马尾松(Pinus massaniana)是我国南方地区的主要造林树种(阎传海等，1995)。土壤磷素供应不足是目前马尾松林衰退现象较严重的原因之一。自然条件下，绝大部分土壤中磷源丰富，但土壤中90%以上都为无效磷，其转化成植物可以吸收利用的有效磷的速度很慢，难以满足林木生长需要。解磷微生物可以将土壤中难溶性磷转化成植物能够吸收利用的可溶性磷。解磷微生物种类繁多，有解磷细菌、解磷真菌和解磷放线菌等(杨慧，2008)。目前的研究主要集中在解磷细菌。Hussain等(2013)发现解磷伯克霍尔德氏菌(Burkholderai sp.)PS-01具有较好的解磷能力，可促进玉米(Zea mays)根质量增加。Zhao等(2014)发现解磷芽孢杆菌(Bacillus sp.)DZ-18对杨树根部具有良好促生作用。解磷真菌数量和种类都少于解磷细菌，但解磷真菌的溶磷能力较强，甚至是细菌的几十倍，且遗传性状更加稳定，不易因连续培养而降低或丧失解磷能力(赵小蓉等，2002)。解磷真菌马昆德拟青霉(Paecilomyces marqu and ii)AA1在不同培养条件下均有解磷能力(Ahuja et al.，2007)。李剑峰等(2010)发现霉菌及酵母对难溶性磷酸盐具有较好的溶解能力。近年来对解磷真菌研究较少，尤其是林地生态系统解磷真菌研究更少(Barroso et al.，2005；陈俊等，2009；朱颖等，2006)。因此，从林地根际土壤中筛选高效解磷真菌并研制成生物肥料，是解决林地磷素供应不足的一条有效途径。本研究从江苏和安徽马尾松林根际土壤中分离、筛选高效解磷真菌，并探讨其对马尾松的促生效应，为今后开发和利用高效的解磷生物菌肥及改善马尾松林地土壤的微生态环境提供参考依据。

分别从安徽黄山、南京紫金山、江苏省林业科学研究院和南京林业大学后山选取马尾松人工林进行采样(表 1)。

表 1 采样地点信息 Tab. 1 Information of sampling sit

表 1 采样地点信息 Tab. 1 Information of sampling sit 编号No. 采样点 Sampling site 土壤类型 Soil type 采样日期 Sampling date 1 安徽黄山 Huangshan Mountain Anhui Province 黄壤 Yellow soil 2011-02-21 2 南京紫金山 Zijinshan， Nanjing 石灰岩土 Limestone soil 2011-03-15 3 南京林业大学后山 Nanjing Forestry University 黄棕壤 Yellow brown soil 2011-04-12 4 江苏省林业 科学研究院 Academy of Forestry， Jiangsu Province 黄壤 Yellow soil 2011-09-05

无机磷培养基(NBRIP培养基)(Shekhar，1999)：葡萄糖10 g，(NH₄)₂SO₄ 0.1 g，MgSO₄·7H₂O 0.25 g，MgCl₂·6H₂O 5.0 g，Ca₃(PO₄)₂ 5.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH 6.8~7.2。

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基)(杜秉海，1994)：马铃薯200 g，蔗糖20 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL，自然pH值。

CYA固体培养基(孔华忠，2007)： K₂HPO₄ 1 g，查氏浓缩液10 mL，酵母抽提物5 g，蔗糖30 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL。

采用三点取样法分别采集上述各取样点马尾松根际土壤。采样时，在马尾松树体根部方圆半米内，选取采土点，铲去表层土后深挖20~30 cm，以保证样本中包含较多的根际微生物。将马尾松根系上一些毛细根和黏附其上的土壤一起装入无菌袋中，注明采集地点、日期、土样号，取回，置于4 ℃冰箱保存。

称取10.0 g马尾松根际土壤，放入装有90 mL无菌水的250 mL锥形瓶中，室温下180 r·min^-1振荡30 min，静置10 min后，将上清液梯度稀释至10^-4，10^-5和10^-6，分别取100 μL涂布于无机磷培养基平板(NBRIP培养基)上，重复3次，25 ℃培养7~10天。挑取平板上具有明显溶磷圈且长势良好的真菌菌落进行纯化并计算分离率，后转至马铃薯培养基(PDA)斜面培养7~10天，置4 ℃冰箱保存。

