人类生产活动使得陆地生态系统的氮成倍增加，氮沉降、全球变暖和生物多样性减少已成为全球三大环境问题(Rockström et al., 2009)。近年来我国经济快速发展，大量氮素进入到陆地环境中，稂小洛等(2008)调查显示2005年我国大陆区域氮氧化物的排放量为 21.3 Tg，折合纯氮7.5 Tg。大量的氮输入不仅导致长江水体富营养化(Yan et al., 2010)、农田土壤酸化(Guo et al., 2010)等问题日趋严重，而且影响与氮密切相关的多种土壤生化过程。微生物作为土壤生化过程的主要参与者和调节者必然产生相应的响应，氮沉降可显著降低土壤微生物生物量(Treseder，2008)、影响微生物群落结构和功能(Bowden et al., 2004；Thoms et al., 2010；Sayer et al., 2012；郁培义等，2013)。

BIOLOG技术在微生物生态研究及环境微生物检测方面应用十分广泛(Zak et al., 1994；Grayston et al., 1998；Rogers et al., 2001)。Juliet等(2002)报道1990—2001年就有122篇论文应用BIOLOG技术进行了土壤微生物的相关研究。目前国内也有一些应用BIOLOG技术评价土壤微生物群落功能多样性的研究，主要集中在不同植被类型(王芸等，2012；吴则焰等，2013；鲁顺保等，2013)、不同土地利用方式(刘明等，2009；郑琼等，2012)、不同施肥方式(李娟等，2008；罗希茜等，2009；袁颖红等，2012)、不同生态系统(毕捷等，2012；Zhou et al., 2012)条件下土壤微生物群落代谢功能等方面，而有关施氮对森林土壤微生物群落代谢功能影响的研究还不多见。为了全面反映施氮后森林土壤不同微生物群落碳源利用能力的变化，笔者利用BIOLOG AN，FF，Gen Ⅲ和YT 4种微孔板，设计不同水平的氮处理，对土壤厌氧菌、真菌、革兰氏菌和酵母菌类群碳源利用变化进行系统分析，探讨施氮条件下土壤微生物群落的代谢能力，为促进氮沉降对森林土壤功能影响的微生物学机制研究提供科学依据。

研究区位于湖南省森林植物园(113°02′E，28°06′N)，属于典型的亚热带湿润季风气候，年均气温约17.2 ℃，年均降水量约1 422 mm，全年无霜期270~310天，试验地坡度12~21°。研究区樟(Cinamomum camphora)树林栽植于1989年，林龄21年，林分密度1 600株·hm^-2，平均树高12.55 m，平均胸径14.92 cm。

研究区属典型红壤丘陵区，其地层主要是第四纪更新世的冲积性网纹红土和砂砾。土壤pH为5.37，土壤全C含量为16.80 g·kg^-1，土壤全N含量为1.41 g·kg^-1。

试验设3个施氮处理，即对照处理N₀(0 g·m^-2)、低氮处理N₁(5 g·m^-2)和高氮处理N₂(15 g·m^-2)，每个处理3次重复。每个处理均设置在25 m×25 m的样方中，且每个处理样方间隔0.5 m。根据样地坡度，将高氮处理样地设置于坡面最低处，防止降雨向坡下冲刷土壤表层和灌木表层未溶解的氮。2010年6月对样地进行施氮试验。施氮方法是根据氮添加水平，将NH₄NO₃(固体分析纯)溶解在20 L自来水中，以背式喷雾器人工均匀喷洒，喷洒高度 1.5 m 左右。对照样方N₀则喷洒等量清水。

于施氮12个月后(2011年7月)分别对9个样方进行取样，依照均匀并随机的原则，去除凋落物层，使用直径5 cm土钻采集地表0～10 cm的土壤。为了减少土壤空间异质性带来的取样误差，每个样方按照品字形随机采集，采集9个点，均匀混合成一个样品，并在手捡粗根、石块和其他杂物后，迅速装入塑料袋并置于低温保温箱中，运至实验室4 ℃冰箱保存。为避免边际效应造成的取样误差，采样点距离样方边缘至少50 cm。

