氧化磷酸化合成的ATP能为细胞代谢提供能量，而线粒体是植物进行氧化磷酸化的场所，其结构和功能的正常性对细胞、组织甚至整个有机体正常功能的维持相当重要(钱琼秋等，2006a)。众多研究(陈靠山等，1995； 王立安等，2004； 李赤等，2011； 张云霞等，2011)表明：植物病原毒素对线粒体的作用主要集中在超微结构上，诸如膜结构的破坏、脊膨胀、空泡化，基质电子密度降低，线粒体基质及脊数减少以至消失等，并抑制NADH或者琥珀酸及苹果酸的氧化。而毒素干扰线粒体膜生物物理特性、导致呼吸作用的氧化磷酸化解偶联等生理代谢的研究较少，特别在木本植物上尚未涉及。

杂交竹(Bambusa pervariabilis×Dendrocalamopisis grandis)梢枯病引起四川栽培区内杂交竹大量枯死(朱天辉等，2009)，其病原暗孢节菱孢菌(Arthrinium phaeospermum)产生的蛋白毒素是引起该病的主要因素(李姝江等，2012a)。前期试验表明，该蛋白毒素的作用位点在杂交竹质膜上(李姝江等，2012b)，但线粒体作为为细胞各种生理活动提供能量的细胞器，毒素对其结构和功能的影响尚缺乏直接证据。本文以四川栽培区内4个杂交竹品种嫩枝为研究对象，采用不同检测技术测定蛋白毒素对线粒体膜的流动性、表面电位、肿胀度及脂质过氧化物MDA、辅酶Q10(coenzyme Q，CoQ10)含量、线粒体呼吸功能的影响，为阐明蛋白毒素对杂交竹线粒体的作用机制以及抗感品种间的差异提供理论依据。

杂交竹品种： 3#(中抗)、6#(抗病)、8#(高感)、30#(感病)，1年生，由四川省天全县杂交竹栽培区提供。

供试菌株： 暗孢节菱孢菌，分离于杂交竹梢枯病竹，由四川农业大学森林保护实验室提供。

以改进Fries为基础培养基(张金林等，2005)，定量接种在PDA平板上培养的直径为5 mm的暗孢节菱孢菌丝块，26 ℃，140 r·min^-1震荡培养15天，双层纱布过滤后，取其滤液经透析浓缩、Sephadex G-100凝胶层析、High Q Sepharose Fast Flow 强阴离子交换层析、SDS-PAGE凝胶电泳、浸渍法(Ho et al., 1996)生物检测获得分子质量约为27 kDa的单一活性蛋白毒素(李姝江等，2012a)。

蛋白毒素溶液： 将纯化后的蛋白毒素用无菌蒸馏水稀释成10，20，30，40，50，60，70，80 μg·mL^-1的溶液。

温室盆栽1年生杂交竹40盆(3，6，8，30号4个品种，每品种10盆)，采用浸渍法(Ho et al., 1996)，取当年新抽嫩枝顶端组织(不同品种)用75% 酒精消毒10 s，再用无菌水清洗3次，然后插入保鲜膜封口的无菌1.5 mL离心管中，分别加入上述蛋白毒素溶液1 mL，以无菌水为对照。25 ℃培养箱中培养(每天光照12 h)，每处理6枝，重复3次。于72 h后对其进行线粒体的分离提取。

参照陈靠山等(1995)、Zhang等(2012)的方法： 将植物材料切碎，按1∶1.2(W/V)加进预冷的匀浆介质[50 mmol·L^-1 Tris-HCl(pH7.2)，0.3 mol·L^-1蔗糖，1 mmol·L^-1 EDTA，0.1% BSA，0.1% Cys，1% PVP]，迅速研磨，经4层纱布过滤，滤液于1 500 r·min^-1离心10 min，取上清液于10 000 r·min^-1离心30 min，沉淀即为线粒体，将其用含与不含上述蛋白毒素溶液的相应清洗介质(除不含PVP，BSA，Cys外，其他均与匀浆介质相同)悬浮到所需浓度，每处理3次重复。以上操作均在0~4 ℃条件下进行。

