有的一个家族的转录因子,在植物侧生器官原基中特异性表达(Husbands et al.,2007; Lee et al.,2009Majer et al.,2011)。Shuai等(2002)通过增强子陷阱的方法,首先在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中鉴别出1个在侧生器官基部特异表达的基因,命名为LOB基因。ASLLBD基因含有相近的LOB结构域,因此将含有该保守结构域的基因称为LBD。LOB结构域跨越100个氨基酸左右的长度,最显著的是包含CX2CX6CX3C保守结构域的22个氨基酸组成的1个类似于锌指的基序、1个保守的甘氨酸残基(G)和1个类似亮氨酸拉链(LX6LX3LX6L)的基序。根据LOB结构域中亮氨酸拉链类似基序的存在与否可以将LBD基因归为2类: 含有亮氨酸拉链类似基序的一类是第1类(Class I); 而缺失该基序的是第2类(Class Ⅱ)(Shuai et al.,2002; Iwakawa et al.,2002; Majer et al.,2011)。自从第1个LBD蛋白结构被解析以来,目前已在拟南芥(Iwakawa et al.,2002; Shuai et al.,2002)、水稻(Oryza sativa)(Yang et al.,2006)、玉米(Zea mays)(Schnable et al.,2009)、番茄(Solanum lycopersicum)(王小非等,2013)和杨树(Populus)(Zhu et al.,2007)等植物中分别发现43,35,43,46和57个具有LOB结构域的LBD蛋白。

在植物生长过程中,有些LBD基因在全生育期或在所有取样的器官中均有表达,而部分LBD基因仅在特定组织或特定生育阶段表达,显示典型的时空特异表达的特点,揭示出LBD基因功能的多样性(Shuai et al.,2002; Yang et al.,2006)。此外,许多LBD基因在植物侧生器官近轴面表达,它们在侧生器官发育中发挥了关键作用(Majer et al.,2011; Shuai et al.,2002)。LBD基因对植物的影响包括愈伤组织分化,叶片、花序、根的形成以及茎部次生生长等方面。在拟南芥中,异位表达LBD转录因子(LBD16LBD17LBD18LBD29)在没有外源植物激素下足以引发其自发形成愈伤组织,可见LBD转录因子在愈伤组织诱导过程中起着关键的调控作用(Fan et al.,2012)。AS2/LBD6BOP(BLADE-ON-PETIOLE1)诱导(Jun et al.,2010),并通过与1个MYB转录因子AS1共同作用来调控叶极性的建立(Byrne et al.,2000Semiarti et al.,2001; Iwakawa et al.,2007)。LBD18直接结合到细胞壁松弛因子EXP14的启动子区促进侧根发育(Lee et al.,2013)。LBD29在水稻、玉米中的同源基因CRL1(ARL1)和Rtcs分别调控各自根冠的发育(Hetz et al.,1996; Inukai et al.,2005; Liu et al.,2005; Taramino et al.,2007)。ASL1(LBD36)的过表达抑制 KNAT1基因的过量表达,引起花和角果下垂的表型(Chalfun-Junior et al.,2005; Nakazawa et al., 2003)。水稻的部分LBD基因可以控制颖壳的发育和花序的长短(Li et al.,2008; 卢寰等,2013)。在杨树(Populus tremula×P.alba)中,PtaLBD1参与杨树木材次生生长的调控,该转录因子可以显著促进韧皮部的分化和发育(Yordanova et al.,2010)。尽管对LBD基因的研究有了重大进展,但这些功能研究大多局限于拟南芥、水稻、杨树等模式植物中,而红豆杉LBD基因尚未有文献报道。