试验使用的 BIOLOG AN，FF，Gen Ⅲ和YT 4种平板各有 96个孔，除对照孔(第1个孔)是水和指示剂，其余孔均为有机碳源和相同含量的四唑盐指示剂。

AN板用于测定厌氧菌，碳源共有95种，类型有糖类(48种)、氨基酸类(18种)、核苷类(6种)、有机酸类(23种)；FF板用于测定真菌，碳源共有95种，类型有糖类(48种)、羧酸类(18种)、氨基酸类(14种)、其他类(7种)、聚合类(4种)和胺类(4种)；Gen Ⅲ板用于测定革兰氏菌，碳源共有95种，类型有糖类(29种)、无机盐类(24种)、羧酸类(23种)、氨基酸类(12种)、聚合类(4种)和其他类(3种)；YT板用于测定酵母菌，碳源共有35种，类型有糖类(23种)、羧酸类(6种)、聚合类(3种)、氨基酸类(3种)。

试验前先将待测土壤从冰箱内取出，置于室温下恢复土壤微生物活性，然后称取10 g土样放入装有90 mL生理盐水的三角瓶中，200 r·min^-1振荡30 min，使土壤均匀分散，然后制成10^-3的土壤稀释液，取其上清菌液用8道移液排枪接入微平板(每孔150 μL)，放入恒温培养箱培养(BIOLOG AN板置于厌氧培养箱培养)，每隔12 h进行读数，连续读数10天。

BIOLOG微平板反应一般采用平均颜色变化率(average well color development，AWCD)来描述(Baath et al., 1980；周德庆，1993)，计算公式为:AWCD=∑(C-R)/n。式中，C为培养基孔的光密度值，R为对照孔(A1)的光密度值，n为培养基碳源种类，YT板n值为 35，其余3种微平板(AN，Gen Ⅲ和FF板)n值为95。

采用Shannon指数、Simpson指数和McIntosh指数来反映微生物群落代谢功能的多样性。Shannon指数计算公式:H=-∑P_ilnP_i，P_i为第i孔吸光值与整个平板相对吸光值总和的比率。Simpson指数计算公式:D＝1-∑P_i²;McIntosh指数计算公式:U=$\sqrt{\sum{n_{i}^{2}}}$，n_i为第i孔的相对吸光值。

本文试验数据在统计分析前用SPSS中的“explore”进行正态化检验，采用SPSS13.0 对数据进行单因素方差分析，CANOCO 4.5进行主成分分析，Sigmaplot 10.0 作图。

4种微孔板连续培养10天，每隔12 h测得的AWCD值见图 1。AWCD值可以反映微生物对不同碳源代谢的总体情况，AWCD 值升高得越快，表明微生物群落的代谢活性越强。由图 1可知，4种土壤微生物群落的AWCD值随培养时间的延长而升高，变化趋势基本一致。其中，AN板36 h后开始表现出明显上升趋势，N₀随时间变化波动较大；FF板AWCD值上升趋势较平缓；Gen Ⅲ板AWCD值从一开始就表现出明显上升趋势外；YT板AWCD值除N₀ 处理24 h后表现出明显上升趋势，N₁和N₂处理上升趋势较平缓。氮添加不同处理下，4种微生物类群均表现为N₀＞N₁＞N₂，这说明氮处理抑制了微生物类群的代谢活性。

	图1 BIOLOG 4种微孔板AWCD值随时间的变化曲线 Fig.1 AWCD value in BIOLOG microplates in soils under different N treatments