线粒体膜流动性采用微黏度的倒数表示，微黏度测定参照钱琼秋等(2006a； 2006b)的方法采用荧光偏振法进行。荧光分光光度计(日立850)测量荧光偏振值(P)，以360 nm激发进行平行与垂直激发，并以360 nm的滤光片除去激发波的散射光，发射波长为430 nm，记录荧光偏振值。微黏度η=2P/(0.46-P)。每处理3次重复，分别计算在蛋白毒素不同浓度(pH 7.2)处理下杂交竹嫩枝线粒体膜的微黏度。

采用中性红法进行线粒体膜表面电位的测定，按照张志鸿等(1991)的方法，测定中性红与1 mL线粒体混合后不同pH的滴定曲线(OD₅₂₀)，根据不同pH时线粒体结合中性红的量，求出中性红与线粒体结合的表现滴定曲线中点(25 ℃)，膜表面电位ψ=(7.0-pKa)×60 mV，式中pKa为表观滴定曲线的中点。pH由等离子强度的缓冲液(含0.4 mol·L^-1甘露醇)调节。每处理3次重复，计算40 μg·mL^-1蛋白毒素浓度下膜的表面电位。

参照Halestrap等(2002)的方法测定线粒体肿胀度。用紫外-可见分光光度计(岛津UV-2410PC)测定520 nm处的吸光值，测定过程保持25 ℃恒温。每处理3次重复，计算经与未经蛋白毒素处理分别在0，4，6，8，10，20 min时的肿胀度。

参照Stillwell等(1987)的方法，将0.1 mL线粒体加入含纯蛋白毒素的清洗介质中，立即测定OD₃₅₀值(分光光度计)，观察其变化。每处理3次重复，分别计算不同蛋白毒素浓度下的聚集度。

以下指标均测定40 μg·mL^-1蛋白毒素溶液处理的4个品种杂交竹嫩枝线粒体，以未经处理的杂交竹为对照，每处理设3次重复。

呼吸速率的测定采用液相氧电极(Hansatech公司Oxygraph-Lab)法(桑庄特罗，1980)，调节整合半导体控温装置为25 ℃。1.8 mL反应介质(200 mmol·L^-1蔗糖，10 mmol·L^-1Tris-Mops，10 mmol·L^-1EGTA，0.4 mol·L^-1琥珀酸，5 mmol·L^-1 KH₂PO₄，pH7.4)中加入200 μL线粒体悬浮液，以1 mmol·L^-1的琥珀酸钠为呼吸底物，加入200 nmol·L^-1的ADP产生呼吸态Ⅲ，以ADP耗尽时为呼吸态Ⅳ，氧电极测定耗氧量的变化。计算呼吸控制率RCR值(respiratory control ratio，即Ⅲ态与Ⅳ态呼吸率之比)及磷氧比(oxidative phosphorilation ratio，P/O； 即每次反应中所加入ADP量与加入ADP后线粒体氧化磷酸化所消耗的氧原子之比)。

细胞色素c氧化酶(cytochrome c oxidase，CCO)活性的测定采用Rasmusson等(1991)的方法，在紫外一分光光度计上记录OD₅₅₀值，计算CCO活性。

辅酶Q10(CoQ10)含量测定按Takada等(1984)的方法进行，用反相高效液相色谱仪系统(RP-HPLC)［ÄKTA avant 25(GE Healthcare Life Sciences，Beijing，China)测定，即用Zorbax 300SBC-18(4.6 mm×250 mm，5 μm)(Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA)柱，检测波长269 nm，流动相为3.5 g NaClO₄+50 mL甲醇+450 mL乙醇+0.5 mL 70％ HClO₄，流速1 mL·min^-1。

以脂质过氧化产物的终产物丙二醛(MDA)表示脂质过氧化水平，参照Cakmak等(1992)的方法测定。ATPase测定采用钱琼秋等(2006b)的方法，ATPase活力单位以每小时分解每毫克蛋白产生的无机磷(Pi)的量来表示，即μmol·mg^-1h^-1。

