林业科学  2014, Vol. 50 Issue (6): 125-130   PDF    
DOI: 10.11707/j.1001-7488.20140616
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文章信息

王志龙, 林立, 王国良, 祝志勇, 徐湾湾
Wang Zhilong, Lin Li, Wang Guoliang, Zhu Zhiyong, Xu Wanwan
红枝鸡爪槭枝枯病病原鉴定及防治
Identification of Pathogen and Control of Acer palmatum ‘Sangokaku’ Branch Blight
林业科学, 2014, 50(6): 125-130
Scientia Silvae Sinicae, 2014, 50(6): 125-130.
DOI: 10.11707/j.1001-7488.20140616

文章历史

收稿日期:2014-02-28
修回日期:2014-04-03

作者相关文章

王志龙
林立
王国良
祝志勇
徐湾湾

红枝鸡爪槭枝枯病病原鉴定及防治
王志龙1, 林立1, 王国良2, 祝志勇1, 徐湾湾3    
1. 宁波城市职业技术学院景观生态环境学院 宁波市园林植物开发重点实验室 宁波 315502;
2. 浙江万里学院生物与环境学院 宁波 315100;
3. 余姚第二职业技术学校 余姚 315430
摘要:为了明确浙江省红枝鸡爪槭枝枯病的病原种类,在浙江省四明山区域采集红枝鸡爪槭枝枯病样品,以组织分离法进行病原物的分离培养,对分离得到的炭疽病菌落进行纯化和单菌丝段分离后,以形态学为基础,参照Sutton分类系统进行鉴定。结果表明:从病样中共分离到6个炭疽病菌菌株。菌株的分生孢子圆柱形,单孢无色,具1个油球,两端钝圆,大小(18.23~11.76) μm×(4.46~2.94) μm(平均14.79 μm×4.06 μm);附着孢淡褐色,近圆形或不规则形,边缘平滑,大小为8.67 μm×4.52 μm,与胶孢炭疽病菌相似。按照柯赫氏法则对红枝鸡爪槭植株上的当年生枝进行致病性测定,证实胶孢炭疽菌对红枝鸡爪槭的致病性。将菌株Z92011的rDNA-ITS序列与GenBank 中相关菌株的ITS序列进行同源性比较,与胶孢炭疽病菌的同源性达到100%。确定浙江省红枝鸡爪槭枝枯病的病原菌为胶孢炭疽病菌。试验表明用40%咪鲜胺乳油800倍液喷雾防治效果达92.6%。
关键词红枝鸡爪槭    枝枯病    病原菌    胶孢炭疽菌    防治    
Identification of Pathogen and Control of Acer palmatum ‘Sangokaku’ Branch Blight
Wang Zhilong1, Lin Li1, Wang Guoliang2, Zhu Zhiyong1, Xu Wanwan3    
1. College of Landscape & Environmental Sciences, Ningbo Vocational Technical School Key Laboratory of Landscape Plant Utility of Ningbo Ningbo 315502;
2. College of Biological & Environmental Sciences, Zhejiang Wanli University Ningbo 315100;
3. Yuyao Second Occupation Technical School Ningbo 315430
Abstract: To explore the pathogens of branch blight of Acer palmatum ‘Sangokaku’ in Zhejiang province,The infected samples were collected from Siming mountain area of Zhejiang in September 2013. The pathogens were isolated by tissue isolation method from blighted A. palmatum‘Sangokaku’ branch and cultured on standard medium. The obtained colonies were identified as Colletotrichum according to the taxonomic system of Sutton B C after being subcultured and single hyphal fragment. The results showed that the six isolates were obtained from the sampling sites. Their conidia were cylindrical, colorless single spore, with one oil ball, blunt ends, ranged from (18.23-11.76) μm × (4.46-2.94) μm (average 14.79 μm × 4.06 μ m). The appressoria were nearly round or irregular in shape, edge smoothing, pale brown, average 8.67 μm × 4.52 μ m. Conidia and appressoria were similar with Colletotrichum gloeosporioides in shape and size. Pathogenicity tests were performed by strain Z920121. After inoculation, the same branch blight was observed in 23 days on 100% of inoculated branches. DNA was directly extracted from the mycelium of Z920121 grown on PDA for 10 days. The identities of the isolates were confirmed by ITS1-5.8S-ITS2 rDNA sequence (GenBank Accession No. KF787111) analysis that showed 100% sequence similarity to C. gloeosporioides. (Accession No. KC493156.1,HQ645082.1). It was identified that the pathogen of branch blight of A.palmatum ‘Sangokaku’ in Zhejiang province was C. gloeosporioides. Treatment by spraying the plant with 40% EC 800-times diluted prochloraz liquid had a control effect on the disease up to 92.6%.
Key words: Acer palmatum‘Sangokaku’    branch blight    pathogen    Colletotrichum gloeosporioides    control    