红豆杉属(Taxus)植物为多年生乔木或大型灌木,生长缓慢,仅为一般针叶树生长速度的1/10。紫杉醇(taxol)是从红豆杉属树皮中分离提取到的天然抗肿瘤物质,是迄今为止最具抗癌活性的天然化合物之一(Wani et al.,1971; Goodman,2001)。Strobel等(1992)利用放射性同位素14C标记的乙酸盐为底物的方法证明短叶红豆杉(Taxus brevifolia)韧皮部合成紫杉醇的能力很强。韧皮组织对树皮的形成也至关重要,例如在树木热绝缘性、存储、水损失预防和害虫的保护上有重要功能(van Bel,2003); 此外,通过韧皮部组织还可以向不断增长的木质部提供光合同化物、营养、水和信号分子。大面积剥皮后次生维管组织再生的最佳条件最先在杜仲(Eucommia ulmoides)上建立(Li et al.,1981),利用该试验系统,已从转录组水平、功能基因组水平和蛋白质组水平系统研究维管形成层发生和分化及韧皮部、木质部形成相关的基因,探讨木本植物的次生维管组织形成的分子机制(Wang et al.,2009Pang et al.,2008Zhang et al.,2011),但红豆杉属的剥皮再生及其分子机制的研究还未见报道。本研究基于课题组前期利用高通量测序技术(Illumina HiSeqTM 2000)对红豆杉(T.chinensis)的剥皮再生组织进行的转录组测序的数据,分析筛选得到了红豆杉TcLBDs片段序列,并克隆了其中2个LBD cDNA片段,进而对其进行生物信息学分析,也研究了TcLBDs基因的组织表达特异性及在红豆杉剥皮再生过程中的表达特性,以期为研究LBD基因在红豆杉次生生长中的功能提供有用信息。

1 材料与方法 1.1 植物材料

所采用的红豆杉为湖北省襄阳市林业科学研究所提供的10年生实生苗和中国林业科学研究院温室栽种的3年生苗。

1.2 试验方法

1)红豆杉剥皮再生材料与其不同组织材料的采集 在湖北襄阳于2013年6月初选取生长良好、干形均匀的红豆杉进行剥皮处理,此时其形成层活动正处旺盛期。按照Li等(1981)的方法进行剥皮试验,稍作改动。对选取的红豆杉从其基部距地面约40 cm处开始,一直向上环剥约25 cm,分别用无菌处理的刀片轻轻刮取暴露在外树干的材料,做好标记,迅速投入液氮中,为剥皮当天的材料,即第0天。剥皮后将树用消毒的塑料薄膜包裹好。剥皮后第6天,选择第0 天未取过样的树,揭开塑料薄膜,刮取树干上的材料做好标记立即投入液氮中,重新包裹好树干。剥皮后第12,18,24,30,36天参照第6天的方法分别取样,共处理了试验材料15株。同时采集3年生红豆杉的根、茎、叶、包含形成层的韧皮部和包含形成层的木质部的组织用于组织表达分析。

2)红豆杉总RNA的提取及TcLBDs基因的克隆 采集的3年生红豆杉的根、茎、叶、包含形成层的韧皮部、包含形成层的木质部和红豆杉剥皮再生不同时期的组织总RNA提取采用EASYpin Plus植物RNA快速提取试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司)。利用天根生化科技有限公司反转录试剂盒TIANScript RT Kit合成cDNA,用于RT-PCR和qRT-PCR分析。将红豆杉的树皮提取的RNA按照PrimeScriptTMⅡ1st Str and cDNA Sythesis Kit(TakaRa)说明书进行反转录合成单链cDNA,用于基因克隆。 以杨树中Yordanova等(2010)已发表的PtaLBD1(登录号HQ284166)为query,进行本地化Blast工作,搜索课题组前期测序的红豆杉剥皮再生组织转录组数据,筛选得到一致性为67.86%和58.33% 的2条序列,分析发现这2条序列均具有完整开放阅读框(ORF)。根据这2条序列信息,分别在其开放阅读框上、下游设计特异性引物(表 1),采用PrimeSTAR® Max DNA Polymerase mix扩增cDNA 序列(TakaRa)。将获得的PCR产物连接于pEASY- T1 载体上,并利用ABI 3730进行测序(中美泰和生物技术有限公司,北京)。