分离率(%)=目标解磷真菌数/分离出解磷真菌总数×100。

将上述分离得到的真菌分别接种到NBRIP平板上，25 ℃培养7~10天，测定菌落直径(D)和溶菌圈直径(d)，计算比值(d/D)。按表 2对真菌解磷能力进行初步分级。一般比值越大，说明真菌的解磷能力越强。比值>1时，解磷真菌解磷能力最强，比值为0.5~1时解磷能力较强，比值 < 0.5时则解磷能力较弱。本试验选择溶磷圈相对大而透明且比值> 0.5的菌株进行保存，置于4 ℃冰箱保存。

表 2 马尾松根际解磷真菌分离情况 Tab. 2 Isolation ratio of phosphate-solubilizing fungi from P. massoniana rhizosphere

表 2 马尾松根际解磷真菌分离情况 Tab. 2 Isolation ratio of phosphate-solubilizing fungi from P. massoniana rhizosphere 编号 No. 采样点 Sampling site 采样数 Samples 真菌数 Fungi number d/D>0.5 真菌数 Fungi number 分离率 Separation rate (%) 1 安徽黄山 Huangshan Mountain, Anhui Province 3 6 — — 2 南京紫金山 Zijinshan， Nanjing 3 6 — — 3 南京林业大学后山 Nanjing Forestry University 3 15 12 80 4 江苏省林业科学研究院 Academy of Forestry，Jiangsu Province 3 18 14 77．8 总计 Total — 12 45 26 57.8

将上述初筛得到的菌株接种到PDA平板上活化培养7天，以无菌操作取6个直径6 mm菌块接种至50 mL NBRIP液体培养基中，以未接菌的空白NBRIP培养基为对照(CK)，每个待测菌株设3次重复，25 ℃，200 r·min^-1振荡培养7天，过滤发酵液后采用钼锑抗比色法测上清有效磷含量，用UV-160PC紫外-可见光分光光度计在720 nm处比色并测定OD值(鲁如坤，1998)。计算上清液有效磷含量和解磷率(刘辉等，2010)。

解磷率(%)=(接菌可溶性磷含量-对照可溶性磷含量)/加入无机磷源的量×100。

在CYA培养基上接种从马尾松根际土壤筛选分离获得的高效解磷真菌，25 ℃培养1~2周，观察并记录菌落、菌丝、孢子以及生理生化等特征(贺运春，2008；孔华忠，2007；齐祖同，1997；陆家云，2001；姚粟等，2006；崔丽霞等，2007)，对解磷真菌菌株进行初步鉴定。

采用CTAB法提取待测菌株DNA。将适量菌体采用液氮研磨至粉末状，加入800 μL已65 ℃预热的CTAB和200 μL DTT，65 ℃水浴45 min；常温下12 000 r·min^-1离心15 min，吸取上清液，加入等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)并振荡，常温下12 000 r·min^-1，15 min离心；吸取上清液，加入等体积氯仿:异戊醇(24 :1)并振荡，常温下12 000 r·min^-1离心15 min；吸取上清液，加入1/10体积的醋酸钠和2倍体积-20 ℃预冷的无水乙醇，-20 ℃沉淀过夜；12 000 r·min^-1离心15 min后弃上清液，加入70%的乙醇洗涤沉淀3次；真空干燥洗涤10 min；风干后溶解于50 μL 1×ddH₂O，-20 ℃冻存。

选取通用引物ITS1(TCCGTAGGTGAA CTGCGC)和ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)(上海美吉测序公司合成)对供试菌株进行扩增。

取8 μL PCR扩增产物在含有EB的1.0%的琼脂糖凝胶上电泳，电泳后利用凝胶成像系统在紫外灯下观察结果。将PCR产物在自动测序仪上进行序列反应测序(北京六合华大基因科技公司)。

马尾松种子采自广州。用1%高锰酸钾溶液浸泡种子1 h，再用自来水冲洗12 h。浸种后将种子用纱布包好，并保持湿润，置于20 ℃条件下1天左右进行催芽。育苗用土取自南京林业大学后山的黄棕壤，置于营养钵内。土壤高温灭菌(121 ℃，2 h)后将已开始萌发的马尾松种子撒在土壤表面，用厚约1~2 cm的灭菌(121 ℃，2 h)细沙覆盖，25 ℃培养。待苗高至6~8 cm左右后连土移栽，装土量约为盆容积2/3，每盆1株。置室温20 ℃下进行培养，保持良好的光照和水分条件，待后期接菌。

