植物体细胞胚胎发生技术是利用植物细胞工程手段实现植株再生的重要途径之一，在针叶树种的快速繁殖过程中，通常被认为是一种最具生产潜力和商业前景的植物无性繁殖技术(Klimaszewska et al., 2007; Rose et al., 2010)。一个完整的体细胞胚胎发生过程包括胚性愈伤组织的诱导、增殖和成熟体细胞胚的分化、萌发4个阶段(Stasolla et al., 2003)； 其中，成熟体细胞胚的萌发阶段作为整个技术体系的最后一步，体细胞胚萌发率及萌发质量的高低直接决定着最终体胚苗的收获量和整个体胚技术体系构建的成败(Joshi et al., 2013)。目前，在针叶树体细胞胚萌发阶段，为提高体细胞胚的萌发率和萌发质量，国外常用的方法是将体细胞胚萌发之前进行干化(desiccation)预处理。通常，失水现象是体细胞胚由成熟阶段向萌发阶段转变的最直接响应，可以促使体细胞胚由形态成熟向生理成熟转变，因此，对体细胞胚而言，给予适当的干化失水处理，不仅能够抑制体细胞胚的提早萌发，还能够提高萌发阶段中的萌发率和质量(von Arnold et al., 2008)。

一般根据体细胞胚失水速率的变化，可以将体细胞胚的干化处理方法分为完全干化(full desiccation)和部分干化(partial desiccation)2种(Hay et al., 1999)； 前者主要由渗透压调节物质实现，而后者主要通过水蒸气变化调节。由于渗透物质进行干燥处理时无菌环境不易实现，因此目前国外常用的干化处理方法主要为部分干化方法。已经证实，采用部分干化方法对体细胞胚进行预处理后，能够极大提高大量针叶树种体细胞胚的萌发率，包括欧洲云杉(Picea abies)(Find，1997; Högberg et al., 1998; Bozhkov et al., 1998)、红云杉(Picea rubens)(Harry et al., 1991)、白云杉(Picea glauca)(Attree et al., 1991; Kong et al., 1995)、黑云杉(Picea mariana)(Beardmore et al., 1995)、高加索冷杉(Abies nordmanniana)(Hörgaard，1997)、杂种落叶松(Larix × leptoeuropaea)(Lelu et al., 1994)、展叶松(Pinus patula)(Jones et al., 2001)、黑松(Pinus thunbergii)、赤松(Pinus densiflora)、 Pinus arm and ii var. amamiana(Maruyama et al., 2012)。尽管干化处理能够有效提高萌发率，然而影响干化处理效果的因素有很多： 干化方法的差异、干化处理持续的时间、树种的不同，甚至相同树种不同基因型之间对相同干化处理的响应都存在很大差异。因此继续采用单一的干化处理条件，已经不能够满足体细胞胚萌发的需要。

云杉(Picea asperata)为我国特有种，同时也是云杉属树种中分布较广的树种，具有重要的工业价值(中国植物志编辑委员会，1978; 四川省云杉纸浆材协作组，2001)。在过去2年，本实验室建立了较为完善和高效的云杉体细胞胚胎发生技术体系。本文以云杉分化产生的高同步化体细胞胚为研究对象，针对体细胞胚萌发率极低和萌发质量不高的问题，首次报道了一种云杉体细胞胚的干化处理技术，并对其普遍适用性进行讨论，提出了一种基于体细胞胚形态和颜色变化的干化标记。这种标记排除了其他一切干化影响因子的干扰，能够极大提高体细胞胚的萌发效率，为最终实现体细胞胚的工厂化育苗奠定坚实的基础。