红枝鸡爪槭(Acer palmatum ‘Sangokaku’)为鸡爪槭变型,又名赤枫、日本枫‘珊瑚阁’,原产日本,属槭树科槭树属落叶小乔木,株高3.5~4.5 m; 冬季叶片落尽后,枝干展现出艳丽的珊瑚红近5个月,令人赏心悦目,是不可多得的优良彩叶及彩枝树种(王志龙,2014)。浙江省奉化、余姚、鄞州、新昌等6县(市)交界的四明山区域是全国闻名的“花木之乡”,主要生产红枫(A.palmatum ‘ Atropurpureum’)、红枝鸡爪槭和樱花(Cerasus subhirtella)等特色绿化苗木,近5年每年销售额近20亿元,种植花木已成为当地山区农民脱贫致富的重要手段。红枝鸡爪槭观赏价值高,环境适应性强,市场供不应求,吸引了山区大批花农扩种,栽植面积不断增加。2009年9月,笔者在浙江省余姚市梁弄镇和奉化市溪口镇的苗圃内发现红枝鸡爪槭当年生枝条上发生一种新病害,该病害发病初期,嫩枝表面出现褐色小病斑,随着病情发展,病斑不断扩大,围绕枝条一圈时,造成枝条枯死,故称之为枝枯病。笔者历时3年抽样调查了浙江省宁波市鄞州区、奉化市、余姚市等红枝鸡爪槭主产区的12个苗圃,发现该病发生普遍,病情严重,平均病株率87.7%,枯枝率高达67.2%,其中奉化市某苗圃发病最严重,病株率100%,50%以上苗木商品价值丧失,造成很大经济损失。目前,国内外还未见红枝鸡爪槭枝枯病的研究报道。

笔者于2010—2013年对红枝鸡爪槭枝枯病进行病原菌分离鉴定及防治试验,旨在明确引起红枝鸡爪槭枝枯病的病原菌,为进一步研究该病害的传播途径、寄主范围和发病规律提供基础,为综合防控该病害提供科学依据。

1 材料与方法 1.1 田间症状及发生规律观察

2010—2013年红枝鸡爪槭枝枯病发生期,多次调查宁波市多个公园、苗圃内栽培的红枝鸡爪槭发生枝枯病情况和发病症状; 同时从发病苗圃收集发病程度较轻的苗木,栽植在宁波城市职业技术学院鸭嘴山实习林场内,自3月底红枝鸡爪槭发新叶开始,直到11月中旬落叶止,定期、定植株观测红枝鸡爪槭枝枯病症状演变过程。

