红松(Pinus koraiensis)是我国东北地区的优势树种，经济价值极高。松多酚是从红松组织中分离出来的一类次生代谢产物，具有很强的生理活性，有助于预防癌症和心脑血管疾病的发生(Morton et al., 2000; Tassoni et al., 2012)。松多酚作为一种天然、无毒、高效的抗氧化剂，可以广泛应用于食品、保健品和医药领域，因此如何采取有效的措施提高松多酚的含量具有重要意义。稀土是一类具有生理活性的元素，可以对植物产生多种生理效应、提高种子萌发率、促进根系发育、提高生物量和增强抗逆性等，在农业上得到广泛应用(Arora et al., 2002; Hu et al., 2002; 2004)。随着研究的不断深入，稀土元素(镧、铕、铈、镱等)的应用已经拓展到植物细胞和组织培养领域(Chen et al., 2004)。相关研究表明，稀土元素镧可以作为诱导子提高红豆杉(Taxus spp.)细胞中紫杉醇的含量(Wu et al., 2001)，还可以促进雪莲 (Saussurea medusa)细胞 的生长和黄酮类化合物的积累(袁晓凡等，2004)； 低剂量铕对甘草(Glycyrrhiza uralensis)愈伤组织生物量积累和黄酮类化合物的生物合成具有明显的促进作用(杨世海等，2005)。稀土元素对红松次生代谢合成的研究尚未见报道。本试验选用稀土元素镧和铕作为红松次生代谢的诱导子，研究其对红松幼苗生长、多酚类物质含量以及苯丙氨酸转氨酶(PAL)、肉桂酸4-羟化酶(C4H)活性的影响，进而探究镧和铕诱导促进红松多酚类物质合成的机制，为红松资源开发和提高 其经济价值提供基础资料。

成熟的红松种子采自小兴安岭地区30年树龄的红松林，保存于-4 ℃冰箱中。

1)种子消毒根据曹焱等(2009)的方法进行。

2)合子胚诱导生成红松幼苗成熟种子灭菌后剥去胚乳，将完整胚作为外植体接种在DCR培养基上，25 ℃培养7天，诱导生成的红松幼苗作为稀土元素处理的原材料。

硝酸镧和氧化铕过滤灭菌后，稀释为不同浓度添加到DCR培养基中。所有的处理设3次重复，每个培养瓶中接种6株红松幼苗。稀土元素处理的红松幼苗培养8天后收获。幼苗鲜质量增长率=[(收获质量－初始质量)/初始质量]×100%。

将收获后的红松幼苗进行研磨，加入50 mL 60%乙醇，在超声功率为150 W、温度为30 ℃条件下提取2 h，离心定容后 待测定。多酚和原花青素含量测定采用刘冉等(2013)和孙芸等(2003)的方法。

按照范存斐等(2012)的方法进行，取培养的6株红松幼苗，加入4 mL提取液(0.2 mol·L^-1 pH 8.8的硼酸缓冲溶液，2 mmol·L^-1的巯基乙醇、质量分数2%PVP，冰浴研磨至匀浆，4 ℃、12 000 r·min^-1下离心20 min，收集上清液作为PAL粗酶液。

取粗酶液0.2 mL，加入3.6 mL pH 8.8硼酸缓冲溶液和0.2 mL 0.2 mol·L^-1苯丙氨酸溶液，30 ℃反应30 min后，加入0.2 mL 6 mol·L^-1盐酸溶液终止反应，立即测定290 nm处的吸光度，空白对照组用缓冲溶液代替苯丙氨酸。此条件下以每小时催化底物生成1 μg的反式肉桂酸为1个酶活力单位。

按照范存斐等(2012)的方法进行，取培养的6株红松幼苗，加入4 mL提取液(0.05 mol·L^-1 pH 8.9的Tris-HCL、15 mmol·L^-1的巯基乙醇、4 mmol·L^-1 MgCl₂、5 mmol·L^-1 Vc、2% PVP，冰浴研磨至匀浆，4 ℃、12 000 r·min^-1下离心20 min，收集上清液作为PAL粗酶液。

取粗酶液0.2 mL，加入3.6 mL反应液(2 mmol·L^-1 反式肉桂酸，50 mmol·L^-1 pH 8.9 Tris-HCL、2 mmol·L^-1 NADP-Na₂)，25 ℃反应30 min后，加入0.2 mL 6 mol·L^-1盐酸溶液终止反应，立即测定340 nm处的吸光度，空白对照组用缓冲溶液代替反应液。此条件下以每小时吸光度变化0.01为1个酶活力单位。

