乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase，ACE)在生物神经传导中具有关键性作用，可降解乙酰胆碱，终止神经传递对突触后膜兴奋的刺激作用，确保神经信号正常传递，是有机磷(organophosphates)和氨基甲酸酯(carbamates)类杀虫剂的作用靶标。目前，已克隆到秀丽线虫(Caenorhabditis elegans)(Martine et al.，1994)和甘薯茎线虫(Ditylenchus destructor)(丁中等，2010；2008a；2008b)等多种线虫的ACE基因。秀丽线虫的ACE编码基因有 CeACE1，CeACE2，CeACE3和CeACE4。ACE1是有机磷类和氨基甲酸酯类化合物的作用靶标。ACEl和ACE2的主要区别在于ACEl中缺少一个含有31个氨基酸的“亲水肽片段”(Arpagaus et al.，1994)，但ACEl和ACE2在功能上可相互补偿。已报道的松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)ACE基因有BxACE1，BxACE2和BxACE3(Jae et al.，2011)，并有应用有机磷类和氨基甲酸酯类ACE抑制剂(acetylcholinesterase inhibitors，ACEIs)防治松材线虫的相关研究(Jae et al.，2012)。本研究在此基础上开发植物源ACE抑制剂用于松材线虫防治，可以避免有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂引起的环境污染以及害虫抗药性等问题。

目前阻断ACE基因功能的技术有2种：一种是RNA干扰(RNAi)技术，即通过dsRNA介导的基因沉默阻断ACE基因在线虫体内的表达；另一种是通过ACEIs抑制ACE蛋白功能，同样可以达到阻断ACE基因功能的目的。RNAi技术简单易行，只要已知基因序列即可合成相应的dsRNA，通过浸泡或注射等技术将dsRNA导入线虫体内即可介导相应基因沉默；但由于dsRNA容易降解，因此该技术更适用于实验室内验证基因功能等试验。若应用于生产实践，采用ACEIs与植物源药剂同时施用的技术则更具优势。通过ACEIs抑制ACE蛋白功能，又有2种方法：一种是应用有机磷类或氨基甲酸酯类ACEIs，另一种是应用非共价结合的植物源ACEIs。非共价结合的ACEIs可以减少对人和动物的危害，具有良好的发展前景。

苦参碱、α蒎烯等植物源农药具有安全无公害的特性，但杀虫效果不理想。Matsuda等(1989)研究发现苦参碱及其衍生物对松材线虫的杀虫活性很弱。为了有效提高苦参碱的药效，本研究采用RNAi技术研究ACE基因沉默对苦参碱杀虫活性的增效作用，并在此基础之上筛选出更适合推广应用的植物源ACEIs即石杉碱甲。

试验所用松材线虫种群于2007年采集自广东省，寄主为马尾松(Pinus massoniana)。采用贝曼漏斗法分离，在灰葡萄孢(Botrytis cinerea)菌苔上25 ℃避光培养，扩繁线虫。用M9缓冲液(Sulston et al.，1988)清洗线虫(卵: 幼虫: 成虫=1: 2: 3)后液氮研磨，应用TRIzol(Invitrogen，Cat. No. 15596-026)提取线虫总RNA，DNase I(RNase-free)37 ℃处理RNA 20 min，重新抽提后-80 ℃保存，供基因克隆所用。

对本课题组2007年构建的松材线虫cDNA文库EST测序结果(王峰，2008；Wang et al.，2012)进行BLASTN比对，鉴定到ACE基因序列片段，根据该序列设计5′RACE引物(Bx-ACE1-3′ F： 5′-ATC CCG CCA AGA GTT GAG TC -3′)和3′RACE引物(Bx-ACE1-5′ R： 5′-GAG CCA TCA TCC AAA GCG GA -3′)，于2009年采用Clontech公司的Marathon RACE试剂盒(Cat. No. 634913)进行基因全长克隆，PCR产物连接pGEM-T Easy Vector转化到大肠埃希菌(Escherichia coli)DH5α感受态细胞，送上海生工进行DNA测序。

全长基因序列应用ORF-Finder进行开放阅读框分析，翻译氨基酸序列。BLASTX/BLASTP(Stephen et al.，1997)筛选NCBI收录的同源序列，Clustal W进行多序列比对。应用PSIPRED server对BxACE1进行蛋白质二级结构分析。在二级结构分析的基础上，应用SWISS-MODEL对BxACE1进行三维建模。搜索ExPdb 晶体图像数据库中的高相似度同源序列，建立原子模型返回。此返回结果提交“Optimize”模式，进行优化从而产生结构模型，根据结构模型对结果进行评估，并做适当修正(谌容等，2006)。分析该BxACE1的三维结构，进行同源三维结构比对，进一步修正后输出三维立体结构图。