1.2 病原菌的分离与鉴定

2013年9月从苗圃地采集红枝鸡爪槭枝枯病病样,参照方中达(1998)的方法分离病原菌: 选取典型发病枝条,切取病枝典型症状病健交界处表皮组织块(4.0 mm×3.0 mm×0.5 mm)和木质部组织块 (4.0 mm×3.0 mm×2.0 mm),依次置入75%酒精15 s和0.1%氯化汞50~60 s进行表面消毒,用灭菌水漂洗3次,接种于PDA培养基平板上,移至RXZ-185A型智能人工气候箱(宁波东南仪器有限公司生产)内,25 ℃黑暗条件下培养。隔12 h检查1次,发现组织块周围长出菌丝,用灭菌的解剖针挑取菌落边缘单菌丝段至 PDA平板进行纯化获得菌株。病菌培养采用PDA培养基,25 ℃温度下12 h光照(黑光灯)、12 h黑暗(Sutton,1980)。菌丝和分生孢子诱发产生附着孢采用PCA培养基,进行玻片培养,光照同病菌培养。病菌形态学特征鉴定参照相关文献(Sutton,1980陆家云,2001曹文广等,2005)。

1.3 致病性测定

对分离到的4个典型菌株Z920121、Z920122、Z920123、Z920125进行致病性测定。试验在宁波城市职业技术学院鸭嘴山实习林场进行,供试材料为4~5年生露地栽培红枝鸡爪槭苗木。

每菌株致病性测定均设刺伤和无伤口接种2种处理。选取健康红枝鸡爪槭植株上的当年生壮枝,在每个枝条的中部确定1个接种处,先用沾有70%酒精的脱脂棉球轻轻擦拭枝条接种处,然后用无菌水冲洗3次,备用; 刺伤方法如下: 待前述经酒精消毒、无菌水冲洗的枝条表面风干后,用灭菌医用解剖针轻轻点刺枝条表皮,每个接种处刺3~4针,伤口深达木质部即可。接种时,先用现配的孢悬液(孢子浓度为1×105个·mL-1)将无菌脱脂棉球浸湿,然后包裹在处理过的枝条接种点,用保鲜膜缠绕固定并保湿。每处理接种30个枝条,4次重复,以无菌水接种作对照。接种植株按常规方法培育,接种48 h开始观察记录发病情况,14天后揭掉脱脂棉,选取明显发病的枝条重新分离病原菌并进行鉴定。

1.4 病原菌分子鉴定 1.4.1 病原菌rDNA-ITS序列扩增

采用改良CTAB法提取病原菌Z920121总DNA(Roberts,2005)。选用真菌通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)对病原菌的ITS和5.8S rDNA进行PCR扩增(王洪凯等,2001)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

rDNA-ITS扩增采用2 × Taq PCR Master Mix扩增试剂盒(Cat#116PTM R02),反应体系包含: 2 × PCR Master Mix 25μL; ITS1(10 μmol·L -1)1 μL; ITS4(10 μmol·L -1)1 μL; 模板DNA(50 ng·μL-1)1 μL; ddH2O 22 μL。总体积为50 μL。PCR反应参数为: 94 ℃预变性3 min; 94 ℃变性30 s,94 ℃退火40 s,72 ℃延伸1 min,35个循环; 72 ℃延伸完全7 min。反应完成后进行琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4.2 病原菌rDNA-ITS测序与分析

将扩增出来的目的核酸片段送上海桑尼生物科技有限公司纯化后进行测序,将测序结果提交NCBI(美国国立生物技术信息中心)的GenBank进行同源性比对。根据病菌的形态特征、培养性状和致病性,结合序列分析,对病原菌进行鉴定。

1.5 小区防治试验 1.5.1 供试农药

50%多菌灵WP 500倍液,山东神星农药有限公司生产; 70%代森锰锌 WP 600倍液,江苏利民化工有限责任公司生产; 46.1%可杀得3000(氢氧化铜)WG 1 000倍液,上海杜邦农化有限公司生产; 40%咪鲜胺EW 800倍液,江苏福田农化有限公司生产; 50%扑海因(异菌脲)WP 1 500倍液,美国FMC(富美实)公司生产。