将供试菌株于马铃薯葡萄糖液体培养基中25 ℃振荡培养7天。发酵液离心5 min(4 ℃，6 000 r·min^-1)，菌丝体用磁力搅拌器打碎后，作浓度梯度稀释，在显微镜下对菌丝片段计数，并用无菌生理盐水调节菌丝片段悬液(7×10^-8~8×10⁸ cfu·mL^-1)制成菌剂。离心后的上清液收集到无菌三角瓶中待用。接种试验分为4种处理，每种处理10株马尾松苗，各施入15 mL对应处理物：A为菌丝片段悬液，B为供试菌株发酵液，C为空白的马铃薯葡萄糖液体培养基(PD)，D为无菌生理盐水(CK)。每个处理20次重复，接种后的松苗置于温室(20 ℃)统一管理，适时浇水。接种处理的马尾松苗生长150天后，测定植株苗高、地径、植株鲜质量和根质量等指标，并计算平均值。

运用Microsoft Excel2003和Spss18.0软件做统计分析，数据以mean±SD表示。将测序得到的序列与BLAST数据库进行同源性分析，用MEGA(4.0)程序包中的Neighbor-Joining法构建系统进化树。

解磷真菌在NBRIP培养基上生长时大多会产生透明溶磷圈，从供试土样中共分离45株具有溶磷圈的解磷真菌，其中南京紫金山土样获得6株解磷真菌，南京林业大学后山土样获得15株解磷真菌，江苏省林业科学研究院土样获得18株解磷真菌，安徽黄山土样获得6株解磷真菌(表 2)，说明解磷真菌在不同马尾松林分根际土壤中的分布数量不同。

从表 2可以看出，解磷能力较强菌株的分离率约为57.8%。南京林业大学后山黄棕壤土样中分离率为80%，江苏省林业科学研究院黄壤土样的分离率为77.8%，说明黄壤和黄棕壤土样中的解磷真菌解磷能力较强，而紫金山石灰岩土样中的解磷真菌解磷能力较弱。在45株解磷真菌中，具有明显溶磷圈且d/D > 1的强解磷菌株有12株。

将初筛获得的12株解磷真菌接种于NBRIP液体摇瓶培养基中，在25 ℃，200 r·min^-1条件下培养7天后，测定发酵液中可溶磷的含量，结果(图 1)表明，12株解磷真菌对Ca₃(PO₄)₂的溶解力很强，发酵液中有效磷含量显著高于对照。各接菌处理发酵液中有效磷含量为598.11~1 051.69 mg·L^-1，各菌株解磷率为10.19%~19.3%。其中，JP-NJ1和JP-NJ4菌株的发酵液有效磷含量高达1 051.69和1 042.98 mg·L^-1，解磷率分别为19.3%和19.1%，显著高于其他菌株。

	图 1 马尾松根际12株解磷真菌的解磷效果 Fig.1 The phosphate-solubilizing effect of twelve fungi from P. massoniana rhizosphere(P < 0.01) 不同小写字母表示差异显著(P < 0.01)Different smallletters mean significant difference (P < 0.01)

对初筛获得的12株解磷真菌测定，筛选出2株解磷能力强的真菌菌株JP-NJ1和JP-NJ4。JP-NJ1菌株在CYA培养基上生长迅速，25 ℃培养7天，直径在65 mm左右。菌落黑褐色，具有辐射状沟纹，质地丝绒状(图 2A)；菌落反面稍呈淡黄色。分生孢子在菌落中间密集产生，呈黑褐色；分生孢子梗瓶梗状，约(600~800)μm×10 μm，衰老时带淡褐色；产孢结构双层，分生孢子球形或近球形，直径3.5~5 μm，壁平滑。该菌株在NBRIP培养基上生长较缓慢，25 ℃培养7天后菌落直径为35~40 mm，溶磷圈大而透明，直径为46~65 mm；菌落质地丝绒状，菌丝较稀疏；分生孢子产生较少，菌落中间最为密集，呈黑色；菌落反面无色。根据菌落的形态学分析以及显微观察，初步鉴定JP-NJ1为曲霉属一种(Aspergillus sp.)。