利用156 h培养后的AWCD值计算多样性指数。Shannon指数、Simpson 指数和McIntosh 指数通过物种丰富度、优势度和均匀度指标来反映土壤微生物功能多样性(郑琼等，2012)。由表 1可知，厌氧菌Shannon指数施氮处理高于对照，Simpson指数施氮处理显著低于对照(P＜0.05)，McIntosh指数施氮处理低于对照；真菌Shannon指数高氮处理高于对照，低氮处理低于对照，Simpson和McIntosh指数施氮处理低于对照；革兰氏菌Shannon指数氮处理显著高于对照(P＜0.05)，Simpson和McIntosh指数施氮处理低于对照；酵母菌Shannon指数施氮处理显著高于对照(P＜0.05)，Simpson指数高氮处理显著高于对照(P＜0.05)，McIntosh指数施氮处理显著低于对照(P＜0.05)。这表明厌氧菌、真菌、革兰氏菌和酵母菌的丰富度在施氮后均增强，厌氧菌、真菌和革兰氏菌的优势度在施氮后降低，厌氧菌、真菌、革兰氏菌和酵母菌的均匀度在施氮后均降低。

表1 施氮处理土壤微生物多样性变化^① Tab. 1 Changes of soil microbial diversity in soils under different N treatments

表 1施氮处理土壤微生物多样性变化① Tab.1Changes of soil microbial diversity in soils under different N treatments 群落类型 Community type 施氮处理 Nitrogen treatment Shannon指数 Shannon index Simpson指数 Simpson index McIntosh指数 McIntosh index N0 14.57±0.13A 0.71±0.01A 0.22±0.01A 厌氧菌 Anaerobic bacteria(AN) N1 20.82±0.72A 0.21±0.02B 0.18±0.01A N2 17.49±4.66A 0.51±0.08C 0.16±0.03A N0 10.70±0.05A 0.72±0.03A 0.92±0.07A 真菌 Fungi(FF) N1 9.26±3.67A 0.60±0.24A 0.62±0.20 A N2 16.68±2.83A 0.55±0.07A 0.51±0.18 A N0 6.19±0.01A 0.92±0.01A 3.00±0.01A 革兰氏菌 Gram bacteria(Gen Ⅲ) N1 7.66±0.37B 0.90±0.03A 2.32±0.66 A N2 6.93±0.22AB 0.90±0.01A 2.23±0.09A N0 3.89±0.01A 0.21±0.01A 2.40±0.01A 酵母菌 Yeast(YT) N1 9.47±0.82B 0.13±0.04A 0.38±0.15B N2 12.06±0.31C 0.59±0.07B 0.16±0.03B ①每个处理有3次重复，同列不同大写字母表示氮添加水平间差异显著(P＜0.05)。Each value was mean of three replicates. Significant differences at 0.05 level among different nitrogen addition treatments were indicated by capital letters in a column.

由图 2可以看出，厌氧菌明显偏好利用有机酸类和糖类。与对照相比，氮添加处理导致厌氧菌对糖类和有机酸类的利用减少，而提高了对氨基酸类和核苷类碳源的利用，但差异并不显著(P＞0.05)。在对照(N₀)处理中，厌氧菌对4类碳源的利用达到了显著性差异(P＜0.05)，低氮(N₁)处理下对核苷类利用显著小于对糖类和有机酸类的利用，高氮(N₂)处理下对4类碳源的利用差异性不显著(P＞0.05)。

图2 施氮后土壤厌氧菌碳源利用率 Fig.2 Relative use effective of anaerobic bacteria carbon source in soils under different N treatments 不同大写字母表示同一氮添加水平下不同碳源利用差异显著，不同小写字母表示不同氮添加水平下同一碳源利用差异性显著(P＜0.05)，下同。Significant differences at 0.05 level among different carbon source utilization at the same nitrogen addition rates were indicated by capital letters， and among different nitrogen addition for the same carbon source utilization by lowercase letters. The same below.