云杉高同步化的体细胞胚通过2种方式获得： 一种是对建立起悬浮增殖体系的细胞系1921和1931而言，将悬浮增殖的胚性愈伤组织按照静置体积和无激素添加的液体培养基体积比1∶3的比例混合，取摇匀的培养基5 mL放置在滤纸(Whatman^TM2)上，用布氏漏斗抽滤后，将附有愈伤组织的滤纸转接到分化培养基上培养； 另一种是对于半固体增殖的细胞系1113，1911，1921，2322，2614和2711而言，将转接增殖2周后的胚性愈伤组织直接平铺到滤纸上，随后在分化培养基上培养。2种方式采用相同的分化培养基和培养条件； 培养基成分为1/2 LM(Litvay et al., 1985)+ 脱落酸(ABA，过滤灭菌，Gibco#)16 mg·L^-1 + PEG4000(Merck#)50 g·L^-1 + 蔗糖30 g·L^-1 + 活性炭(Sigma#)1 g·L^-1 + 凝胶(gellan gum，Sigma#)4 g·L^-1，附加谷氨酰胺(过滤灭菌，Sigma#)500 mg·L^-1、水解酪蛋白(Sigma#)1g·L^-1。pH 5.8，(24±1)℃黑暗培养，7周后分化产生的成熟体细胞胚作为试验材料。

以1921悬浮增殖系分化的体细胞胚为材料，采用目前国外常用的“滤纸桥法”(Gemperlova et al., 2009)、“空培养皿法”(von Arnold et al., 2008)和本实验室建立的“滤纸容器法”进行3种干化方法的比较。 1)“滤纸桥法”即将体细胞胚放置在塑料培养皿(35 mm×12 mm)中，随后将塑料皿放置在更大的玻璃培养皿(87 mm×15 mm)内，玻璃皿中放置10 mL无菌水，用2层湿润滤纸覆盖在塑料皿上做成滤纸桥，最后玻璃皿用封口膜封口。2)“空培养皿法”操作同“滤纸桥法”，只是不做滤纸桥。3)“滤纸容器法”即将发育完全的体细胞胚放置在垫有2层滤纸的塑料培养皿(35 mm×12 mm)中，随后将塑料皿放置在更大的玻璃培养皿(87 mm×15 mm)内，玻璃皿中放置10 mL无菌水，这样使得体细胞胚处于一面相对干燥四周相对湿润的环境中，玻璃皿用封口膜封口。每种干化方式5次重复，每个重复30个体细胞胚，一个塑料皿一重复。随后，将这3种方法干化处理的体细胞胚放置在15 μmol·m^-2s^-1的弱光下培养2周，观察塑料皿内体细胞胚的形态和颜色变化。

以1931悬浮增殖系分化的体细胞胚为材料，采用“滤纸容器法”干化方式，干化处理0，1，4，7，14，21天后，分别进行萌发。每个处理设置5次重复，1个塑料皿放置30个发育完整的体细胞胚作为1个重复。萌发培养基为1/4LM + 蔗糖20 g·L^-1 + 凝胶6 g·L^-1 + 活性炭1 g·L^-1，附加谷氨酰胺500 mg·L^-1、水解酪蛋白1 g·L^-1。pH 5.8，(24±1)℃黑暗培养1周，随后转到20 μmol·m^-2s^-1光下培养，3周后统计正常萌发的体细胞胚数量。

以半固体增殖的细胞系1113，1911，1921，2322，2614和2711分化的体细胞胚为材料，用“滤纸容器法”干化方式，干化处理0天和14天后，分别进行萌发。每个处理设置5次重复，1个塑料皿放置30个发育完整的体细胞胚作为1个重复。萌发培养基和培养条件同1.2.2。

以1921和1931悬浮增殖系分化的体细胞胚及1113，1911，1921，2614和2711半固体增殖分化的体细胞胚为材料，采用“滤纸容器法”干化方式，干化处理14天后，根据干化处理后的形态和颜色变化，将体细胞胚分为2种类型：无颜色变化型，绿色子叶、胚轴和红色胚根型。分别将这2种类型的胚进行萌发，每个处理设置4次重复，1个塑料皿放置30个发育完整的体细胞胚作为1个重复。萌发培养基和培养条件同1.2.2。