	图 2 2株高效解磷真菌在CYA培养基上的菌落特征 Fig.2 Two phosphate-solubilizing fungal strains colony on CYA medium A.JP-NJ1； B.JP-NJ4

JP-NJ4菌株在CYA培养基上25 ℃培养7天，菌落直径约30 mm。菌落平坦或中心有脐状突起，边缘整齐或不整齐，菌落呈颗粒状(图 2B)；分生孢子椭圆形，分生孢子面黄绿色；菌丝体黄色，有时有少量的淡褐色渗出液，菌落反面橙红色。该菌株在NBRIP上25 ℃培养7天，菌落直径为26~30 mm。溶磷圈半透明，直径18 mm左右，生长前期菌落直径大于溶磷圈直径，至生长后期(12天)溶磷圈直径大于菌落直径且更透明。菌落质地疏松，四周有呈放射状排列的绒毛状白色菌丝；菌落背面呈浅红褐色。根据菌落和菌体的形态学分析和显微观察，初步鉴定为青霉属一种(Penicillium sp.)。

以解磷真菌的DNA作为模板，利用通用引物ITS1和ITS4，对目的基因片段进行PCR扩增，得到的产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测，并以DNA Marker-DL 2000作为对照。结果表明，2株解磷真菌在500~750 bp处均有1条明显而亮的DNA条带，质量浓度约100 ng·μL^-1，且没有其他非特异性条带。因此可以判断这些条带即为获得的目的DNA片断，可用来测序。

将2株高效解磷真菌菌株18S rDNA的间隔序列进行PCR扩增并测序，将测序得到的18S rDNA ITS区序列分别与GenBank中的菌株序列进行相似性分析，并用Bioedit软件进行多重序列比较，再用Mega 4.0软件Neighbour-Joining method法寻找最简约系统发育树，用Bootstrap进行验证。结果表明，JP-NJ1菌株扩增片段大小为590 bp，JP-NJ4菌株为573 bp。将它们分别进行blast比对发现： JP-NJ1菌株与Genbank中各相似菌株的同源性都在99%以上，与黑曲霉(Aspergillus niger)和泡盛曲霉(A.awamori)序列的亲缘关系最近，同源性均为100%(图 3)；结合JP-NJ1菌株形态学特征后，可认为JP-NJ1菌株为泡盛曲霉(齐祖同，1997)。JP-NJ4菌株与Genbank中各相似菌株的同源性都在98%以上，其与嗜松青霉(P. pinophilum)(HQ392503.1)序列的亲缘关系最近，同源性最高(图 3)，故解磷真菌JP-NJ4为嗜松青霉。

	图 3 基于18S rDNA ITS序列的解磷真菌系统发育树 Fig.3 The phylogenetic tree of efficient phosphate-solubilizing fungi based on 18S rDNA ITS sequences

2株解磷真菌接种马尾松苗木150天后，对马尾松植株的生长状况以及生物量进行观察和测定。结果表明，2株解磷真菌无论是菌悬液还是代谢物都对马尾松苗有明显的促生作用(表 3)。其中：JP-NJ1菌株的菌悬液的促进作用最显著(P < 0.05)，苗高和地径分别比CK增长19.36%和27.83%，鲜质量和根质量分别比CK增长了104.13%和153.12%。JP-NJ4菌株代谢物对根质量的影响大于其菌悬液，与CK相比增加59.38%。PD培养基对马尾松苗高、地径、鲜质量和根质量的促生作用均不显著。

表 3 高效解磷真菌对马尾松生长的影响 Tab. 3 Effect of high efficient phosphate-solubilizing fungi on the growth of P.massoniana