1.5.2 试验处理与设计

试验地点设在宁波城市职业技术学院鸭嘴山实习林场,选取田间自然发病地块5年生嫁接苗。试验共设5个处理,每处理3次重复(小区),每小区10株,15个小区150株苗木,小区随机排列并挂牌标示,发病初期开始第1次施药(2012-04-11),连续施药3次,每次间隔10天; 对叶面、枝干进行均匀喷雾,使植株充分着药,并保证每小区处理药液量1次喷完。用喷清水作对照。

1.5.3 病情调查与防效计算

分别在第3次施药后15天和40天调查发病情况,每小区随机取5株,每株东、南、西、北4个方向调查20个新枝(每方向5个枝条),统计植株病枝率和枯枝率,同时计算药剂防治效果,计算公式如下:

发病率=(发病数/接种数)×100%。

防治效果=(对照区病枝百分率、枯枝百分率-防治区病枝百分率、枯枝百分率/对照区病枝百分率、枯枝百分率)×100%。

1.6 防治示范

选择面积约3 333.3 m2的红枝鸡爪槭生产苗圃作为红枝鸡爪槭枝枯病综合防治示范基地。根据田间小区试验结果,将防治效果较好的40%咪鲜胺EW 800倍液、50%扑海因(异菌脲)WP 1 500倍液、70%代森锰锌 WP 600倍液和46.1%可杀得3000(氢氧化铜)WG 1 000倍液等作为供试药剂,采用交替用药方式,用可杀得、咪鲜胺、扑海因、代森锰锌依次对植株枝干及叶面进行喷雾,第1次喷药时间为发病初期(2013-05-07),每次间隔10天,以喷清水作对照,9月15日调查病情、统计防治效果,方法参照1.5.3。设修剪和不修剪2种处理。修剪方法: 秋季红枝鸡爪槭落叶后至春季萌芽前,结合整形,对有病斑枝条进行修剪,去除病重枝或枯死枝,清理地面病残体。

2 结果与分析 2.1 田间症状及发生危害规律

2011—2013年田间调查发现,红枝鸡爪槭枝枯病发病株率高达80%~90%,病枝率约55%~60%,枯枝率约30%。每年 4—10月均可发病,5—6月雨水多更容易造成病害的传播蔓延,为该病害的高发期。8月开始出现枝枯现象,严重时可致植株上的当年生枝条全部枯死(图 1a)。若遇到台风或暴风雨天气,病害发生更为严重。该病较少侵染多年生老枝,一般不侵染主干。

图 1 红枝鸡爪槭枝枯病田间发病症状 Fig. 1 Symptoms of A.palmatum ‘Sangokaku’ branch blight a.病株症状Severe symptoms of diseased plants; b.发病早期症状Early symptoms; c.发病后期症状Late symptoms; d.病部产生的孢子团Sori in diseased part.

红枝鸡爪槭枝枯病主要危害植株的枝条,也可侵染嫩芽或嫩叶。发病初期,受病原菌感染,嫩枝表皮出现褪绿色或褐色小斑点,逐渐扩大为圆形、椭圆形或不规则形病斑,黑褐色或褐色,病部略凹陷(图 1b); 后期,病斑变成灰白色,表皮常开裂,其上着生许多突起的黑色小点粒(图 1c); 当多个病斑连接成片或病斑环绕枝干一周时,枝条病部以上着生的叶片枯萎,枝条逐渐枯死; 雨后潮湿或空气湿度高时,病斑上可产生黏稠状黄色孢子团,为该病害的主要特征(图 1d)。

2.2 病原菌的分离培养和形态特征

2010—2013年,从浙江奉化市溪口镇、余姚市梁弄镇、宁波鄞州区章水镇等地采集到23个枝枯病病样,对病样的韧皮部、木质部褐色组织进行病原菌分离,从病样中共分离到Z920121、Z920122、Z920123、Z920124、Z920125、Z920126共6个菌株,根据菌落形态、色素产生情况、分生孢子形态特征等对其进行归类,均属同一种真菌。