最高失水率(%)=(未经干化处理的体细胞胚鲜质量－干化处理后最低含水率时体细胞胚的鲜质量)/体细胞胚的鲜质量×100%； 萌发率(%)=正常萌发的体细胞胚数量/参试萌发的体细胞胚数量×100%。 使用SPSS16.0的Duncan法进行多重比较，所有百分率数据分析前先进行反正弦转换。

3种干化方法处理后的体细胞胚表现见表 1。“滤纸桥法”由于使得体细胞胚周围的湿度过大，培养皿中的胚多数被水浸泡，这种处理方式重复性较差，且操作较为繁琐，经验性较强，滤纸桥稍处理不当，就容易导致干化失败。相比之下，“空培养皿法”尽管没有使得胚被水浸泡的风险，但是干化处理2周后发现，重复间的体细胞胚无明显颜色变化； 对水分测定发现，在干化处理1天时，胚的最高失水率只有15.75%，随后含水率逐渐升高； 结合后期胚萌发的标记需要，对云杉体细胞胚干化而言，“空培养皿法”同样不适用。“滤纸容器法”处理后的体细胞胚颜色变化明显，刚从分化培养基中分离的体细胞胚呈淡黄色，子叶明显，胚轴粗壮(图 1a，d)； 在干化处理1天时，胚的失水率占鲜质量的23.72%，占总含水量的41.83%； 随着干化时间的延长，胚的含水量逐渐升高，伴随着水分的变化，胚轴不断伸长变粗，干化处理1周后，胚根部逐渐变红(图 1b，e)； 随后子叶和胚轴开始变绿，干化处理2周后，绿色子叶和胚轴的胚明显增多(图 1c，f)，继续干化处理颜色不再明显变化。

表 1 3 种干化方法处理后的体细胞胚表现 Tab.1 Somatic embryo performance after drying treatment with three approaches

表 1 3 种干化方法处理后的体细胞胚表现 Tab.1 Somatic embryo performance after drying treatment with three approaches 干化方法 Drying method 最高失水率 Highest water loss rate(%) 处理2周后体细胞胚表现 Embryo performance after drying for 2 weeks 滤纸桥法 Paper bridge method — 体细胞胚颜色无变化； 培养皿中湿度较大，60%的胚被水浸泡； 重复性差No color change, high humidity in petri dish, more than 60% were soaked, poor reproducibility 空培养皿法 Empty petri dish method 15.75 干化过程中体细胞胚颜色无明显变化； 胚水分丢失少； 重复性较好No obvious color change during partial desiccation, less water loss, reproducible 滤纸容器法Paper vessel method 23.72 体细胞胚形态分化和颜色变化明显； 胚水分丢失多； 重复性很好Obvious morphological differentiation and color change, more water loss, good repeatability

	图 1 云杉体细胞胚的干化过程和萌发 Fig.1 Partial desiccation process and germination of P． asperata somatic embryos

由表 2可知，云杉体细胞胚不经干化处理时萌发率极低，干化处理时间对云杉体细胞胚的萌发具有极显著(P < 0.01)的影响。随着干化时间的延长，体细胞胚的萌发率逐渐提高。干化处理14天时，体细胞胚的萌发率最高可以提高52.15%； 继续进行干化处理21天时，体细胞胚萌发率显著降低。说明干化处理2周能够有效地提高云杉体细胞胚的萌发。

表 2 干化处理时间对云杉体细胞胚萌发的影响^① Tab.2 Effect of partial desiccation time on somatic embryo germination of P． asperata

表 2 干化处理时间对云杉体细胞胚萌发的影响① Tab.2 Effect of partial desiccation time on somatic embryo germination of P． asperata 干化处理时间 Partial desiccation time/d 萌发率 Germination rate(±SD)(%) 0 4.67±1.83 a 1 7.34±2.80 ab 4 14.00±2.82 b 7 24.68±3.93 c 14 56.83±8.25 d 21 33.50±12.09 e ①同一列中不同字母表示0.05水平差异显著，相同字母表示差异不显著。下同。Means within a column followed by different letters show significant difference from each other at a level P =0.05, and same letters indicate no significant difference. The same below.