表 3 高效解磷真菌对马尾松生长的影响 Tab. 3 Effect of high efficient phosphate-solubilizing fungi on the growth of P.massoniana (P < 0.05) 处理 Treatments 生长状况Seedling growth 植株生物量Seedling biomass 苗高 Height 地径 Ground diameter 鲜质量 Fresh mass 根质量 Root mass 测量值 Value/ cm 增长率 Increase rate (%) 测量值 Value/ mm 增长率 Increase rate (%) 测量值 Value/ g 增长率 Increase rate (%) 测量值 Value/g 增长率 Increase rate (%) JP-NJ1 菌悬液 JP-NJ1 fungal suspension 23.67±0.86a 19.36 2.71±0.19a 27.83 4.45±0.55a 104.13 1.62±0.36a 153.12 JP-NJ1发酵液 JP-NJ1 fermentation broth 22.67±2.00a 14.32 2.5±0.29ab 17.92 3.24±0.36b 48.60 0.8±0.19b 25.00 JP-NJ4菌悬液 JP-NJ4 fungal suspension 24.17±1.29ab 21.89 2.45±0.14b 15.57 3.6±0.25b 65.14 0.95±0.29bc 48.44 JP-NJ4发酵液 JP-NJ4 fermentation broth 22.1±1.147ab 11.45 2.18±0.11b 2.83 2.9±0.31bc 33.03 1.02±0.23bc 59.38 PD培养基 PD medium 22.42±1.52ab 13.06 2.19±0.22b 3.30 2.34±0.35cd 7.34 0.66±0.21c 3.13 CK 19.83±1.05b — 2.12±0.15b — 2.18±0.4d — 0.64±0.18c —

本研究从江苏南京和安徽黄山12份马尾松根际土样中分离出45株可在NBRIP无机磷培养基上生长的真菌，这些真菌均具有一定的解磷作用。通过初筛从中得到了12株解磷能力较强的解磷真菌，分离率为26.7%。其中，6株来自南京林业大学后山土样，另外6株来自江苏省林业科学研究院土样，而南京紫金山土样和安徽黄山土样中未得到解磷能力较强的真菌菌株。不同地区根际土壤解磷真菌分布以及解磷能力存在差异，这可能与土壤类型以及土壤有机质等的影响有关。通过解磷能力进一步测定，复筛出2株对Ca₃(PO₄)₂具有强解磷能力的真菌JP-NJ1和JP-NJ4。经鉴定分别为泡盛曲霉与嗜松青霉。其中，JP-NJ1菌株与黑曲霉和泡盛曲霉序列的亲缘关系均极为相近，但黑曲霉菌落呈炭黑色，菌落反面无色或黄褐色或微黄绿色，而JP-NJ1菌株菌落黑褐色，背面淡黄色，因此JP-NJ1菌株为泡盛曲霉。Whitelaw等(1999)从小麦(Triticum aestivum)根际土壤中分离出的青霉(P.radicum)，在培养21天(25 ℃)后，对Ca₃(PO₄)₂的解磷能力为360 mg·L^-1。与之相比，本研究筛选获得的2株解磷真菌对磷酸钙的解磷能力更强。

已有研究表明，解磷真菌主要有青霉菌(Penicillium)、曲霉菌(Aspergillus)、根霉(Rhizopus)、镰刀菌(Fusarium)、小菌核菌(Sclerotium)等，目前研究最多的是青霉和曲霉(李露莉等，2010)。本研究通过形态学和18S rDNA ITS序列分析，对2株马尾松根际解磷真菌JP-NJ1和JP-NJ4进行了鉴定，二者分别为泡盛曲霉和嗜松青霉。Mittal(2008)将一株泡盛曲霉接种鹰嘴豆(Cicer arietinum)，发现植物根长、种子数以及质量等都有显著增加；有研究表明，解磷青霉对玉米促生作用显著，可以用来作为水稻(Oryza sativa)的壮秧剂(徐汉虹，2001)；同时解磷青霉还可产生吲哚乙酸以促进植物生长(刘志明等，2000)。本研究将2株高效解磷真菌对马尾松苗进行接种试验，结果表明，高效解磷真菌无论是菌悬液还是发酵液都可以明显促进马尾松生长，且菌悬液处理的促生效果高于代谢物的处理。Babana等(2006)研究发现泡盛曲霉对小麦根质量增长率可达60%，本试验中解磷曲霉JP-NJ1对马尾松苗根质量的增长率则远高于上述结果，JP-NJ1菌株对马尾松根质量具有良好的促生效果。目前有关解磷菌剂的报导多集中于解磷细菌，解磷真菌研究较少；而且多是农作物上，林木方面关注较少(陈俊等，2009；朱颖等，2006)。本研究筛选获得的高效解磷真菌泡盛曲霉JP-NJ1和嗜松青霉JP-NJ4不仅丰富了解磷微生物的种质资源，并具有应用于林木微生物肥料开发研制的潜力。