为确保基因沉默的特异性，选取BxACE1序列中GC含量20%~50%、涵盖不同剪接型的区段作为靶序列，并设计引物对(BxACE1-SiF： 5′-AGC CCC AGG GAA TAT GGG AT-3′； BxACE1-SiR： 5′-TGG ATC CGA GGG TTC GTA CT-3′)。应用MEGAscript RNAi试剂盒和T7引物(5′-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GA-3′)进行 体外转录反应生产相对应的ssRNA。正义链与反义链ssRNA，经退火生产dsRNA，酚: 氯仿: 异戊醇(25: 24: 1)抽提纯化，甲醛变性凝胶电泳检测。用2.0 mL离心管分装50 μL M9 缓冲液稀释的3 μg·μL^-1的dsRNA(含有10 mmol·L^-1章鱼胺)，每管加入线虫1 000条，利用线虫RNAi路径中内源核糖核酸内切酶Dicer降解dsRNA为21~23 bp的siRNAs诱导RNAi。避光振荡处理8 h后无菌水清洗(Wang et al.，2012)，以M9缓冲液处理线虫为对照线虫组。

应用Q-PCR技术鉴定RNAi效果，分别提取RNAi处理和对照线虫RNA，DNase I(RNase-free)消化去除基因组DNA残留后，选用特异引物对(BxACE1-QF： 5′-AGC CAT CAT CCA AAG CGG AA -3′； BxACE1-QR： 5′-TCC ACC ATG AAA TCC CCG TC-3′)，采用i^TM5多重实时荧光定量 PCR 仪进行Q-PCR检验基因沉默效果。Actin基因作为内参基因，选用引物对RsACT_F： 5′-GAA AGA GGG CCG GAA GAG-3′和RsACT_R： 5′-AGA TCG TCC GCG ACA TAA AG-3′(Joachim et al.，2007)。采用相对定量法计算3次重复试验初始模板量比值的对数值即log₂(对照线虫/RNAi处理线虫)，通过两配对样本t检验的差异显著性，判断BxACE1基因表达是否受抑制。

用对松材线虫低毒的苦参碱(0.03%)处理RNAi处理线虫或对照线虫(Matsuda et al.，1989)，验证BxACE1基因沉默对苦参碱的增效作用。分别设RNAi组(0.03%苦参碱+RNAi处理线虫)，CK1(苦参碱+对照线虫)，CK2(RNAi处理线虫)和CK3(对照线虫)4个处理组测定存活率，每个处理组90条虫，各重复3次。根据各组线虫存活率以及RNAi组与CK1—CK3组的差异显著性验证BxACE1基因沉默后苦参碱的杀虫效果。

据不同线虫ACE1蛋白质三维结构比对，筛选BxACE1结构保守区。应用Hex 6.3(Macindoe et al.，2010)进行ACE1和候选抑制剂(RS)-(±)-tacrine-hupyridone-(RS)-(±)-3(Haim et al.2005)以及石杉科植物蛇足石杉(Huperzia serrata)提取物石杉碱甲(Huperzine A，C₁₅H₁₈N₂O)(Raves et al.，1997)的Docking分子对接试验，并寻找互作位点以及相关化学键。以石杉碱甲(上海纯优生物公司)1 μmol·L^-1溶液处理线虫。分别设InhibitoR0.03%苦参碱+1 μmol·L^-1石杉碱甲处理线虫)、CK4(1 μmol·L^-1石杉碱甲处理线虫)和CK5(1 μmol·L^-1石杉碱甲+RNAi线虫)对照组测定存活率，每个处理组90条虫，各重复3次。

应用TRIzol提取松材线虫总RNA(图 1中泳道1)，经分光光度计检验OD值(OD₂₆₀/OD₂₈₀=2.0，OD₂₆₀/OD₂₃₀>1.8)符合标准后进行RACE克隆。5′ RACE克隆到序列长度为1 280 bp(图 1中泳道2)，3′ RACE克隆到长度为1 720 bp并含有PolyA的序列(图 1中泳道3)。5′和3′序列拼接得到基因全长2 145 bp，命名为BxACE1。经ORF分析得到BxACE1氨基酸序列含有622个氨基酸，分子质量71.251 19 kD，等电点(Theoretical pI)为5.43。