为了确定干化处理对云杉体细胞胚萌发的促进作用是否具有普遍性，挑选另外6个细胞系的体细胞胚分别干化0天和14天对比萌发。结果(表 3)表明，体细胞胚不经过干化预处理而直接进行萌发时，萌发率极低或者不能够正常萌发； 而经过干化14天的处理后，不同细胞系间体细胞胚的萌发率均得到极显著的提高。此外，经过干化预处理后，不同细胞系间体细胞胚的萌发率存在极显著的差异(P < 0.01)，萌发率提高从30.79%到62.96%不等。因此，在不同细胞系间，干化处理对云杉体细胞胚萌发的促进作用均具有普遍性。然而，对于部分细胞系产生的体细胞胚而言，这种促进作用依旧有限，并不能满足实际生产的需要，推测可能由不同细胞系所需要的干化条件存在差异所导致。因此，为了提高云杉体细胞胚的萌发质量，开发一种不依赖外界条件的干化标记显得尤为必要。

表 3 干化处理对云杉不同细胞系间体细胞胚萌发的影响 Tab.3 Effect of partial desiccation on different lines somatic embryos germination of P． asperata

表 3 干化处理对云杉不同细胞系间体细胞胚萌发的影响 Tab.3 Effect of partial desiccation on different lines somatic embryos germination of P． asperata 细胞系Lines 萌发率Germination rate(±SD)(%) 对照 CK 干化2周 Drying for two weeks 1113 0 53.37 ± 8.04 bc 1911 0 42.05 ± 7.81 ab 1921 0.67 ± 0.58 31.46 ± 9.92 a 2322 0 47.89 ± 8.82 b 2614 0 62.96 ± 4.17 c 2711 0 47.90 ± 8.47 b

针对干化处理对云杉体细胞胚萌发率提高不同步的问题，同时为了进一步提高萌发率，根据干化处理过程中体细胞胚形态和颜色的变化情况，将干化处理14天后的体细胞胚(图 2a)分为2种类型： 颜色无变化型(图 2b)，绿色子叶、胚轴和红色胚根型(图 2c)。形态学观察发现，颜色无变化型的体细胞胚多细小。萌发结果见表 4。具有标记的体细胞胚的萌发率极显著提高，平均达到83.63%，且在不同细胞系间差异不显著(P > 0.05)； 同时，标记后的体细胞胚萌发的同步性极大提高(图 1g)，萌发的体胚苗生长健壮，子叶伸展、胚轴直立、胚根粗壮(图 1h)。尽管无变化型的体细胞胚在不同细胞系间的萌发率存在极显著差异(P < 0.01)，但是萌发率普遍很低，平均只有18%； 此外，萌发苗畸形率较高，生根后不能继续生长。说明干化处理后的体细胞胚，绿色子叶、胚轴和红色胚根型，其体细胞胚具有较高的萌发率和较好的萌发质量，以此作为云杉体细胞胚高萌发能力的标记，能够满足实际生产的需要。

	图 2 云杉体细胞胚的干化标记 Fig.2 Desiccation indicator of P． asperata somatic embryos a． 干化14 天后，体细胞胚的干化状态; b． 干化14 天后，无明显变化的体细胞胚; c． 干化14 天后，绿色子叶、胚轴和红色胚根型的体细胞胚 a． After drying for 14 days，somatic embryos of P． asperata; b．After drying for 14 days， somatic embryos without significant changes; c． After drying for 14 days，somatic embryos with green cotyledon，hypocotyl，and red radical．

表 4 具有干化标记的云杉体细胞胚在不同细胞系间的萌发比较 Tab.4 Germination comparison of marked somatic embryos among different lines in P． asperata

