竹纤维作为一种拥有薄厚层相互交替的多层结构和优异物理力学性能的典型生物质材料，一直被当作是复合材料的仿生模型(Parameswaran et al.，1976; Zhou，1996; Wang et al.，2011)。同时，由于竹纤维的低密度、高强度、很快的生长速度及对环境友好的特性，竹纤维为制浆造纸及复合材料的增强单元提供了一个具有市场前景的选择(Mohanty et al.，2000; Aranberri-Askargorta et al.，2003; Chen et al.，2011)。因此，研究竹纤维细胞壁具有重要的意义。但是由于竹纤维细胞壁的结构复杂，样品制备困难，对于竹纤维细胞壁多层结构在纳米尺度的研究进展缓慢(Parameswaran et al.，1976; He et al.，2007; Wang et al.，2012)，因此寻求新的研究手段以及样品处理方法成为突破竹材细胞壁结构在纳米尺度研究的重要途径。

原子力显微镜(AFM)是一种纳米尺度的重要研究手段，广泛应用于植物细胞壁纳米水平的研究，其中细胞壁微纤丝的研究发展很快(Kirby et al.，1996; Thimm et al.，2000; Fahlén et al.，2005; Cybulska et al.，2013)。然而AFM在竹纤维细胞壁纳米尺度的研究(余雁等，2008; Zou et al.，2009)却很少。鉴于AFM将成为研究竹纤维细胞壁纳米尺度结构的有力手段，首先需要注意如何制备样品及一些预处理如何影响竹纤维细胞壁。因此本文以1年生毛竹(Phyllostachys edulis)为研究对象，利用AFM研究毛竹初生壁的微纤丝排列方式，以及超声处理及气干和冻干2种干燥方式对毛竹初生壁微纤丝的影响。

毛竹:1年生2～4m处竹筒，采自安徽黄山太平，气干; 30%双氧水、冰醋酸，均为分析纯。

原子力显微镜(AFM，Icon，Burker Corperation，Santa Barbara，US)、场发射环境扫描电子显微镜(XL30 ESEM FEG，FEI Company，Hillsboro，OR)、高频超声波细胞破碎仪(JY99-IIND，宁波新芝生物技术有限公司)、水浴锅等。

将双氧水和冰醋酸按照体积比1∶1配置成溶液(因为双氧水+冰醋酸相比其他常用方法能够有效地除去木质素)，并将溶液分置于2个三角瓶中，把劈制成长约3cm，2mm×2mm横截面的毛竹小竹条分别置于化学溶液中，然后将三角瓶65℃下保持18.5h，取出分离的纤维并用去离子水洗干净，一部分纤维采用气干和冻干2种方式分别干燥，另一部分纤维先通过30min超声波处理再采用气干和冻干2种方式分别干燥。超声处理过程中出于保护设备及样品的考虑，超声波处理的基本参数设置如下:超声频率为19.5～20.5kHz，探头直径20mm，最大功率1800W，输出功率30%。采用的脉冲为处理5s、停歇5s。

将毛竹纤维放置在FE-SEM带有导电胶的样品托上进行喷金，然后在真空状态下进行观察。

AFM试验过程中使用商用硅探针，微悬臂长度3.5μm，力常数20Nm^-1，采用Tappingmode成像，扫描速度约1.0Hz，图像分辨率为512×512。

图 1所示为经过不同处理的纤维在场发射环境扫描电镜下的形态。从图中可以看出，无论何种方式干燥，纤维表面都有不同程度的皱缩，相比冻干的纤维，气干的纤维表面皱缩更明显一些。图中箭头所指为竹纤维细胞壁上的纹孔，能够看出图 1a中的纹孔由于皱缩倾向于条状，而图 1d中的纹孔比较接近圆形。

	图 1 不同处理的毛竹初生壁微纤丝FE-SEM Fig. 1 FE-SEM images of cellulose microfibrils with different treatments a. 不做超声处理气干 Untreated and air-dried; b. 超声处理后气干 Treated and air-dried; c. 不做超声处理冻干 Untreated and freeze-dried; d. 超声处理后冻干 Treated and freeze-dried．

竹纤维细胞壁微纤丝被包围在非纤维素多糖组成的基质中(江泽慧，2002)。在之前的研究(陈红，2013)中发现，相比几种常用的化学分离方法，双氧水+冰醋酸能够有效地除去木质素及半纤维素。为了更清楚地观察到竹纤维细胞壁的微纤丝，微纤丝暴露得越明显越好，因此文中采用双氧水+冰醋酸溶液分离得到单根竹纤维。图 1中所示的皱缩可能是由于细胞壁化学成分被除去并留存有空隙，在干燥时，失水导致纤维素聚集体之间更多的氢键结合，宏观上表现出来比较明显的皱缩。作者之前的研究(Chen，2011)发现，虽然同样采用气干方式，物理剥离的纤维表面基本没有像化学分离的纤维表面这么明显的皱缩，但这也说明了除去化学成分可能是主要原因。

在同一种干燥方式中，能够观察到超声处理的表面会覆盖一层类似薄膜状(图 1b)及一些絮状(图 1d)的物质，这是由于超声处理把薄壁细胞打碎进而形成悬浮液在干燥时覆盖在纤维表面的缘故。同时，制备样品时超声处理的纤维也需要从絮状的物质中抽出来，因此在制备观察样品时具有一定的难度。另外，从图 1中能够直观地观察到超声处理纤维表面比较明显的皱缩比较少，但一些细微的皱缩却比较多。