表 1 试验所用引物 Tab.1 The primer sequences

3)TcLBDs基因的生物信息学分析 利用ExPaSy,ProtScale,SOPMA和Swiss-model等生物信息学软件对TcLBDs的理化性质、结构域及其高级结构进行预测与分析,网址见表 2; 多序列比对使用Clustalx 1.83软件; 用MEGA 4.0软件构建进化树,采用邻接算法(neighbor joining,NJ),bootstrap 检测设置重复为1 000次。

表 2 试验所用生物信息在线分析软件 Tab.2 The online softwares of informatics analysis

4)TcLBDs基因的表达分析 采用 RT-PCR分析TcLBDs基因在正常生长的红豆杉不同组织间的表达模式,以 Tcactin 为内参基因,引物序列见表 1。采用 qRT-PCR 检测剥皮后不同时期组织这2个基因的表达水平,具体操作步骤按SYBR FAST qPCR Kit Master Mix(2×)Universal(KAPA,美国)说明书进行。以灭菌双蒸水为模板作为空白对照,在ABI7500仪器(ABI,美国)上进行。目的基因相对表达水平采用2-△△CT 方法(Livak et al.,2001),所有反应均为2次生物学重复,3次技术性重复。

2 结果与分析 2.1 基因克隆

利用生物信息学分析筛查红豆杉的剥皮再生组织转录组数据库获得了2个LBD电子序列。经NCBI的BLASTx 比对及ORF Finder(open reading frame finder)分析显示,二者均具有完整的开放阅读框,并与其他植物中的LBD 具有较高相似性,推测为全长编码序列。利用RT-PCR 方法对二者进行扩增,PCR产物经过1.0%的琼脂糖电泳之后,检测到1条650 bp左右的条带和1条1 000 bp左右的条带。测序结果表明前者cDNA包含 549 bp开放阅读框(ORF),编码182个氨基酸; 后者cDNA包含 687 bp开放阅读框,编码228个氨基酸。序列结果与转录组电子序列基本一致。在NCBI中BlaxtP结果显示,前者与拟南芥LBD1(登录号: NP_172268)具有62%的一致性,后者与拟南芥的LBD6/AS2(登录号: NP_176739)具有76%的一致性,因此将2个基因分别命名为TcLBD1TcLBD6

2.2 TcLBDs蛋白质的理化性质及结构预测分析

运用ExPaSy-Protparam工具对TcLBD1TcLBD6编码蛋白的理化性质进行了预测,其相对分子量分别为19.97,25.13 kDa,理论等电点pI分别为7.74,6.22。蛋白的分子式预测分别为C867H1374N250O266S13,C1109H1721N323O327S10,其中TcLBD1带正电残基(Arg + Lys)19个,带负电残基(Asp+Glu)22个; 而 TcLBD1带正电残基和负电残基分别为22和21个。

蛋白质二级结构指它的多肽链借助氢键排列成特有的折叠或者盘绕方式。根据SOPMA预测的蛋白质二级结构分析发现,TcLBDs蛋白的氨基酸主要由α-螺旋(alpha helix)、无规则卷曲(r and om coil)和延伸链(extended str and )和β转角(beta turn)4种形式组成,在TcLBD1 中分别占50.01%,39.01%,6.0%和3.85%; 在TcLBD6中分别占36.40%,46.93%,11.84%和4.82%。这与其他LOB-Domain基因表达产物二级结构的螺旋结构分布一致(Shuai et al.,2002)。由于 TcLBD6比 TcLBD1多了46个氨基酸,且二级结构相似性较高,因此以TcLBD6为例,用 SWISS-MODEL模拟其三维结构(图 1)。三维模型中用于该模型的氨基酸残基范围为88—208位,该模型以3n4x.2.A蛋白为模板,序列同源性为26.00%,可以看到1个大的螺旋卷曲(coiled coil motif)结构。

图 1 TcLBD6蛋白三维结构分析 Fig. 1 Tertiary structure of TcLBD6
2.3 TcLBDs蛋白序列保守型分析以及进化树分析