菌株Z920121在PDA 培养基上,初期为白色绒状,近圆形平铺伸展,无褶皱,气生菌丝生长较密集,初期白色,后期菌落正面颜色变成灰黑色至墨绿色,25 ℃培养5天左右表面变湿润,形成橘黄色黏孢团,其上产生大量分生孢子(图 2a)。分生孢子圆柱形,单孢无色,具1个油球,两端钝圆,大小(18.23~11.76)μm×(4.46~2.94)μm(平均14.79 μm×4.06 μm)(图 2b); 附着孢淡褐色,近圆形或不规则形,边缘平滑,大小为8.67 μm×4.52 μm(图 2c)。因此初步认为该病原菌为胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)。

图 2 菌株Z920121的形态特征 Fig. 2 Morphologic character of strain Z920121 a. 在PDA上的菌落(正面)Colony on PDA(face); b. 分生孢子形态Conidia shape; c.附着胞形态Appressoria shape.
2.3 致病性测定

供试菌株用刺伤法接种的植株发病较早,接种后第4天枝条发病,在接种部位形成褐色近圆形病斑,病斑扩大较快,病部略凹陷,症状较田间自然发病症状重(图 3a),10天平均发病率为51.3%,23天后,有部分枝条开始枯死。无伤口接种的枝条发病时间较刺伤接种的晚5~6天,第9天后开始发病,发病进展较慢(图 3b),10天平均发病率为4.4%,其中Z920121菌株致病力最强(表 1)。柯赫法则致病性测定结果表明,菌株Z920121、Z920122、Z920123、Z920125对红枝鸡爪槭枝条均有较强致病力,有伤接种20天后致病率99.8%,无伤接种20天致病率为50%~80%,平均致病率60.8%。供试菌株侵染致病后均表现出典型枝枯症状,与田间枝条发病症状一致,从发病部位重新获得与接种菌相同病原真菌,即可确定该接种菌为枝枯病的病原菌。对照不致病(图 3c)。

图 3 人工接种菌株Z920121后红枝鸡爪槭的症状 Fig. 3 Symptoms of A.palmatum ‘Sangokaku’ branch blight after artificial inoculation of strain Z920121 a.有伤接种(12天)Wound inoculation (12 days) ; b.无伤接种(12天)No wound inoculation (12 days); c.对照Control.
表 1 不同分离菌株的致病性测定 Tab.1 Pathogenicity test of strains of C. gloeosporioides
2.4 病原菌的分子鉴定

用真菌特异性引物ITS1/ITS4扩增病原菌Z920121的ITS序列,获得500~750 bp之间的单一条带。ITS序列扩增产物经测序,获得574 bp的片段。所测菌株序列与GenBank 中已有的序列比对,发现其序列与胶孢炭疽菌(GenBank登录号KC493156.1、HQ645082.1)相似性达到100%。结合形态鉴定结果,确定该病原菌为胶孢炭疽菌(登录号为KF787111)。

2.5 小区防治试验结果

小区试验表明,5种农药对红枝鸡爪槭枝枯病均有较好的防治效果。发病初期开始施药,连续喷药3次(每次间隔10天),40%咪鲜胺EW 800倍液的防效最好,施药后15天对病枝和枯枝的防效分别达90.1%和90.0%,药后40天对病枝和枯枝的防效分别为92.6%和92.0%; 50%扑海因(异菌脲)WP 1 500倍液、70%代森锰锌WP 600倍液和46.1%可杀得3000(氢氧化铜)WG 1 000倍液3个处理也有较好的防治效果,药后40天对枯枝的防效在80%~90%,50%多菌灵WP500倍液效果不理想,防效在55%以下(表 2)。

表 2 5种杀菌剂对田间小区红枝鸡爪槭枝枯病的防效 Tab.2 Control efficacy of five fungicides on A.palmatum ‘Sangokaku’ branch blight in different field plots
2.6 防治示范