由图 3可以看出，真菌群落明显偏好利用糖类。与对照相比，施氮进一步提高了真菌对糖类的利用(P＜0.05)，且与其他5类碳源利用差异性显著(P＜0.05)。同时，施氮降低了真菌对羧酸类和氨基酸类碳源的利用程度，但差异不显著(P＞0.05)，对聚合类碳源的利用无明显变化。

	图3 施氮后土壤真菌碳源利用率 Fig.3 Relative use effective of fungi carbon source in soils under different N treatments

图 4表明，革兰氏菌对糖类、无机盐类和羧酸类碳源的利用率均高于聚合类、氨基酸类和其他类碳源，且对照处理中革兰氏菌对6类碳源的利用差异性显著(P＜0.05)。与对照相比，施氮提高了革兰氏菌对无机盐类化合物和羧酸类的利用，特别是高氮处理显著提高了革兰氏菌对羧酸类的利用(P＜0.05)，同时却降低了革兰氏菌对糖类、聚合类、其他类和氨基酸类碳源的利用。

	图4 施氮后土壤革兰氏菌碳源利用率变化 Fig.4 Relative use effective of gram bacteria carbon source in soils under different N treatments

由图 5可知，酵母菌偏好利用糖类，但施氮后显著降低了酵母菌对糖类的利用(P＜0.05)，显著提高了对羧酸类和聚合类的利用(P＜0.05)。

	图5 施氮后土壤酵母菌碳源利用率变化 Fig.5 Relative use effective of yeast carbon source in soils under different N treatments

为了更好地分析氮添加对土壤不同微生物类群的影响，对4种微生物类群进行主成份分析，分析利用培养156 h后测定的AWCD值。根据提取的主成分一般要求累计方差贡献率达到85%的原则，共提取了2个主成分(图 6)。从图 6可看出，不同氮添加处理在PC1轴上出现了明显分异，土壤真菌(FF板)分布在PC1轴的正方向，土壤厌养菌(AN板)、革兰氏菌(GenⅢ板)和酵母菌(YT板)分布在PC1轴的负方向。4个群落基本上都分布在PC2轴的正方向上，而PC1轴的主要影响因子为低氮(N₁)处理(1.06)，PC2的主要影响因子是对照(N₀)处理(1.18)。整体来看不同氮添加对微生物群落产生了影响。

	图6 不同氮添加土壤微生物群落代谢活性主成分分析 Fig.6 Principal component analysis of soil microbial community structure under different N treatments

从土壤微生物群落的点在影响因子箭头及其延长线的投影点可看出，土壤真菌和厌氧菌碳源利用能力受氮添加影响较大，而革兰氏菌和酵母菌碳源利用能力受氮添加影响相对较小。

对不同氮添加处理的碳源主成分得分系数进行方差分析(表 2)，结果表明：PC1得分系数不同处理之间除FF板外，其他均差异显著(P＜0.05)，而PC2不同处理之间除AN板外均表现差异不显著(P＞0.05)，这说明不同施氮处理影响了微生物群落的碳源利用程度。

表2 不同氮添加处理主成分得分系数分析 Tab. 2 PC scores for different treatments

表 2不同氮添加处理主成分得分系数分析 Tab.2PC scores for different treatments 微孔板类型 Microplate Type 氮添加 Nitrogen treatments PC1 PC2 AN N0 1.22±0.05A -0.38±0.04A N1 0.67±0.03B 0.21±0.05AB N2 0.27±0.11C 0.85±0.44B FF N0 0.90±0.66A 0.83±0.06A N1 -0.24±0.47A 0.58±0.48A N2 -0.66±0.43A -0.64±0.44A Gen Ⅲ N0 1.38±0.01A -0.15±0.01A N1 -0.50±0.09B 1.15±0.25A N2 -0.88±0.13C -0.1±0.34A YT N0 1.41±0.01A 0.02±0.01A N1 -0.71±0.02B 1.12±0.49A N2 -0.70±0.01B -0.50±0.01A