根据 NCBI 的比对和注释结果,发现TcLBD1在北美云杉(Picea sitchensis)、 欧洲山杨 × 银白杨(Populus tremula × Populus alba)、毛果杨(Populus trichocarpa)、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)、可可(Theobroma cacao)和拟南芥等植物体内中存在同源基因; TcLBD6在可可、毛果杨、蒺藜苜蓿和拟南芥等物种中存在同源基因(表 3)。通过对TcLBD1和TcLBD6与上述物种的LBD蛋白进行多序列比对(图 2)发现,它们与拟南芥等其他植物的LBD家族的转录因子一样在N端存在着明显的保守区域: CX2CX6CX3C基序、1个保守的甘氨酸残基(Gly)和1个类似亮氨酸拉链(LX6LX3LX6L)的基序。其中CX2CX6CX3C基序对于结合DNA是必需的; 亮氨酸“螺旋卷曲”二级结构可能与蛋白二聚化有关,负责和其他蛋白相互作用(Iwakawa et al.,2002; Shuai et al.,2002; Majer et al.,2011; Matsumura et al.,2009)。利用在线工具Scanprosite Search 对TcLBDs进行保守结构域的分析,结果(图 3)所示,TcLBDs保守结构域有高度保守的大约100个氨基酸残基组成,构成了LBD类转录因子特有的LOB结构域。参照拟南芥LBD分类研究结果,TcLBD1和TcLBD6均属于第1类(ClassⅠ)。

表 3 TcLBD1TcLBD6的同源基因 Tab.3 Homological genes of TcLBD1 and TcLBD6
图 2 TcLBDs与其他植物同源蛋白的氨基酸多序列比对 Fig. 2 Multiple alignment result of TcLBDs and homological proteins of other plants
图 3 TcLBDs保守结构域分析 Fig. 3 Conserved domains search of TcLBDs

为进一步分析红豆杉2个LBD蛋白与其他物种LBD蛋白的进化关系,利用MEGA 4.0软件构建了系统进化树(图 4)。结果表明,尽管TcLBD1和TcLBD6均属于LBD家族的ClassⅠ类群,然而系统进化树却明显将这2个蛋白分在2个类群: TcLBD1与北美云杉的未知功能蛋白最先聚合,接着与拟南芥LBD1(NP_172268)聚合; TcLBD6与拟南芥的LBD6/AS2(NP_176739)蛋白氨基酸序列相似性最高,聚为一簇。

图 4 TcLBDs与其他植物同源氨基酸的系统进化树 Fig. 4 Phylogenetic tree of TcLBDs and homological amino acids in other plants
2.4 TcLBDs基因组织表达分析

采用半定量RT-PCR技术检测2个TcLBDs基因在红豆杉不同组织中的表达情况,结果如图 5所示,2个基因的表达具有明显的组织特异性,它们在正常条件下的红豆杉的茎中均有表达。TcLBD1在木质部(含形成层)中表达量最高,而且茎和木质部(含形成层)中表达量明显高于在根、韧皮部(含形成层)和叶片中的表达量;TcLBD6在根中表达量最高,其次是茎,在叶片中表达量最低。

图 5 TcLBDs基因的组织表达 Fig. 5 The tissue expression of TcLBDs in T. chinensis 1. 根; 2. 茎; 3. 叶; 4. 韧皮部(含形成层); 5. 木质部(含形成层)。
1. Roots; 2. Stems; 3. Leaves; 4. Phloem with cambium; 5. Xylem with cambium.
2.5 TcLBDs基因在红豆杉剥皮再生中的表达模式分析

利用qRT-PCR方法研究TcLBDs基因在红豆杉剥皮再生过程中的表达模式。对红豆杉剥皮后0,6,12,18,24,30,36天再生组织中表达情况进行分析。结果(图 6)表明在上述再生组织中TcLBDs基因表达水平均上调表达。TcLBD1在6天时基因表达量达到最高,大约为对照的40倍,随后减少到对照的5倍左右; TcLBD6表达量在18 天后急剧上升,在36天时达到最高,是对照的14倍左右。

图 6 TcLBDs基因在红豆杉剥皮再生过程中的表达 Fig. 6 Expression of TcLBDs in regeneration after bark girdling in T. chinensis
3 结论与讨论

