酸雨(acid rain)是指pH低于5.6的大气降水，包括酸性雨、雪、雾、雹、霜等多种形式降水(林慧萍，2005)，又称作酸沉降(acid deposition)，包括湿沉降(如酸雨、酸雪、酸雾、酸雹)和干沉降(如二氧化硫、氮氧化物、氯氧化物等气体酸性物)(付晓萍等，2006)。

土壤中繁衍着数量巨大、种类繁多、代谢类型各异的微生物种群，它们对生态系统的能量循环和物质转化具有重要作用，同时生态环境的变化又直接或间接影响微生物种群的组成及其功能的发挥(林先贵等，2010)。土壤中有机质的降解和矿化主要通过真菌、细菌、土壤动物进行，土壤微生物是维持土壤肥力最重要的因素。因此，改变土壤微生物因素也将影响森林生态系统的功能(Baldrian et al., 2012)。土壤微生物对土壤污染具有特别的敏感性，同时它们又是降解污染物质和恢复土壤环境的先锋者(林先贵等，2008)。酸雨可引起土壤酸化，破坏土壤结构，从而影响土壤微生物和酶的活性，进而可能影响土壤的生态平衡(凌大炯等，2007)。长期的酸雨作用会导致土壤微生物总量的减少，降低土壤中微生物的活性，抑制某些微生物(如固氮菌、氨化细菌等)的生长和繁殖，使土壤中的固氮作用、氨化作用等受到抑制(杨宗慧，2002)。酸雨也会对微生物种群数量、组成、生理生化活性以及C，N，P转化的专一微生物酶活性等方面产生不利影响，导致土壤肥力下降(Copy et al., 2007)。

菌根真菌在生态系统营养循环和物质循环过程中扮演着重要角色，对植物营养获取和生长具有十分重要的作用(Agarwal et al., 2009)。外生菌根的形成可以缓解酸雨对植物的胁迫，如外生菌根菌套有物理屏蔽作用，可以促进宿主对养分的吸收、增强酶活性以及产生有机酸等物质来提高植物对逆境的抗性，增加御酸能力，提高植物生存能力(张慰等，2012)。接种外生菌根真菌能提高酸雨胁迫下马尾松(Pinus massoniana)幼苗的生长(陈展等，2013)，提高铝胁迫下马尾松叶片叶绿素和干质量的积累(谈建康等，2005)，提高酸铝胁迫下马尾松对N，K，Ca，Mg的吸收(辜夕容等，2005)。而关于外生菌根真菌对酸雨胁迫下土壤微生物的影响鲜见报道。

土壤微生物群落功能多样性是土壤微生物群落状态的指标，可以反映土壤中微生物群落的生态特征和土壤的肥力特征。BIOLOG微平板分析方法是一种群落水平的生理特性分析方法(王玲等，2009)。且BIOLOG代谢多样性类型与微生物群落组成有关，使得其对微生物群落变化较为敏感，因此广泛应用于评价土壤微生物群落的功能多样性。本文通过模拟试验，借助BIOLOG-ECO技术研究不同酸沉降处理下接种外生菌根菌后土壤微生物代谢功能的变化特征，旨在揭示外生菌根在酸沉降胁迫下对土壤微生物群落功能的改善作用。

试验在中国林业科学研究院内温室进行。设置3种不同pH［CK(5.6)，(4.5)，(3.5)的模拟酸雨强度，每个酸处理下设有接种外生菌根菌处理和未接种外生菌根菌处理，总共6个试验处理，每个处理设置30盆重复。南方酸雨的类型为硫酸型酸雨，故采用去离子水逐步稀释配制模拟酸雨，用分析纯浓H₂SO₄和浓HNO₃配制成摩尔比为5∶1的酸雨母液，然后将适量母液用去离子水稀释成pH分别为3.5，4.5和5.6(CK)预定水平的酸雨供试液，其他离子的含量为NH₄⁺ 2.67 mg·L^-1，Ca²⁺3.37 mg·L^-1，Mg²⁺ 0.33 mg·L^-1，Cl^- 1.14 mg·L^-1，K⁺0.79 mg·L^-1，Na⁺ 0.36 mg·L^-1，F^- 0.39 mg·L^-1。

试验用土壤采自重庆，pH4.96，有机质含量20.5 g·kg^-1，总氮1.18 g·kg^-1，总磷0.453 g·kg^-1，总钾14 g·kg^-1。试验采用的外生菌根菌种为中国林业科学研究院林业研究所提供的彩色豆马勃(Pisolithus tinctorius)固体菌剂，该菌剂原种彩色豆马勃菌株分离自四川马尾松林下。接种处理时将固体菌剂与土壤按1∶10的比例进行混合，同时将一部分固体菌剂在121 ℃下高压灭菌，以杀死其中的外生菌根菌，保留固体菌剂中其他固有成分，将灭菌后的固体菌剂与土壤按1∶10的比例进行混合，作为未接种外生菌根菌的土壤基质。1年生马尾松幼苗由浙江省淳安林业站提供，于2011年11月28日移栽于盆中。从2012年2月16日开始每周喷淋1次酸雨，对照喷淋去离子水，每次以浇至树叶有水滴滴下为止，试验于当年9月05日结束。