所有的数据均以(平均值±标准差)的形式表示，并运用SPSS 17.0(ANOVA)进行方差分析。

从图 1可知，镧从25 μmol·L^-1开始显示出良好的促进红松幼苗生长的作用，当镧浓度达到200 μmol·L^-1时促长作用最强，增长率可达到(87.16±2.21)%。相同处理浓度下，铕促进红松幼苗生长的作用不及镧，低浓度铕(25 μmol·L^-1)没有显现出促长作用，当铕浓度达到50 μmol·L^-1时促长作用才开始显现，铕浓度在100～400 μmol·L^-1范围内促长作用最强，增长率最大为(57.55±1.72)%。

	图1 不同浓度镧和铕对红松幼苗生长的影响 Fig.1 Effects of La3+ and Eu3+ on the growth from P. koraiensis seedlings 不同字母表示不同浓度处理组之间差异显著 (P< 0.05)。Different letters indicate significant difference of treatment group with different concentration at P< 0.05.下同。The same below.

从图 2可知，低浓度镧(25～200 μmol·L^-1)处理红松幼苗多酚含量显著高于高浓度镧(400～600 μmol·L^-1)处理，100 μmol·L^-1浓度 镧处理多酚含量最高，达(9.37±0.33)mg·g^-1，是对照组的1.55倍。与镧处理相反，铕处理多酚含量随浓度增加而逐渐增大，400，600 μmol·L^-12种高浓度铕处理红松幼苗多酚含量最高，且二者之间差异不显著，多酚含量分别为(8.53±0.34)mg·g^-1和(8.38±0.25)mg·g^-1，是对照组的 1.41和1.39倍。

	图2 不同浓度镧和铕对红松幼苗多酚含量的影响 Fig.2 Effects of La3+ and Eu3+ on the content of polyphenols from P. koraiensis seedlings

从图 3可知 ，25，50，100 μmol·L^-1低浓度镧处理组原花青素含量显著高于对照组，且三者之间无显著性差异。镧浓度为100 μmol·L^-1时，原花青素含量为(2.59±0.21)mg·g^-1，是对照组的1.58倍。铕浓度达到200，400μmol·L^-1时，原花青素含量达到最大值，分别为(2.34±0.15)mg·g^-1和(2.29±0.23)mg·g^-1，是对照组的1.43和1.40 倍。当铕浓度为600 μmol·L^-1时，原花青素含量开始减小，为(2.06±0.13)mg·g^-1。

	图3 镧和铕对红松幼苗中原花青素含量的影响 Fig.3 Effects of La3+ and Eu3+ on the contents of proanthocyanidins from P. koraiensis seedlings

从稀土元素对红松幼苗生长、多酚含量和原花青素含量3方面综合分析，镧和铕 对红松幼苗多酚合成的最佳浓度分别为100和400 μmol·L^-1。

如图 4所示，红松幼苗生长分为2个阶段： 0～5天为快速生长期，6～8天为稳定期。镧和铕对红松幼苗的促长效果不同，100 μmol·L^-1镧 处理在2天后就显示出显著的促长作用，而400 μmol·L^-1铕处理在4天后才显现出良好的促长作用，由此可以明显看出100 μmol·L^-1镧促进红松幼苗生长效果更好(表 1)。

表1 稀土元素处理对红松幼苗鲜质量增长率的影响^① Tab. 1 Effects of rare earth elements on the growth rate of fresh mass from P. koraiensis seedlings

表 1稀土元素处理对红松幼苗鲜质量增长率的影响① Tab.1Effects of rare earth elements on the growth rate of fresh mass from P. koraiensis seedlings 处理 Treatment 鲜质量增长率Growth rate of fresh mass(%) 1 d 2 d 3 d 4 d 5 d 6 d 7 d 8 d 100 μmol·L-1La3+ 14.51±2.23a 33.09±3.16b 45.35±2.14b 66.51±3.33c 76.97±1.52c 81.81±2.55c 83.10±3.91c 83.20±2.08c 400 μmol·L-1Eu3+ 12.74±1.54a 28.43±2.01a 37.30±1.21a 46.68±1.54b 51.75±1.48b 56.16±2.25b 56.20±1.80b 56.51±1.75b CK 11.32±2.02a 24.13±3.32a 35.06±2.45a 40.03±2.68a 45.78±3.32a 46.12±3.32a 45.12±1.53a 44.46±2.12a ① 每列不同字母表示差异显著(P< 0.05)，表中数值以(平均值±标准差)表示，下同。Value followed by the different letter within a column were different significantly at P< 0.05. Date were expressed as mean±SE. The same below.