以上项目蛋白质测定中采用Bradford(1976)的方法，以BSA为标准蛋白，用紫外-分光光度计测定(岛津UV-2410PC)。

试验数据采用EXCEL和SPSS13.0软件分析处理，LSD法进行多重比较(P< 0.05)。

微黏度测定结果(图 1)表明，随毒素浓度增加，4个品种杂交竹嫩枝微黏度有不同程度的升高，因为微黏度越小，线粒体膜的流动性越大，所以蛋白毒素可以减弱杂交竹嫩枝线粒体膜的流动性。然而，不同品种间对毒素敏感性有差异： 对于感病品种8号和30号，当毒素浓度分别大于10和20 μg·mL^-1时，膜微黏度不再继续升高； 而抗病品种3号和6号，毒素浓度分别大于30和40 μg·mL^-1时，膜微黏度才保持稳定，可见蛋白毒素对线粒体膜流动性的影响有一个饱和效应。结合前期研究中“蛋白毒素40 μg·mL^-1时致病力最强”(李姝江等，2012a)的结论，以下测定指标均设定毒素浓度为40 μg·mL^-1。感病品种8#和30#在蛋白毒素浓度为20 μg·mL^-1后微黏度差异不显著，但显著高于抗病品种3#和6#，其中6#的微黏度最低。以上结果说明6#杂交竹嫩枝受蛋白毒素侵染后线粒体膜的流动性较其他3个品种大，所受的伤害最小。

图1 蛋白毒素浓度对不同杂交竹品种嫩枝线粒体膜微黏度的影响 Fig.1 Effect of protein toxin of different concentrations on the membrane micro-viscosity of mitochondria purified from the shoots of different B. pervaiabilis × D.grandis varieties 小写字母表示同一品种在不同毒蛋白浓度下在P< 0.05水平上差异显著(LSD测验)，大写字母表示同一浓度不同品种在P< 0.05水平上差异显著(LSD测验)。Different lowercase letters indicate significant differences among different protein toxin concentration in one variety by the LSD test(P< 0.05); different capital letters indicate significant differences among different varieties in the same concentration by the LSD test(P< 0.05).

从图 2可以看出，4个品种的线粒体与中性红结合的表观滴定中点不同，毒素处理与未经毒素处理的线粒体与中性红结合的滴定中点也不同，毒素处理使滴定中点明显向高pH偏移。具体来看，未处理的3号线粒体与中性红结合的滴定中点为pH 7.4，处理后升高为pH 7.6； 未处理的6#、8#、30#分别为pH 7.2，7.9，7.7，处理后分别为pH 7.4，8.25，8.0。经公式换算膜表面电位，结果见表 1。可以看出，蛋白毒素处理后显著降低各品种嫩枝线粒体膜的表面电位，但品种不同其作用也有差异。感病品种8#和30#无论毒素处理还是未处理的条件下，其膜表面电位均显著低于抗病品种，大小顺序为 6#>3#>30#>8#。分析原因可能是，8#和30#杂交竹线粒体膜自身的保护功能就较3#和6#差，因此膜表面电位低，从而影响质子泵功能，阻碍ATP生成。

	图2 不同杂交竹品种嫩枝线粒体中性红表观滴定曲线 Fig.2 Effect of protein toxin on the apparent titer curve of mitochondrion-bound neutral red in the shoots of different B. pervaiabilis × D.grandis varieties A，B，C，D：杂交竹(B. pervaiabilis × D.grandis varieties)3#，6#，8#，30#； CK-3，CK-6，CK-8，CK-30 未经蛋白毒素处理的线粒体 Mitochondria treated without protein toxin.