酸雨处理结束时每个处理随机选取5盆植物，采集土壤样品，用于土壤微生物代谢功能分析。

微生物代谢功能采用BIOLOG方法进行分析。即将10 g土壤加90 mL无菌的0.85%NaCl溶液在摇床上振荡30 min，然后将土壤样品稀释至10^-3，再从中取125 μL该悬浮液接种到BIOLOG-ECO板的每一个孔中，最后将接种好的板放置在25 ℃的恒温培养箱中暗室培养，每隔24 h在波长为590 nm的BIOLOG读数器上读数，培养时间共168 h。

孔的平均颜色变化率(average well colour development，AWCD)(Garland et al., 1991)计算公式如下:

培养基的丰富度(richness)指数指被利用的碳源的总数目，为每孔中C-R 的值大于 0.2 的孔数，多样性(diversity)指数采用Shannon-Wiener指数(H′):

利用SPSS 17对144 h的数据进行主成分分析，对群落微生物代谢活性、多样性及碳源利用情况进行方差分析。

随着培养时间的变化，ECO板的颜色也发生变化。AWCD是反映土壤微生物活性，即利用单一碳源能力的一个重要指标(Zabinski et al., 1997)。从图 1可以看出，与对照处理相比，酸雨处理降低了土壤微生物的AWCD值，而pH4.5和pH3.5的酸雨处理下接种外生菌根菌提高了AWCD值。虽然酸雨处理抑制了土壤微生物活性，但接种外生菌根菌后提高了土壤的缓冲能力，缓解了酸雨的抑制作用，使得土壤微生物活性有所恢复。

	图1 不同处理下马尾松幼苗土壤微生物BIOLOG碳源的AWCD Fig.1 AWCD in soil microbiology under different treatments

从图 2可以看出，对照处理下接种外生菌根菌后降低了土壤微生物对3类主要碳源(糖类、羧酸类和氨基酸类)的利用； pH4.5酸雨处理下接种外生菌根菌增加了土壤微生物对糖类和氨基酸类物质的利用； pH3.5酸雨处理下接种外生菌根菌提高了土壤微生物对糖类、羧酸类和氨基酸类3类碳源的利用。双因子分析结果表明：酸雨和外生菌根菌对糖类的利用存在显著的交互影响，主要表现在未接种外生菌根菌时pH4.5处理下糖类利用率显著低于对照处理，而接种外生菌根菌后三者之间没有显著差异； 酸雨和外生菌根菌对羧酸类物质的利用也存在显著交互影响：未接种外生菌根菌时pH3.5处理下土壤微生物对羧酸类的利用明显低于对照和pH4.5处理，而接种外生菌根菌后pH3.5处理下土壤微生物对羧酸类的利用显著高于对照，但与接种外生菌根菌的pH4.5处理无显著差异； 酸雨和外生菌根菌对氨基酸的利用交互作用显著，未接种外生菌根菌时pH4.5和pH3.5处理显著降低了土壤微生物对氨基酸类物质的利用，而接种外生菌根菌后3个酸处理下氨基酸利用率没有差异。

图2 接种外生菌根菌对酸雨处理下土壤微生物主要碳源利用的影响 Fig.2 Effects of ectomycorrhizal fungi on utilization of three main carbon sources of soil with different acidic treatments under masson pine 酸雨和外生菌根菌双因子方差分析结果The results of double factor(acid rain and ectomycorrhizal fungi)analysis. 糖类Carbohydrates: 酸雨Acid rain，NS; 外生菌根Ectomycorrhizal fungi，NS; 酸雨Acid rain× 外生菌根Ectomycorrhizal fungi，＊＊. 羧酸类Carboxylic acids: 酸雨Aacid rain，NS; 外生菌根Ectomycorrhizal fungi，NS; 酸雨Acid rain×外生菌根Ectomycorrhizal fungi， ＊＊; 氨基酸类Amino acids: 酸雨Acid rain， ＊＊＊;外生菌根Ectomycorrhizal fungi， ＊＊＊;酸雨Acid rain× 外生菌根Ectomycorrhizal fungi， ＊＊＊. ＊＊＊:P<0.001; ＊＊:P<0.01; *:P<0.05; NS: 不显著No significance. 相同字母表示在所有处理间无显著性差异，不同字母表示 存在显著性差异(P<0.05)。 Bars with the same letter indicate no significant difference among treatments，while the different letters，significant difference(P<0.05).