	图4 稀土元素处理下红松幼苗的生长曲线 Fig.4 Growth curves of P. koraiensis seedlings with rare earth elements

从表 2，3可知。红松幼苗可以迅速对外源稀土元素做出响应，多酚和原花青素在处理前期得到快速合成。镧处理组在处理4天后多酚和原花青素的含量达到最大值，分别为(9.28±0.28)mg·g^-1和(2.56±0.16)mg·g^-1，而铕处理组在处理7天后多酚和原花青素的含量达到最大值，分别为(8.50±0.26)mg·g^-1和(2.28±0.16)mg·g^-1。稀土元素诱导松多酚合成主要集中在红松幼苗的快速生长期。

表2 稀土元素对红松幼苗多酚合成的影响 Tab. 2 Effects of rare earth elements on polyphenols synthetic of P.koraiensis seedlings

表 2稀土元素对红松幼苗多酚合成的影响 Tab.2Effects of rare earth elements on polyphenols synthetic of P.koraiensis seedlings 处理 Treatment 多酚含量Concent of polyphenols /(mg·g-1) 0 d 1 d 2 d 3 d 4 d 5 d 6 d 7 d 8 d 100 μmol·L-1La3+ 4.50±0.21a 6.19±0.22b 7.36±0.21c 8.39±0.28c 9.28±0.28c 9.29±0.25c 9.38±0.17c 9.35±0.35c 9.34±0.25c 400 μmol·L-1Eu3+ 4.50±0.21a 5.98±0.15b 6.78±0.23b 7.87±0.19b 8.04±0.16b 8.18±0.22b 8.56±0.24b 8.50±0.26b 8.53±0.17b CK 4.50±0.21a 4.76±0.18a 4.98±0.31a 5.23±0.13a 5.69±0.21a 5.79±0.23a 5.91±0.19a 6.00±0.31a 6.04±0.22a

表3 稀土元素对红松幼苗原花青素合成的影响 Tab. 3 Effects of rare earth elements on proanthocyanidins synthetic of P. koraiensis seedlings

表 3稀土元素对红松幼苗原花青素合成的影响 Tab.3Effects of rare earth elements on proanthocyanidins synthetic of P. koraiensis seedlings 处理 Treatment 原花青素含量 Concent of proanthocyanidins/(mg·g-1) 0 d 1 d 2 d 3 d 4 d 5 d 6 d 7 d 8 d 100 μmol·L-1La3+ 1.07±0.15a 1.79±0.13b 2.06±0.13b 2.29±0.13c 2.56±0.16c 2.53±0.13c 2.50±0.19b 2.55±0.16b 2.60±0.12c 400 μmol·L-1Eu3+ 1.07±0.15a 1.51±0.14b 1.78±0.16b 1.83±0.16b 2.00±0.23b 2.11±0.11b 2.14±0.19b 2.28±0.16b 2.30±0.13b CK 1.07±0.15a 1.12±0.16a 1.28±0.14a 1.28±0.12a 1.45±0.11a 1.54±0.17a 1.60±0.18a 1.62±0.18a 1.64±0.19a

PAL和C4H是苯丙烷代谢途径中第1步和第2步的关键酶，在植物次生代谢中起着非常重要的作用(Brenda et al., 1999)。某些植物受到损伤、光照、温度、营养等因素的影响，会诱导植物体中C4H和PAL活性的升高(Weisshaar et al.， 1998; Russell et al.， 1967)。100 μmol·L^-1镧和400 μmol·L^-1铕处理可以引起红松幼苗体内PAL和C4H活性的迅速增加。从图 5，6可以看出，经稀土元素诱导处理2天后，PAL和C4H活性都达到最大值，随后活性开始下降，最终趋于平缓，在诱导过程中，稀土元素处理组PAL和C4H的活性均高于对照组。

	图5 稀土元素对PAL活性的影响 Fig.5 Effects of rare earth elements on PAL activity

100 μmol·L^-1镧和400 μmol·L^-1铕迅速提高了红松幼苗的PAL活性，处理2天后活性达到最大，分别为(3.18±0.11)U·mg^-1 h^-1和(3.02±0.23)U·mg^-1 h^-1，是对照组 的3.98倍和3.78倍，2种稀土元素对PAL诱导效果相近。

100 μmol·L^-1镧和400 μmol·L^-1铕在提高PAL活性的同时，也迅速提高了C4H的活性，处理2天后C4H活性达到最大，分别为(1.84±0.07)U·mg^-1 h^-1和(1.12±0.15)U·mg^-1 h^-1，是对照组 的3.61倍和2.20倍。从图 6可以明显看出，100 μmol·L^-1镧提高C4H活性的作用 显著高于400 μmol·L^-1铕。

	图6 稀土元素对C4H活性的影响 Fig.6 Effects of rare earth elements on C4H activity

通过研究多酚、原花青素含量和PAL，C4H活性随时间的变化 发现，稀土元素诱导PAL，C4H活性提高的时期正是多酚、原花青素积累的最佳时期。PAL和C4H活性和多酚类物质的含量之间具有正相关性，因此推测稀土元素镧和铕通过改变苯丙烷代谢途径中相关酶的活性，促进多酚类次生代谢产物的合成与积累。