表1 不同杂交竹品种嫩枝线粒体膜表面电位^① Tab. 1 Surface electrostatic potential of mitochondrial membrane of the shoot of different B. pervaiabilis × D.grandis varieties

表 1不同杂交竹品种嫩枝线粒体膜表面电位① Tab.1Surface electrostatic potential of mitochondrial membrane of the shoot of different B. pervaiabilis × D.grandis varieties mV 品种Variety CK 蛋白毒素Protein toxin(40 μg·mL-1) 3# -24±0.5Bc -36±0.5Ac 6# -12±0.5Bd -24±0.5Ad 8# -54±1.0Ba -75±1.0Aa 30# -42±0.5Bb -60±1.0Ab ①CK： 无蛋白毒素处理 Treatment without protein toxin。 同列数据后不同小写字母表示同一处理不同品种在P< 0.05水平上差异显著(LSD测验)； 同行数据后不同大写字母表示同一品种不同处理在P< 0.05水平上差异显著(LSD测验)。 Data in the same column followed by different lowercase letters indicate significant differences among different varieties with the same treatment by the LSD test(P< 0.05); data in the same row followed by different capital letters indicate significant differences for one variety between different treatments by the LSD test(P< 0.05).

线粒体肿胀度增加导致浑浊，吸光度就会下降。因此，从图 3可以看出，蛋白毒素使不同杂交竹品种嫩枝线粒体肿胀度均增加，由此可以认为杂交竹受蛋白毒素胁迫后，线粒体完整性下降。但4个品种线粒体肿胀度增加幅度差异显著，8#杂交竹线粒体肿胀度最大，完整性破坏最为严重； 6#杂交竹线粒体完整性相比其余3个品种更好，这可能与品种间的抗感差异有关。

	图3 蛋白毒素对不同杂交竹品种嫩枝线粒体肿胀度的影响 Fig.3 Effect of protein toxin on the mitochondrial swelling from the shoots of different B. pervaiabilis × D.grandis varieties

从图 4可以看出，感病品种(8#和30#)在蛋白毒素浓度大于20 μg·mL^-1时，可显著降低吸光值，说明蛋白毒素可能使得线粒体表面电荷密度增加，线粒体间排斥力增强到了足以使线粒体不能相互聚集的程度，因此，感病品种线粒体更分散。但表 1中的结果显示40μg·mL^-1毒素处理可显著改变抗病品种(3#和6#)杂交竹线粒体膜表面电位，而图 4结果显示毒素处理对3，6#线粒体的聚集程度几乎无影响，表明除线粒体膜表面电位外，可能还有其他不受毒素影响的因素(如抗性品种线粒体表面电荷更稳定)可影响线粒体的聚集程度。

	图4 蛋白毒素对不同杂交竹品种嫩枝线粒体聚集度的影响 Fig.4 Effect of protein toxin of different concentrations on the mitochondrial aggregation from the shoots of different B. pervaiabilis × D.grandis varieties

在毒素胁迫下，4个品种杂交竹线粒体呼吸作用均受到一定影响(表 2)。在呼吸态Ⅲ中，4个品种与各自对照相比显著降低，抗病品种3#和6#显著高于感病品种8#和30#；而呼吸态Ⅳ呼 吸速率与各自对照相比则相对增加，4个品种间差异不显著。另外，呼吸控制率RCR明显降低，抗病品种显著高于感病品种； 呼吸作用的P/O下降，因为RCR和P/O可以反映线粒体氧化磷酸化机能，也表明线粒体结构的完整性程度，所以该蛋白毒素可严重干扰线粒体膜的氧化磷酸化偶联作用，降低氧化磷酸化并破坏完整性，且这种干扰和降低程度与杂交竹抗性有关。

表2 蛋白毒素对杂交竹嫩枝线粒体呼吸作用的影响^① Tab. 2 Effect of protein toxin on the respiration of mitochondria purified from the shoots of different B. pervaiabilis × D.grandis varieties