表 4 具有干化标记的云杉体细胞胚在不同细胞系间的萌发比较 Tab.4 Germination comparison of marked somatic embryos among different lines in P． asperata 细胞系 Lines 萌发率 Germination rate(±SD)(%) 颜色无变化型 No color changes 绿色子叶、胚轴和红色胚根型 Green cotyledon, hypocotyl, and red radicle 1113 32.06 ± 17.22 d 90.43 ± 11.86 1911 15.02 ± 5.06 abc 74.63 ± 6.43 1921 22.51 ± 2.21 bcd 81.26 ± 11.67 1931 23.45 ± 3.66 cd 91.64 ± 27.58 2614 6.67 ± 2.90 a 86.77 ± 5.99 2711 8.37 ± 10.47 ab 77.06 ± 12.31 均值 Mean 18.00 ± 6.92 83.63 ± 12.64

植物体细胞胚胎发生过程中，体细胞胚的大量正常萌发，是实现体胚苗工厂化生产的关键。本研究表明，云杉体细胞胚直接萌发时，体细胞胚的萌发率极低或者不能正常萌发，而经过适当的干化处理以后，能够极显著地促进萌发，说明在云杉体细胞胚萌发之前，进行适当的干化处理对后期萌发来说至关重要。

分化培养基上产生的体细胞胚往往只能达到形态学上的成熟，而体细胞胚的正常萌发需要处于生理成熟状态，干化处理的实质正是促进这种形态学成熟向生理成熟转变的一个过程(Hay et al .，1999; Stasolla et al., 2004)。在体细胞胚的干化过程中，干化持续的时间在不同树种之间具有明显的差异，甚至同一树种的不同基因型之间亦不相同。Harry等(1991)对红云杉体细胞胚分别干化处理3天和6天后，体细胞胚的萌发率分别为94%和85%，而对照只有48%。对白云杉体细胞胚干化处理10天后萌发率极显著提高，而对照不能正常萌发或萌发率极低(Kong et al., 1995)。对欧洲云杉体细胞胚干化2周后的萌发结果表明，在相同家系来源的不同细胞系间，体细胞胚的萌发率存在极显著差异(Högberg et al., 1998)。Jones等(2001)研究表明，干化处理4周最有利于展叶松体细胞胚的萌发。对黑松、赤松和Pinus arm and ii var. amamiana 的体细胞胚进行干化处理3周后，平均萌发率较对照提高4倍以上； 然而，干化处理后不同树种间萌发率提高的程度差异很大，相同树种不同家系间的萌发率由55%到94%不等(Maruyama et al., 2012)。

可以看出，尽管干化处理能够显著提高体细胞胚的萌发率，然而相同处理在不同树种间效应差异明显，尤其是相同树种不同基因型乃至细胞系间都存在显著差异。在云杉体细胞胚干化处理促进萌发过程中同样存在这种不同步的问题。这说明仅从干化处理的方式和时间水平上并不能满足所有细胞系的萌发需要。干化处理后，以绿色子叶、胚轴和红色胚根作为干化标记，不仅能够普遍获得较高的萌发率(平均83.63%)和较好的萌发质量，同时也可以避免干化处理的盲目性。由于不同系号的体细胞胚在干化处理过程中都会变色，因此在云杉体细胞胚萌发前进行干化处理时，以绿色子叶、胚轴和红色胚根型的体细胞胚作为一种干化标记，不仅具有广泛的适用性，同时由于颜色变化容易观察，对云杉体细胞胚干化而言，还具有高效性。

目前，国内外尚未有其他针叶树种开展过有关体细胞胚的干化标记研究，本研究提供了一种云杉简单高效的体细胞胚干化处理技术，有可能为其他相关树种的体胚发生研究提供借鉴。今后可以尝试开展云杉属其他树种的干化标记研究，观察是否同样存在类似云杉的标记研究策略。