一次扫描可以得到不同数据类型的图像，其中高度图能反映材料表面形貌的高度特征，可以直接利用此类图像的高度数据来评价材料表面的粗糙度; 相图适合反映材料表面不同区域力学性质的差异，并且相图常能够显示一些高度图中不可见或者只能隐约可见的特征(Hansma et al.，1997; Morrid et al.，1999; Fahlén et al.，2003; 余雁等，2008)。

图 2为采用双氧水和冰醋酸混合液分离的毛竹纤维表面微纤丝。在相图中，纤维素微纤丝是亮色的部分，非纤维素多糖基质及微纤丝之间的空隙是深色部分，因为这种基质的弹性和硬度明显小于微纤丝(Mark，1967)。不管经过何种预处理，在相图中都可以明显观察到毛竹纤维表面的微纤丝为随机无序的交织状排列，这与余雁等(2008)观察的结果一致。

	图 2 不同处理的毛竹初生壁微纤丝的AFM Phase图 Fig. 2 AFM Phase images of cellulose microfibrils with different treatments a．不做超声处理气干 Untreated and air-dried; b．超声处理后气干 Treated and air-dried; c．不做超声处理冻干 Untreated and freeze-dried; d．超声处理后冻干 Treated and freeze-dried．图像尺寸 All images: a: 1. 3 μm × 1.3 μm; b，c，d: 1.0 μm × 1.0 μm．

如图 2所示，无论是否采用超声处理，采用气干干燥的纤维初生壁微纤丝都比采用冻干干燥的排列结合紧密，这是由于除去细胞壁的成分会导致其保水能力下降，失水的速度更快，气干导致了大量的纤丝和纤丝间的聚集(Kirby et al.，2006)，而冻干方式却不会对纤维细胞壁的结构有太大影响(Kirby et al.，1996)，这与在电镜下观察到的结果一致。

气干条件下，相比未进行超声处理的纤维，超声处理的纤维初生壁微纤丝相互之间接触得更为紧密; 而冻干条件下，相比未进行超声处理的纤维，超声处理的纤维初生壁微纤丝之间更为松散。这是因为超声波具有“空化现象”、“机械振动”以及“热效应”等特性，“空化现象”可产生瞬间几千帕压力，使提取介质中的微小气泡压缩、爆裂，加速目标提取物的溶出，“机械振动”和“热效应”进一步强化了溶出成分的扩散，整个过程在瞬间完成(莫肖云等，2009; 刘丽等，2003)。对于竹纤维初生壁微纤丝，超声处理相当于一个帚化的作用，而且使得更多无定形的物质溶出，所以在采用气干方式干燥时，超声处理的纤维初生壁微纤丝由于更多的氢键而结合得更紧密(Kirby et al.，2006)，而冻干的竹纤维初生壁因超声的帚化作用使微纤丝排列得比较松散。此外，在AFM下观察时，相比其他预处理的竹纤维，气干并且经过超声处理的竹纤维初生壁更容易观察到比较清晰的微纤丝。

表面粗糙度，是指加工表面具有的较小间距和微小峰谷不平度。其两波峰或两波谷之间的距离(波距)很小(在1mm以下)，用肉眼难以区别，因此它属于微观几何形状误差，常用Ra或者Rmax来表征。由表 1可以看出竹纤维初生壁的粗糙度会受预处理的影响。对于未经过超声处理的样品，相比冻干条件，气干条件下的R_a和R_max稍高些，这是因为气干的样品表面微纤丝聚集得更多，并且微纤丝表面覆盖的非纤维素多糖也更多。然而在经过超声处理的纤维中却呈现相反的趋势，即冻干条件下的R_a和R_max要高些。不管采取气干方式还是冻干方式，超声处理都会R_a和R_max增大，增加竹纤维表面的粗糙度。粗糙度越高，表面自由能越大，对水的润湿性也越好(Silva et al.，1999)，这也进一步验证了之前的研究结论，超声处理减小纤维对水的接触角，提高了纤维的润湿性(Chen et al.，2011)。

表 1 毛竹纤维初生壁的粗糙度① Tab.1 The roughness of microfibrils in moso bamboo fiber primary cell walls

表 1 毛竹纤维初生壁的粗糙度① Tab.1 The roughness of microfibrils in moso bamboo fiber primary cell walls 指标 Index 气干 Air-dried 冻干 Freeze-dried 未处理 Untreated 超声处理 Treated 未处理 Untreated 超声处理 Treated Ra Rmax Ra Rmax Ra Rmax Ra Rmax ①Ra表示平面表面高度差绝对值的算术平均; Rmax表示最高和最低的数据点在图像中的最大垂直距离(AFM NanoScope Analysis Version 1.40)。Ra: Arithmetic average of the absolute values of the surface height deviations measured from the mean plane; Rmax: Maximum vertical distance between the highest and lowest data points in the image following the planefit． 毛竹纤维 Moso fiber 3.82(0.48) 32.78(0.32) 8.41(0.37) 67.93(0.31) 17.00(0.71) 115.35(0.55) 31.36(0.70) 193.06(0.50)

经过不同预处理的毛竹纤维在FE-SEM下所呈现的形态有一定差别，这种差别大多是在AFM下观察到微纤丝变化在宏观上的一个表现。在AFM下观察到毛竹纤维初生壁微纤丝呈随机的无序交织状排列; 超声处理和不同干燥方式都影响微纤丝之间的距离; 超声处理增加了表面粗糙度并使得微纤丝暴露得更明显，这就提供了一个增加纤维表面润湿性和使竹纤维初生壁微纤丝更易被观察到的方法。因此，该研究结果表明，通过对竹纤维细胞壁进行适当处理，利用AFM技术在纳米水平上研究竹纤维细胞壁是一种可行的手段。同时，在利用AFM研究竹纤维纳米尺度的结构特征尤其是微纤丝时，需要注意选择样品制备及预处理方式。