未接种外生菌根菌的处理中，与对照相比，pH4.5酸雨处理对土壤微生物多样性指数和丰富度指数没有显著影响，pH3.5酸雨处理则显著降低了土壤微生物多样性指数和丰富度指数。对照和pH4.5处理下接种外生菌根菌对土壤微生物的多样性指数和丰富度指数没有影响。与对照相比，强酸处理(pH3.5)显著降低了土壤微生物的多样性指数和丰富度指数，但接种外生菌根菌后显著提高了pH3.5处理下土壤微生物的多样性指数和丰富度指数(表 1)。

表1 接种外生菌根对酸处理下马尾松幼苗土壤微生物多样性的影响 Tab.1 Effects of ectomycorrhizal fungi on richness and diversity of soil microbial community under different treatments

表 1接种外生菌根对酸处理下马尾松幼苗土壤微生物多样性的影响 Tab.1Effects of ectomycorrhizal fungi on richness and diversity of soil microbial community under different treatments 处理Treatment H′ 丰富度指数 Richness index CK 1.39 0.00a 25.67 0.33a CK+EcM 1.36 0.00a 24.33 0.88a pH4.5 1.39 0.01a 24.33 0.88a pH4.5+EcM 1.38 0.01a 25.00 1.00a pH3.5 1.31 0.03b 20.33 0.33b pH3.5+EcM 1.37 0.00a 24.67 0.33a 酸处理 Acid treatment ＊ ＊＊ 外生菌根 Ectomycorrhizal fungi NS NS 酸处理×外生菌根 Acid treatment× Ectomycorrhizal fungi ＊＊ ＊＊

酸雨处理和外生菌根对土壤微生物代谢多样性和丰富度指数都存在明显的交互作用。未接种外生菌根菌的不同酸雨处理下，强酸处理(pH3.5)下多样性指数和丰富度指数都显著低于对照和pH4.5处理，而接种外生菌根菌后不同酸处理下多样性指数和丰富度指数没有显著差异。

主成分分析结果表明，酸雨胁迫下接种外生菌根菌后马尾松幼苗土壤微生物碳源利用的2个主成分分别解释了变异量的22.9%和17.8%(图 3)，各处理间土壤微生物碳源利用方式在主成分1和主成分2上均存在显著差异(F=21.386，P<0.000 1 for PC1； F=22.624，P<0.000 1 for PC2)。这说明接种外生菌根菌后改变了酸雨胁迫下马尾松幼苗土壤微生物对碳源的利用方式。与主成分1显著相关的碳源共有13种，除3种氨基酸外，糖类、羧酸类、胺类、聚合物及其他物质各2种； 与主成分2显著相关的碳源则较少，只有1种糖类、2种氨基酸和2种羧酸类物质(表 2)。

	图3 不同处理下马尾松幼苗土壤微生物碳源利用主成分分析(碳源编号同表 2) Fig.3 Principal component analysis of carbon source utilization pattern distinguished between masson pine soils with different treatments(Code of carbon source same with Tab.2)

表2 BIOLOG分析中与PC1和PC2显著相关的培养基 Tab.2 Substrates with high correlation coefficients for PC1 and PC2 in PCA analysis of diversity patterns for each treatment

表 2BIOLOG分析中与PC1和PC2显著相关的培养基 Tab.2Substrates with high correlation coefficients for PC1 and PC2 in PCA analysis of diversity patterns for each treatment PC1 PC2 碳源编号Code 碳源Carbon source r 碳源编号 Code 碳源Carbon source r 糖类 Carbohydrates 糖类 Carbohydrates C2 I- 赤藻糖醇I-erythritol -0.515* G1 D-纤维二糖D-cellobiose 0.745** H1 a-D-乳糖a-D-lactose 0.766** 羧酸类Carboxylic acids 羧酸类Carboxylic acids B3 D-半乳糖醛酸 D-Galacturonic acid 0.551* B1 丙酮酸甲脂 Carboxylic acids -0.510* H3 D-苹果酸 D-malic acid 0.758** E3 y-羟基丁酸 y-hydroxybutyric acid 0.757** 氨基酸 Amino acids 氨基酸Amino acids C4 L-苯基丙氨酸L-phenylalanine 0.616** E4 L-苏氨酸L-threonine 0.591** D4 L-丝氨酸 L-serine -0.682** F4 甘氨酰-L-谷氨酸 Glycyl-L-glutamic acid 0.522* F4 甘氨酰-L-谷氨酸 Glycyl-L-Glutamic Acid -0.734** 胺类Amides/amines G4 苯乙基胺Phenylethyl-amine 0.586* H4 腐胺Putrescine -0.519* 其他 Miscellaneous C3 2-羟苯甲酸 2-hydroxy benzoic acid -0.528* D3 4-羟基苯甲酸 4-hydroxy benzoic acid -0.495* 聚合物 Polymers D1 吐温80 Tween 80 -0.810** E1 a- 环式糊精a-cyclodextrin 0.628**