秋季修剪结合药剂防治,9月统计的病枝率和枯枝率仅为2.2%和1.6%,而对照区分别为79.4%和43.7%,防治效果达97.2%和96.3%,病害得到有效控制。而不修剪只喷药的防治效果不甚理想,防治效果为77.2%和64.9%(表 3)。

表 3 红枝鸡爪槭枝枯病的大田示范防治效果 Tab.3 Control efficacy of the field demonstration experiments on A.palmatum ‘Sangokaku’ branch blight
3 讨论与结论

近年来炭疽菌种级鉴定标准是以传统的分生孢子和附着胞形态为主,结合分子生物学技术验证,同时辅以培养特征和寄主范围作参考的综合特征来确定的(陆家云,2001Abang et al., 2002Sutton,1980曹文广等,2005Phoulivong et al.,2010)。本研究以病原菌上述的形态特征并结合 rDNA-ITS 序列进行分析和比对,最后鉴定引起红枝鸡爪槭枝枯病的病原菌为胶孢炭疽菌,为进行该病害的防治提供了一定的理论依据。

胶孢炭疽菌是炭疽菌属内最大的一个种,其分布非常广泛,危害寄主种类繁多,可以侵染诸如杉木(Cunninghamia lanceolata)、油茶(Camellia oleifera)、泡桐(Paulownia)、杨树(Populus)、桃(Amygdalus)、核桃(Juglans regia)、板栗(Castanea mollissima)、芒果(Mangifera indica)、柿树(Diospyros kaki)、枇杷(Eriobotrya japonica)、苹果(Malus pumila)、橡胶(Hevea brasiliensis)、阿月浑子(Pistacia vera)、南方红豆杉(Taxus mairei)、砀山梨(Pyrus bretschneideri)等重要的林木种类,引起生产上较为严重的炭疽病(徐红梅等,2004韩长志,2012刘晓云等,1995王晓鸣等,1987),但由该菌引起的林木枝枯病报导很少,仅见引起绒柏(Chamaecyparis pisifera)枝枯病(张志元等,2007)。Smith(1993)报道在美国北部的日本枫树(Acer spp.)上尖孢炭疽菌(C. acutatum)引起溃疡,溃疡主要发生在伤口部位,该病菌的分生孢子长16~18 μm,宽4~6 μm,其病害症状和病原菌同本研究明显不同,笔者认为枝枯病是红枝鸡爪槭上的一种新病害。

本研究详细描述了红枝鸡爪槭枝枯病的症状发展过程。在致病性试验中发现,采用刺伤和无伤方法接种,胶孢炭疽菌均可侵染,但刺伤接种法发病速度快、发病严重,由此认为病原菌主要通过当年生枝条伤口侵染红枝鸡爪槭枝条并引起发病和枝枯。

小区试验表明,咪鲜胺、扑海因(异菌脲)、代森锰锌、可杀得3000(氢氧化铜)等4种农药对防治红枝鸡爪槭枝枯病都有良好效果。笔者近3年田间病害调查和防治示范试验结果表明,每年秋季植株落叶后至春季萌芽前,结合整形修剪及时清理病残枝,对控制病害的发展有明显的作用。本研究结果和指导农户防治的生产实际效果表明:每年秋季结合整形修剪及时清理病残枝,第2年5月于发病初期连续轮换使用上述农药,每次间隔10天对叶面、枝干进行均匀喷雾,是防治红枝鸡爪槭枝枯病的有效方法。

浙江省的四明山区域是全国红枝鸡爪槭最主要生产基地,生产供应无枝枯病红枝鸡爪槭苗木是基地可持续发展必须解决的问题。进一步开展对病菌生物学特性、寄主范围、侵染特性及其机制、苗木检验方法的深入研究十分必要,以便为更有效防治和抗性品种选育提供系统的理论依据。

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