表 2蛋白毒素对杂交竹嫩枝线粒体呼吸作用的影响① Tab.2 Effect of protein toxin on the respiration of mitochondria purified from the shoots of different B. pervaiabilis × D.grandis varieties 项目Item 品种Variety 3# CK-3 6# CK-6 8# CK-8 30# CK-30 呼吸Ⅲ态 State Ⅲ /(nmol O2·min-1mg-1protein) 36.88±1.78c 47.38±2.48a 40.11±2.05b 47.45±1.77a 30.33±2.14d 46.25±2.02a 31.15±1.43d 46.26±1.98a 呼吸Ⅳ态 State Ⅳ /(nmol O2·min-1mgI-1protein) 27.11±1.32a 19.26±1.12b 27.47±1.15a 19.33±1.02b 26.45±1.32a 19.34±1.14b 26.98±1.24a 19.58±1.36b 呼吸控制率RCR 1.36±0.05c 2.46±0.09a 1.46±0.03b 2.46±0.05a 1.14±0.01d 1.83±0.04b 1.15±0.02d 1.81±0.03b 磷氧比P/O 1.49±0.03c 2.35±0.08a 1.75±0.04b 2.39±0.04a 1.02±0.02d 2.33±0.07a 1.13±0.02d 2.35±0.08a CCO活性CCO activity/(nmol·min-1mg-1protein) 92.46±3.32c 151.60±6.12a 115.32±4.13b 152.56±2.75a 67.56±3.16d 150.79±3.08a 69.78±3.11d 151.17±3.35a ①同行不同数据后的小写字母表示在P< 0.05水平上差异显著(LSD测验)，下同。Data in the same row followed by different lowercase letters indicate significant differences by the LSD test(P< 0.05)，the same below.

细胞色素c氧化酶(CCO)是线粒体内膜呼吸酶系的关键酶，其活性改变直接影响氧化磷酸化能力。表 2显示毒素能使4个品种中该酶活性显著降低，从而使线粒体呼吸速率下降，氧化磷酸化机能减弱。但这种趋势因杂交竹抗感性不同而有差异，抗病品种3#和6#线粒体呼吸能力受蛋白毒素影响相对较小，其呼吸功能能维持在一定水平。

对比各自的对照，毒素处理使4个品种嫩枝线粒体内CoQ10含量显著下降(图 5)。抗感品种间下降程度有明显差异，以8#和30#下降幅度最大，二者差异不显著； 6#降幅最小，与其余3个品种差异显著。因为CoQ10在高等植物中作为线粒体呼吸链的主要组成成分，并在电子传递过程中起着重要作用，因此，蛋白毒素使CoQ10含量下降说明杂交竹受侵染后电子传递能力降低，但抗病品种受影响相比感病品种小，自我保护和恢复生物膜结构功能相对要强。

	图5 蛋白毒素对杂交竹嫩枝线粒体CoQ10含量的影响 Fig.5 Effect of protein toxin on the CoQ10 content in mitochondria from shoots of different B. pervaiabilis × D.grandis varieties

毒素处理杂交竹嫩枝线粒体后，4个品种的MDA含量显著高于各自对照(图 6)。MDA是脂质过氧化作用的产物，其含量可反映脂质过氧化的强弱。从图 6可以看出，感病品种8#和30#MDA含量分别为对照的2.3和2.2倍，说明在毒素胁迫下线粒体膜脂过氧过氧化程度增加，但抗病品种2种指标增长程度相对较小。

	图6 蛋白毒素对杂交竹嫩枝线粒体MDA含量的影响 Fig.6 Effect of protein toxin on the MDA content in mitochondria from the shoots of different B. pervaiabilis × D.grandis varieties

蛋白毒素处理杂交竹嫩枝线粒体后，4个品种线粒体内的Ca²⁺-ATPase和Mg²⁺-ATPase活性均显著下降(表 3)。感病品种8#只有对照的60.71%和58.66%，而抗病品种这两种酶的活性下降程度相对较低； 6#2种酶活性分别为对照的85.89%和87.85%，且活性显著高于其余3个品种。因为ATPase与植物体内能量代谢相偶联，因此与呼吸作用密切相关。6#杂交竹嫩枝线粒体被蛋白毒素侵染后ATPase活性降幅最小，说明该品种体内能量代谢功能相对较强，呼吸作用亦较强。

表3 蛋白毒素对杂交竹嫩枝线粒体ATPase活性的影响 Tab. 3 Effect of protein toxin on ATPase activity of the mitochondria of B. pervaiabilis × D.grandis varieties shoots