BIOLOG 代谢多样性类型与微生物群落组成相关(Haack et al., 1995)，使得其对功能微生物群落变化较为敏感(Rogers et al., 2001)。BIOLOG方法已广泛应用于评价土壤微生物群落的功能多样性： 不同土地利用类型下的土壤(Bossiov，2005; Xue et al., 2008)； 不同管理策略下的农业土壤(Zak et al., 1994; Bossio et al., 1995; Wang et al., 2007)； 不同环境胁迫下的土壤，如酸雨胁迫(Pennanen et al., 1998a;1998b)、臭氧胁迫(陈展等，2007； Chen et al., 2009; 2010)、重金属胁迫(陈承利，2006)； 接种菌根真菌的土壤(张海涵，2008)。但利用BIOLOG方法评价酸沉降胁迫下接种外生菌根真菌后土壤微生物功能多样性的研究未见报道。

通过相同的试验，笔者也研究了外生菌根真菌对酸雨处理下马尾松生长和营养的影响，接种外生菌根真菌提高了强酸处理(pH3.5)下马尾松幼苗的生物量，有利于马尾松幼苗的生长，外生菌根真菌抵消了酸雨胁迫对马尾松生长的影响(陈展等，2013)； 且接种彩色豆马勃提高了酸雨处理下马尾松幼苗土壤pH、交换性Ca、Mg和阳离子交换总量，菌根化幼苗土壤中交换性Al含量明显降低，提高了土壤对酸雨的缓冲能力； 而且菌根化幼苗中植株叶片和根系中的P，K，Mg含量均高于未菌根化幼苗，提高了植株对营养元素的吸收能力，有利于各元素之间的平衡(陈展等，2014)。上述关于接种外生菌根菌对马尾松生长、营养、土壤质量影响的研究结果与本研究关于土壤微生物的研究结果是一致的。本研究试图用BIOLOG功能多样性来反映接种菌根真菌对酸雨胁迫下马尾松幼苗土壤细菌群落的影响，其中平均颜色变化率(AWCD)反映了土壤微生物利用碳源的整体能力及微生物活性，丰富度指数和多样性指数反映了微生物利用碳源的数量及其功能多样性(代谢多样性)。酸雨的pH是土壤中许多微生物生长的主要制约因素，因为大多数细菌和放线菌生长在较窄的pH范围内，其最适pH范围在中性附近，在低pH的范围时生长明显受到抑制； 尽管真菌适合在微酸性环境中生长，但据张德明等(1998)的研究表明酸雨的低pH使一些分解有机碳和氮的真菌受到明显遏制，从而导致活性降低多样性减少。本研究结果也证实了强酸胁迫导致土壤微生物活性降低、多样性减少，但菌根真菌的存在缓解了酸雨的影响，这是因为菌根真菌提高了马尾松幼苗土壤交换性阳离子总量，提高了土壤对酸雨的缓冲能力(陈展等，2013)，缓解了酸雨的抑制作用，使得土壤微生物活性有所恢复。在对照处理下接种外生菌根真菌降低了土壤微生物的活性以及对羧酸类、氨基酸类和糖类物质的利用。这可能是因为本研究中对照处理的pH是5.6，偏酸性，而一定程度的酸性降水可以刺激土壤中一些偏酸性的细菌活性，但接种外生菌根真菌中和了低酸降水(CK，pH5.6)对土壤的刺激作用。而在强酸胁迫下，接种外生菌根真菌能提高土壤微生物活性(AWCD)，提高土壤微生物对羧酸类、氨基酸类和糖类物质的利用，同时提高代谢多样性，改变碳源利用结构。这应该是由于接种外生菌根菌后提高了强酸胁迫下马尾松幼苗土壤的pH，提高了土壤中P，K含量，改善了土壤环境(陈展等，2014)，有利于土壤微生物能更好地发挥其代谢功能，从而表现出较高的碳源利用率和代谢多样性。菌根真菌能通过改变根际土壤的pH以及根际营养等方面来调节根际微生物的种群和数量，表现出较明显的根际效应(Petra et al., 2003)； 根际微生物又能通过自身的分泌物提高菌根真菌对寄主植物的侵染率，促进菌根的形成和生长。Van Hees等(2005)也认为菌根植物有较强的分泌柠檬酸、甲酸、丙二酸和草酸的能力。Rogers等(2001)认为，菌根可能通过改变 pH和分泌物的组分来改变根际微环境。

接种外生菌根真菌缓解了酸雨胁迫对土壤微生物的影响，有利于酸雨胁迫下土壤肥力的保持，可见，给树苗接种外生菌根真菌是缓解酸铝毒害的一种有效方法。