进一步对PC1和PC2具有较高相关性的前20种碳源进行分析(表 3)，结果表明，对主成分(PC1和PC2)起分异作用的主要碳源在不同类型微孔板上差异较大。如对AN微孔板起分异作用的主要碳源是有机酸和糖类物质；对FF微孔板起分异作用的主要碳源是羧酸类和糖类物质，糖类碳源(10种)在PC1的权重较大，与 PC2相关性较大的碳源主要是羧酸类；Gen Ⅲ微孔板对 PC1和PC2起分异作用的主要碳源是无机盐、氨基酸和糖类物质，其中无机盐在PC1的权重较大，而在PC2的权重较小；YT微孔板对 PC1和PC2起分异作用的主要碳源是聚合类和糖类物质。由此可见，不同微生物类群碳源利用的主要成分都有糖类，但还有其他碳源利用的差异，显示出微生物群落碳源代谢多样性。

表3 与PC1和PC2显著相关的主要碳源类型 Tab. 3 Correlation coefficients between main substrates and PC1 or PC2

表 3与PC1和PC2显著相关的主要碳源类型 Tab.3Correlation coefficients between main substrates and PC1 or PC2 PC1微孔板类型 Microplate type 碳源类型 Carbon source type 相关系数 Correlation coefficient(R) PC2微孔板类型 Microplate type 碳源类型 Carbon source type 相关系数 Correlation coefficient(R) 糖类Carbohydrates(7) 0.933 4 糖类Carbohydrates(7) 0.856 5 AN平板 AN plate 有机酸类Organic acid(8) 0.934 6 AN 有机酸类Organic acid(10) 0.837 3 氨基酸类Amino acids(5) 0.924 7 氨基酸类Amino acids(3) 0.796 4 聚合类Polymers(1) 0.981 8 聚合类Polymers(1) 0.702 5 糖类Carbohydrates(10) 0.969 4 糖类Carbohydrates(6) 0.570 6 FF 羧酸类Carboxylic acids(6) 0.980 7 FF 胺类Amines(1) 0.424 6 氨基酸类Amino acids(3) 0.982 5 羧酸类Carboxylic acids(7) 0.583 3 — — 氨基酸类Amino acids(3) 0.433 6 — — 其他类Miscellaneous(2) 0.476 3 糖类Carbohydrates(4) 0.947 4 糖类Carbohydrates(4) 0.895 2 无机盐Inorganic salts(6) 0.954 5 无机盐类Inorganic salts(6) 0.852 7 Gen Ⅲ 氨基酸类Amino acids(4) 0.956 7 Gen Ⅲ 其他类Miscellaneous(1) 0.943 7 羧酸类Carboxylic acids(4) 0.948 6 氨基酸类Amino acids(4) 0.949 0 聚合类Polymers(2) 0.951 5 羧酸类Carboxylic acids(4) 0.830 5 — — 聚合类Polymers(1) 0.964 1 聚合类Polymers(5) 0.996 3 羧酸类Carboxylic acids(3) 0.636 8 YT 糖类Carbohydrates(15) 0.991 4 YT 聚合类polymers(6) 0.897 2 — — 糖类Carbohydrates(11) 0.918 9

南方亚热带区域是我国高氮沉降中心(Lü et al.， 2007)。在高氮沉降地区，当氮输入超过生态系统对氮的生物需求量时，氮素富集会导致土壤酸化，土壤中NO₃^-的活动性增强，生态系统氮素迁出加速(Aber et al., 1998)，土壤微生物的生长繁殖受到抑制(Baath et al., 1980)，同时也可能促进某些微生物种群(如偏于利用氮素种群)代谢活性，致使群落均匀度下降(Paul et al., 1996; Frey et al., 2004；薛璟花等，2007)。本研究结果表明，施氮后土壤微生物群落活性均受到不同程度抑制，微生物4种类群群落丰富度施氮后均增强，均匀度施氮后均降低，同时厌氧菌、真菌和革兰氏菌的优势度施氮后降低。