本研究成功克隆获得了2个红豆杉LBD基因,并对其编码蛋白的氨基酸结构进行生物信息学分析。结果表明TcLBDs氨基酸序列均具有其他植物如杨树和拟南芥等中报道的LOB结构域,并属于LBD家族的ClassⅠ类群。通过同源比对和进化树等分析表明,TcLBDs与其他植物LBD蛋白氨基酸序列相似性较高,因此命名为LBD基因。LBD家族Ⅰ类成员在植物中细分为不同的亚类,不同亚类具有部分特异氨基酸序列,如拟南芥、番茄和水稻的Ⅰ类基因分别被分为2,4,5 个亚类(Iwakawa et al.,2002;Yang et al.,2006; 王小非等,2013)。因此推测红豆杉的TcLBD1TcLBD6可能分别属于不同的亚类。进化树分析TcLBD1与北美云杉的登录号ABK23871的蛋白聚为一簇,亲缘关系最近。推测是由于红豆杉与北美云杉均为松杉纲(Coniferopsida)植物,在进化上有亲缘关系。北美云杉的ABK23871蛋白是否同样为LBD转录因子有待于今后进一步研究。

LBD家族成员之一的AS2/LBD6调节拟南芥叶片木质部和韧皮部的特异化(Lin et al.,2003; Xu et al.,2003; Zhu et al.,2008),过量表达AS2/LBD6形成木质部包围韧皮部组织的近轴面维管束,也有可能是通过KANADI1基因的反向调控(Lin et al.,2003; Xu et al.,2003; 2008; Wu et al.,2008)。研究显示AS2/LBD6也调控着木质部特异化方面有着重要作用的miR165/miR166的表达(Ueno et al.,2007; Demura et al.,2007)。采用激活标记技术得到了杨树PtaLBD1突变体,其表型为次生韧皮部增厚,同时检测到APL基因表达水平处于上调趋势,推测 PtaLBD1可能参与直接激活APL基因的表达; PtaLBD1基因过量表达后杨树韧皮部的厚度显著增加,正向调控着射线细胞的起始和增值; 而通过抑制PtaLBD1表达,则减少了杨树直径增长和高度不规则的韧皮部的发育(Yordanova et al.,2010)。在本研究中,TcLBDs基因主要表达在正在生长的茎中,尤其TcLBD1在木质部(含形成层)表达量较高,这暗示TcLBDs基因可能参与维管组织的生长发育。在红豆杉剥皮再生过程中TcLBD6尤其18天时显著上升、在36天时达到最高。红豆杉剥皮再生组织解剖结构观察显示,在18天时出现不连续的扁平状的分生组织细胞; 30天时形成层样区域已出现,分别向内分化形成木质部和向外形成韧皮部。这些表明TcLBD6可能参与调控红豆杉次生生长——侧生器官高度特异化的发育过程。

类似于拟南芥,愈伤组织诱导培养基(CIM)含有大量生长素被用于其他植物体外系统培养,生长素对愈伤细胞的诱导至关重要(Skoog et al.,1957; Gordon et al.,2007),在CIM培养基异位诱导的 LBD16LBD17LBD18LBD29却在arf7 arf19双突变体中大幅减弱甚至不表达,这进一步说明了部分LBD基因是直接作用愈伤组织形成的ARFs(auxin response factors)的下游基因(Fan et al.,2012)。过表达拟南芥AS2/LBD6或杨树LBD1显示略有增加愈伤组织细胞的表型(Iwakawa et al.,2002; Lee et al.,2009)。本研究的TcLBD1在红豆杉剥皮再生过程中的表达量均呈现上调表达,尤其在6天时表达量达到最高; 且在红豆杉剥皮再生6天时出现了大量愈伤组织细胞,而后愈伤细胞一直存在。这些暗示TcLBD1可能直接或间接参与了植物激素(如生长素或细胞分裂素)信号传导和愈伤细胞的诱导过程。

本研究获得了红豆杉2个TcLBDs基因,为进一步研究LBD基因对红豆杉侧生器官边界的建成的作用打下了基础。作者课题组正在通过转基因手段在拟南芥中对上述基因做进一步的分析,以验证它们的功能和调控机制。

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