	图 1 RNA提取及BxACE1基因全长克隆 Fig. 1 RNA extraction and RACE of BxACE1

登录NCBI筛选BxACE1同源序列6条(表 1)，应用Clustal W对同源序列进行多序列比对，构建最大似然树(图 2B)。另登录NCBI下载BxACE1同源序列100条，采用PAUP 4.0和Modetest 3.06，依据AIC(akaike information criterion)选出JTT+G为进化的最适模型，构建最大似然树明显分为3枝(图 2A)，作为外参的旋毛形线虫(Trichinella spiralis)ACE独立成一枝，果蝇、蚂蚁、蛾类和螨虫等节肢动物的ACE聚为一枝，其他线虫ACE聚在一起成为一枝。这表明线虫和节肢动物ACE蛋白的进化速度与物种进化速度一致。线虫ACE间的进化关系如图 2B所示，BxACE1与NCBI注册的松材线虫ACE亲缘关系最近(1 000次重复检验支持率为100%)，表明二蛋白虽然来自不同种群的松材线虫，但ACE蛋白未发生分化。线虫系统进化树分为2枝，第1枝为包括松材线虫ACE在内的植物寄生线虫枝，第2枝则包括动物寄生线虫和自由生活线虫。这表明线虫ACE的进化速度与线虫进化速度一致。

表 1 NCBI登录的ACE同源序列 Tab.1 ACE homologous sequence in NCBI

表 1 NCBI登录的ACE同源序列 Tab.1 ACE homologous sequence in NCBI 物 种Species NCBI序列号NCBI Accession No. 蛋 白Protein E 值E value 丝虫Loa loa EFO24566.2 乙酰胆碱酯酶1 Acetylcholinesterase 1 0 南方根结线虫Meloidogyne incognita AAD02835.1 乙酰胆碱酯酶前体Acetylcholinesterase precursor 0 马铃薯茎线虫Ditylenchus destructor ABQ58117.1 乙酰胆碱酯酶1 Acetylcholinesterase 1 0 爪哇根结线虫Meloidogyne javanica AAD25921.1 乙酰胆碱酯酶Acetylcholinesterase 0 秀丽线虫Caenorhabditis elegans NP_510660.1 乙酰胆碱酯酶Acetylcholinesterase 0 松材线虫Bursaphelenchus xylophilus ACZ64207.1 乙酰胆碱酯酶1 Acetylcholinesterase 1 0

	图 2 BxACE1及其同源序列最大似然树 Fig. 2 The maximum likelihood tree of BxACE1and homologous sequencesA： 100个ACE最大似然树The maximum likelihood tree of 100 ACE； B： 线虫ACE最大似然树The maximum likelihood tree of nematode ACE.

采用浸泡法进行BxACE1基因沉默，并应用Q-PCR技术检验线虫BxACE1基因沉默效果，分别记录3次重复试验中未处理线虫BxACE1基因C_T值(图 3A CK)和Actin对照C_T值(图 3A Actin CK)，RNAi处理线虫BxACE1基因C_T值(图 3A RNAi)和Actin对照C_T值(图 3A Actin RNAi)，采用相对定量法计算得初始模板量比值的对数值为6.81(图 3B)。经两配对样本t检验P=0.00<0.01，差异显著，表明BxACE1基因表达受抑制。

	图 3 Q-PCR检验BxACE1基因沉默 Fig. 3 The RNAi of BxACE1 tested by Q-PCR

蛋白质三维结构分析表明，BxACE1由14个α螺旋包围着13个β折叠(图 4A)。与其他物种ACE结构在α螺旋A13和β折叠B13之间的Loop区存在空间结构差异(图 4B)，此差异未改变酰基口袋的形状，也未改变底物结合的空间(图 4C)，对底物与抑制剂的结合影响很小。BxACE1蛋白催化中心(catalyticactive site，CAS)是位于蛋白质中部由氧阴离子洞和酯水解中心构成的“芳香残基裂隙”，该结构趋于保守，与其他物种ACE相比较，氨基酸序列保守(图 4D)(Sussman，1991)。

图 4 BxACE1蛋白质空间结构及抑制剂结合位点序列比对 Fig. 4 The protein structure of BxACE1 and inhibitor binding site sequences alignmentA： BxACE1蛋白质空间结构：A1—A13为d螺旋，h1—h4为310螺旋，B1—B13为β折叠 The protein structure of BxACE1： A1-A13 show d helix,h1-h4 show 310 helix,B1-B13 show β sheet； B： ACE蛋白质空间结构比对3D structure alignment of ACEs； C： BxACE1蛋白质酰基口袋Acyl pocket of BxACE1； D： ACE抑制剂结合位点序列比对Inhibitor binding site sequences alignment of ACEs.