碳素是自然界存在的可以被土壤微生物利用的最主要的成分，也是消耗利用最大的营养基质。氮大量输入会增加森林凋落物数量，改变土壤有机质的含量和品质(Grandy et al., 2009；Liu et al., 2010)，也直接改变了土壤微生物分解底物的质量(C∶N∶P 化学计量比)、数量以及 pH 环境等。本研究显示，在BIOLOG提供的碳源中，厌氧菌偏好利用有机酸类和糖类，真菌、革兰氏菌和酵母菌群落均明显偏好利用糖类，但施氮后，糖类虽然仍是4种微生物群落主要利用的碳源，却相应地提高其他几类碳源利用程度(董艳等，2013)。另外，PCA分析表明，土壤真菌和厌氧菌对碳源利用受施氮影响较大，革兰氏菌和酵母菌对碳源利用受施氮影响相对较小。这说明施氮影响了土壤微生物碳源代谢功能(Zhang et al., 2008；Rousk et al., 2011)。

土壤厌氧菌、真菌、革兰氏菌和酵母菌都参与土壤碳氮循环过程，了解它们碳源代谢能力从不同侧面也可以反映出土壤碳含量的情况。森林生态系统施氮后土壤碳库的变化非常复杂，有文献报道氮输入能显著增加土壤碳库(Adams et al., 2005)，也能显著降低土壤碳库(Sager et al., 2005)，还有土壤碳库无明显改变(Silver et al., 2005)。本研究中4种类群施氮后活性均受到了抑制，碳源利用能力和碳源利用种类发生了变化，这种变化对森林土壤有机碳库组成和贮量会造成影响，究竟对土壤碳库造成多大影响，需结合地上生态系统变化进行研究。卢蒙(2009)研究氮输入对生态系统碳、氮循环影响的整合分析表明，施氮对非农业生态系统土壤碳库没有显著改变，这是因为氮输入促进植物生长，增加了凋落物量，碳输入增多；另一方面，土壤碳氮比改变，土壤有机质分解加快，碳输出增多。但是可以肯定的是，氮输入通过抑制土壤微生物代谢功能降低了土壤微生物碳(Dijkstra et al., 2005)，从而改变了土壤有机碳库平衡。

另外，土壤微生物是评价土壤质量变化的敏感参数，因此在当今高氮持续输入的背景下，通过试验认识氮添加过程和土壤不同微生物类群对持续氮输入的响应，是认清氮饱和对土壤性质影响的微生物学机制的关键，也是制定科学合理的管理措施的基础(Magill et al., 2004)。当然本研究仅利用BIOLOG技术从碳源代谢的角度来探讨氮添加下的土壤微生物学，还存在一些局限性(钟文辉等，2004；焦晓丹等，2004)。今后可以辅以分子生物学的方法，如Lekberg等(2012)发现的基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统，将更好地为微生物的多样性和丰度等群落结构分析提供技术支持。

1)施氮后土壤微生物群落代谢活性均不同程度地降低，即高氮(N₂)处理＜低氮(N₁)处理＜对照(N₀)处理，且Shannon指数、Simpson指数、McIntosh指数分析结果表明厌氧菌、真菌、革兰氏菌和酵母菌的丰富度施氮后均增强，厌氧菌、真菌和革兰氏菌的优势度施氮后降低，厌氧菌、真菌、革兰氏菌和酵母菌的均匀度施氮后均降低，说明施氮影响了4种微生物类群的多样性。

2)施氮后土壤厌氧菌减少对糖类和有机酸类的利用，而提高了对氨基酸类和核苷类碳源的利用；真菌进一步提高对糖类的利用，降低了对羧酸类和氨基酸类碳源的利用；革兰氏菌提高了对无机盐类和羧酸类的利用，降低了对糖类、聚合类、其他类和氨基酸类碳源的利用；酵母菌降低了对糖类的利用，提高了对羧酸类和聚合类的利用。这说明氮添加后，使得土壤4类微生物群落的碳源利用能力发生了变化。

3)主成分分析表明，不同施氮处理对微生物群落代谢多样性产生了影响。土壤真菌和厌氧菌碳源利用受氮添加影响较大，而革兰氏菌和酵母菌碳源利用受氮添加影响相对较小。