表 3蛋白毒素对杂交竹嫩枝线粒体ATPase活性的影响 Tab.3Effect of protein toxin on ATPase activity of the mitochondria of B. pervaiabilis × D.grandis varieties shoots 处理 Treatment Ca2+-ATPase Mg2+-ATPase 活性Activity/ (μmol·mg-1h-1 百分比 Percent (%) 活性Activity/ (μmol·mg-1h-1 百分比 Percent (%) CK-3 52.28±0.98a 100 40.32±1.21a 100 3# 41.32±2.45c 79.04 32.26±1.46c 80.01 CK-6 52.67±0.79a 100 40.75±1.07a 100 6# 45.24±2.56b 85.89 35.80±1.27b 87.85 CK-8 51.97±1.01a 100 39.94±0.99a 100 8# 31.55±1.27d 60.71 23.43±1.34d 58.66 CK-30 52.11±1.12a 100 40.15±1.01a 100 30# 32.79±1.33d 62.92 24.11±1.10d 60.05 ①同列不同数据后的小写字母表示在P< 0.05水平上差异显著(LSD测验)。Data in the same column followed by different lowercase letters indicate significant differences by the LSD test(P< 0.05).

线粒体是植物体内重要的细胞器，是进行三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle，TCA)、脂肪酸氧化、电子传递、氧化磷酸化的重要部位(钱琼秋等，2006b)； 同时，线粒体也是氧自由基产生的主要部位，但其本身又极易受氧自由基的损伤。众所周知，毒素对寄主植物细胞可造成明显的损伤，且膜系统最易受伤害(张云霞等，2011)。在诸如水分、盐以及金属的胁迫等逆境下，寄主植物线粒体呼吸作用会产生过剩自由基，会使线粒体膜流动性下降、选择性丧失，由此可见线粒体是极易受膜脂过氧化伤害的重要部位之一(钱琼秋等，2006a； 2006b)。本试验首先从杂交竹嫩枝线粒体膜生物物理特性角度来研究梢枯病菌蛋白毒素的作用机制，从结果看，蛋白毒素胁迫使线粒体膜流动性减弱、表面电位减小、肿胀度增大、聚集度降低，说明膜结构遭到显著影响，质子泵功能被减弱，脂质体颗粒不能聚集。结合陈靠山等(1995)和钱琼秋等(2006b)的报道，该蛋白毒素可能引起了线粒体脂双层膜系统完整性的破坏以及结构的受损，从而进一步影响膜上孔道的开放程度，氧化磷酸化解偶联，一系列膜功能发生障碍。

另一方面，本试验还从线粒体呼吸作用及膜脂质过氧化角度来进一步诠释蛋白毒素对线粒体的作用机制。呼吸控制率(RCR)和磷氧比(P/O)既能反映线粒体氧化磷酸化机能，也能表明线粒体结构的完整性程度(钱琼秋等，2006b)； 细胞色素c氧化酶(CCO)作为线粒体的标志酶，其活力的发挥是维持线粒体功能、进行细胞能量代谢的关键(王苏华等，2010)； 辅酶Q10(CoQ10)是线粒体呼吸链的主要组成成分，具有保护和恢复膜完整性的重要作用(Franke et al., 2013)； MDA含量可以反映脂质过氧化的强弱； ATP酶(ATPase)被称作是能量转化的分子马达(郑燕等，2007)。本研究结果表明，蛋白毒素使线粒体的CoQ10含量下降，脂质过氧化产物MDA含量的增加，CCO、ATPase活性亦下降，呼吸控制率(RCR)和磷氧比(P/O)明显降低，说明蛋白毒素使线粒体的氧化功能发生了障碍，供磷酸化以生成ATP的能量产生受到了影响，以致ATP生成减少，导致了线粒体呼吸作用功能的降低。结合上述线粒体膜生物物理特性结果，可能是由于蛋白毒素胁迫使线粒体内的脂质过氧化产物MDA含量的增加，引起线粒体膜流动性下降，膜表面电位、膜完整性破坏，致使ATP酶活性下降。蛋白毒素对杂交竹线粒体一系列特性及功能的影响与其对杂交竹生理代谢影响之间的相关性需进一步研究。研究还发现，杂交竹抗病品种各项指标均比感病品种受蛋白毒素的影响小，线粒体完整性及功能维持相对较好，是否符合Miller等(1986)的“第三类抗性”假说，即抗病品种具有降解毒素的能力还有待更全面准确的验证。