将BxACE1与抑制剂(RS)-(±)- tacrine-hupyridone-(RS)-(±)-3(Haim et al.，2005)以及石杉碱甲(Raves et al.，1997)进行Docking分子模拟对接试验表明结果BxACE1可以与这2种抑制剂结合(图 5A，C)，但BxACE1与抑制剂(RS)-(±)- tacrine-hupyridone-(RS)-(±)-3只形成一个氢键(图 5B)，而BxACE1与抑制剂石杉碱甲形成5个氢键(图 5D)形成稳定的异质性结合。鉴于氢键数量越多结合越稳定，故此选择石杉碱甲作为候选抑制剂。

图 5 BxACE1与抑制剂Docking分子对接 Fig. 5 Docking of BxACE1 and inhibitorsA： BxACE1与(RS)-(±)- tacrine-hupyridone-(RS)-(±)-3分子对接Docking of BxACE1 and(RS)-(±)- tacrine-hupyridone-(RS)-(±)-3; B： BxACE1与(RS)-(±)-tacrine-hupyridone-(RS)-(±)-3之间的氢键,Y88为第88位络氨酸 Hydrogen bond between BxACE1 and (RS)-(±)- tacrine-hupyridone-(RS)-(±)-3, Y88 show the 88 tyrosine; C： BxACE1与石杉碱甲分子对接Docking of BxACE1 and huperzine A； D： BxACE1与石杉碱甲之间的氢键, W137,S138,Y146,E214分别表示第137位色氨酸，第138位丝氨酸，第146位络氨酸，第214位谷氨酸 Hydrogen bond between BxACE1 and huperzine A，W137,S138,Y146,E214 show the 137 tryptophan,the 138 serine, the 146 tyrosine, the 214 glutamic acid.

基因沉默处理后，连续观察72 h，RNAi处理组线虫从6 h开始迅速死亡，线虫存活率迅速下降(图 6)。CK1处理组线虫存活率下降，表明苦参碱具有一定的杀虫效果，但杀虫效果不明显。CK2处理组线虫与CK3处理组线虫均未发生大量死亡。RNAi处理组线虫与CK1处理组线虫在24，48及72 h存活率差异显著。研究结果表明：CK2处理组虽然在72 h内BxACE1基因表达受抑制，但线虫体内的胆碱积累水平不足以致其中毒死亡，但RNAi明显增加了苦参碱的杀虫效果。

CK4处理组自24 h开始出现少量线虫死亡，72 h后存活率稍下降(图 6)，表明石杉碱甲本身对线虫毒性较小，72 h内BxACE1活性受抑制，但线虫体内的胆碱积累水平不足以致使大量线虫中毒死亡。Inhibitor处理组线虫从6 h开始迅速死亡(图 6)，24 h线虫存活率迅速下降。CK5处理组线虫存活率自24 h始稍下降，但与CK2组与CK4组均无显著差异，表明共同施用RNAi和石杉碱甲对线虫毒性仍然较小。RNAi处理组线虫与Inhibitor处理组线虫在24，48及72 h存活率差异不显著，表明石杉碱甲处理线虫和BxACE1基因RNAi处理效果相近。

	图 6 BxACE1基因RNAi及抑制剂石杉碱甲对苦参碱杀虫效果辅助作用鉴定 Fig. 6 Identification of RNAi and inhibitor

本研究克隆到松材线虫乙酰胆碱酯酶基因BxACE1，发现施用苦参碱同时阻断BxACE1基因功能可得到良好的杀虫效果。虽然RNAi技术能够简单易行地证明若阻断BxACE1基因功能可以提苦参碱的杀虫效果，但dsRNA容易降解等因素限制了该技术在生产实践中的广泛应用。为克服这一限制因素，本研究进一步通过ACFIs阻断BxACE1基因功能，进而达到提高苦参碱等植物源药剂杀虫效果的目的。基于分子对接技术的抑制剂辅助筛选表明石杉碱甲可以与BxACE1稳定结合。抑制剂抑制效果鉴定表明，石杉碱甲可以提高苦参碱的杀虫效果，具有生防药剂辅剂的开发潜力。

ACEIs通过对ACE的抑制，使得乙酰胆碱在神经突触的间隙中累积，从而使得乙酰胆碱的作用时间变长。ACEIs通过抑制线虫体内的乙酰胆碱酯酶的活性，使线虫体内的胆碱水平短时间内大幅提高，从而导致其中毒死亡。该类具有代表性的杀虫剂是有机磷类化合物和氨基甲酸酯类化合物，大多为非可逆型ACEIs。近年出现的非共价结合的ACEIs虽未广泛应用，因对人和动物的危害小而具有广阔的开发前景。石杉碱甲是来源于石杉科植物蛇足石杉的一种半萜生物碱，是一种高效、高选择性、可逆性的ACEIs。本研究将石杉碱甲引入松材线虫研究，是对该植物源药剂的一个新尝试。