目前的研究表明：稀土元素镧和铕可以提高红松幼苗多酚类物质的含量和PAL，C4H的活性。稀土元素的诱导效果取决于稀土种类和浓度，镧和铕 的最佳添加浓度分别为100 μmol·L^-1和400 μmol·L^-1。红松幼苗经过稀土元素处理 后 PAL，C4H活性和多酚、原花青素含量同时被提高，表明PAL和C4H是稀土元素(镧、铕)诱导红松细胞合成多酚类物质途径中的关键酶。

稀土元素对植物的生理效应具有双面性，临界浓度范围的稀土元素对植物具有正面效应，如促进植物生长、提高植物生物量、提高植物抗逆性和促进植保素的合成等(何跃君等，2005; Liang et al.， 2006)； 但是，稀土元素在植物体内的浓度超过耐受临界浓度范围时会对植物产生负面效应，抑制植物生长，诱导植物产生氧化胁迫从而对植物造成损伤和毒害(肖强等，2007; Shi et al.， 2005)。这种现象被称为称为Hormesis效应(张信连等，2004)。在植物组织培养提高次生代谢产物含量领域，不同的植物种类稀土元素的添加浓度会有差异，如银杏(Ginkgo biloba)细胞合成银杏内酯(崔堂兵等，2002)、水母雪莲(Saussurea medusa)合成黄酮(袁晓凡等，2004)、长春花(Catharanthus roseus)细胞合成生物碱(元英进等，1993)等。根据本试验 得出的结论，镧和铕对红松幼苗多酚合成影响的临界浓度不同，镧和铕的临界浓度分别为25～100 μmol·L^-1和200～600 μmol·L^-1，镧用于促进红松次生代谢物质多酚的合成方面效果比铕好。

苯丙氨酸解氨酶(PAL)和肉桂酸-4-羟基化酶(C4H)是苯丙烷类代谢途径中的2种关键酶，PAL，C4H在植物体内活性与植物抗逆性和次生代谢产物合成相关(张宽朝等，2008; Liu et al.， 2013; Ge et al.， 2006)。在本试验中镧和铕可以显著提高红松幼苗PAL，C4H活性和多酚的含量。稀土元素对其他植物生理效应的研究也得到了类似的结果：吴丽丽等(2011)研究发现，稀土元素铕可以提高红叶石楠(Photinia fraseri)中色素的含量和PAL活性；Liang等(2006)研究表明，20 mg·L^-1的镧可以通过提高大豆 (Glycine max)幼苗的黄酮含量和PAL活性，从而减轻UV-B辐射引起的伤害，提高植物的抗环境应力。PAL是多酚类物质合成途径中的关键酶，当PAL活性被诱导后，多酚类次生代谢产物积累量也会相应增加。

一些研究报道了稀土元素促进植物次生代谢产物合成的作用机制。镧和铕可以进入植物细胞，主要沉积在细胞质膜和细胞壁的表面，通过改变细胞膜的通透性，进而增强细胞对营养物质的吸收、利用和转化，促进植物细胞的生长以及次生代谢产物的合成和释放(梁涛等，2007; Gao et al.， 2003)。植物体内的钙调节蛋白CaM一直被视为诱导植物防御反应信号转导体系的关键信使，而镧和铕与钙的性质和结构相似，被称为超级钙(袁晓凡等，2005;葛志强等，2000)。当稀土元素被植物吸收以后，可以提高植物细胞内CaM的含量，调节细胞的信号传递系统，激发植物防御反应，次生代谢途径被活化，间接提高PAL，C4H等酶活性，从而促进多酚的合成和积累(郑志侠等，2001; 李伟等，2001)。

在植物细胞培养生产有价值的次生代谢物质时普遍存在一个问题，当某些诱导子(如茉莉酸甲酯/茉莉酸、水杨酸、壳聚糖等)的添加浓度能够提高次生代谢物质含量的同时也会对植物细胞产生抑制作用，进而影响目标物质的产量(Dong et al., 2010; Cheng et al., 2006; Chong et al., 2005; 杨英等，2008)。而稀土元素能够克服这个难题，在提高多酚含量的同时能保证 不会 对细胞的生长产生抑制作用，而且还能在一定程度上起到良好的促长作用。因此采用稀土元素作为红松多酚合成的诱导子，在提高产量方面与其他诱导子相比具有绝对的优势。本研究初步探讨了稀土元素能够促进红松多酚类次生代谢产物合成的作用机制，为稀土元素的利用提供了新的途径，为后续体外红松细胞扩大培养生产松多酚奠定理论基础。为了阐明稀土元素促进松多酚合成的作用机制，对多酚合成途径中其他酶活性的影响和与细胞转导体系的关系还需进一步的研究中。