杨树(Populus)是一种适应性强、分布极广的树种，为我国北方栽植面积最大的速生用材林树种，具有重要的生态和经济价值。随着杨树人工林的大面积的发展，杨树病虫害大量产生，其中，水泡型溃疡病是杨树重要的枝干病害，常导致杨树幼树枯死并限制成树的生长，严重影响杨树人工林的培育，一定程度上制约着我国林业及生态环境建设的稳定发展。杨树水泡型溃疡病由子囊菌门(Ascomycota)、葡萄座腔菌目(Botryosphaeriales)的葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)侵染所致(张星耀等，2003; Grasso et al.，2010)，该真菌寄主范围广泛，可引起包括杨树在内的多种林木溃疡、枝枯、流胶和果腐等病害(吴小芹等，2001)。

葡萄座腔菌在自然条件下多以无性型出现在杨树等寄主上，但葡萄座腔菌属无性型复杂多样，如Dothiorella，Diplodia 和Fusicoccum 等(Denman et al.，2000)。关于葡萄座腔菌的无性型类型仍存在争议(张星耀等，1999; 2000; 王金利等，2007; 余仲东等，2010; Slippers et al.，2004; Kirk et al.，2008)，该病菌的无性型存在着生理与致病性变异(刘会香等，1997; 张星耀等，2008)。因此，深入开展杨树水泡型溃疡病病原菌系统学及其致病性分化研究，具有重要的理论与实践意义。

目前，国内外学者对于Botryosphaeriaceae 真菌分类研究除仍主要依据此类真菌有性型、无性型形态学特征外，更多是采用多种分子系统学研究方法。这些技术包括SSR，ISSR，RAPD，RFLP和AFLP等多种分子标记(王金利等，2003; 2007; 余仲东等，2000; 2004; 张星耀等，1999; 2000)。多个研究都采用rDNA的保守区域(如ITS，LSU，18S rDNA，28S rDNA基因等)、β-微管蛋白和EF-1a 基因序列对树木溃疡病病原菌进行鉴定并分析其系统发育关系(余仲东等，2010; Slippers et al.，2004; Phillips et al.，2005; Crous et al.，2006)。本研究首次对发生在陕西、甘肃等地的杨树水泡型溃疡病菌进行调查分析，在形态学鉴定的基础上，利用rDNA-ITS 序列、β-微管蛋白基因和EF-1α基因序列分析不同地域菌系间的系统发育关系，以期为西北地区杨树溃疡病菌分子系统及其地理分化提供理论依据。

2011年5月—2012年10月分别在陕西省西安市、宝鸡市、榆林市、汉中市和甘肃省天水市等地设立调查、采集点，随机抽样法采集各杨树品种具有典型水泡型溃疡病症状的树皮组织，按常规方法分离、纯化并保存菌种，选取其中56个杨树水泡型溃疡病菌菌系及西北农林科技大学森林病理实验室2009年保存6个杨树水泡型溃疡病菌菌系，共计62株作为本研究试验菌系(表 1)。

表 1 试验菌系种类、分生孢子大小、寄主及其采集地^① Tab.1 Species，conidial size，poplar host and collection locations of tested isolates

表 1 试验菌系种类、分生孢子大小、寄主及其采集地① Tab.1 Species，conidial size，poplar host and collection locations of tested isolates

将62个菌系接种到PDA培养基(马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉16 g，水1 000 mL)上，置于27 ℃恒温培养箱中黑暗培养，观察并比较菌落形态、颜色变化、气生菌丝表面特征及产孢情况等，在Olympus 显微镜(CX31RTSF，配DP-25数码相机)下不同视野中随机挑选50个分生孢子测量其大小并进行显微照相。依据各菌系在PDA培养基上的形态特征、分生孢子个体发育类型和分生孢子形态与大小鉴定各菌系培养物无性型的分类地位(向玉英等，1981; 邵力平等，1984; 钟兆康，1985; 杨旺，1996; Sutton，1980; Slippers et al.，2004)。

将经过无性型形态鉴定后的62个菌系活化于PDA培养基上，27 ℃黑暗培养5天。用直径5 mm 的打孔器沿菌落边缘打取7块菌饼，置入马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB，马铃薯200 g，葡萄糖20 g，水1 000 mL)中，27 ℃、120 r·min^-1震荡培养5.5天后收集菌丝团，用无菌水冲洗3次，无菌滤纸吸干水分，再用无菌滤纸包裹收集到的菌丝，置40 ℃烘箱中烘干，- 20 ℃保存备用。

称取冷冻干燥菌丝约0.06 g放入无菌研钵中，迅速加入适量液氮用研磨棒研磨至粉末状后转入2 mL 离心管中。真菌基因组DNA提取采用CTAB法，参照张颖慧等(2008)、孙立夫等(2009)、姜自如等(2012)方法并做相应改进。模板DNA检测采用琼脂糖凝胶电泳法。

采用通用引物ITS1(5'＞TCCGTAGGTGAACCTGCGG＜3')，ITS4(5'＞TCCTCCGCTTATTGATATGC＜3')(White et al.，1990)对核糖体内部转录间隔区ITS1 -5.8 S-ITS4序列进行扩增。扩增体系为25 μL，包括DNA模板1μL，ITS1 1μL，ITS41 μL，2 × Tap Master Mix 7.5 μL，ddH2 O14.5μL。PCR反应程序为: 94 ℃预变性2 min，55 ℃停留40 s; 93 ℃变性1 min，51℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 30 s，共35个循环; 72 ℃再延伸10 min，4 ℃终止反应保存。分别用引物Bt2a(5' ＞ GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC ＜ 3')/Bt2b(5' ＞ ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGG C＜3')和EF1-728F(5' ＞ CATCGAGAAGTTCGAGAAGG ＜3')/EF1-986R(5' ＞ TACTTGAAGGAACCCTTACC ＜3')对β-tubulin 基因和EF-1α基因序列进行扩增(White et al.，1990; Glass et al.，1995; Carbone et al.，1999)。扩增体系均为25 μL，包括DNA模板1 μL，正反向引物各1 μL，2 × Tap Master Mix 7 μL，ddH2O 15 μL。PCR反应程序为: 94 ℃预变性5 min; 94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环; 72 ℃再延伸7 min，4 ℃终止反应保存(冯小慧等，2012)。操作均在冰上进行。

扩增产物置4 ℃冰箱中保存。取5 μL PCR产物样品，以Marker DL2000为分子质量标准，在2%琼脂糖凝胶中100 V 稳压电泳约45 min，EB 染色15 min后观察电泳结果。所有PCR产物由上海生物工程公司进行序列测定，测序引物与扩增引物相同。

将所有检测序列提交GenBank，经Blast 同源性比较，根据比对的期望值(expect values)、提交序列与参比序列的一致度(identities)以及空位(gaps)综合判断每一个Blast 结果后选择参比序列。从GenBank 搜集到18条Botryosphaeria spp.基因序列作为参比序列(表 2)。

表 2 来自GenBank参比序列相关信息 Tab.2 The information of reference sequences from GenBank

表 2 来自GenBank参比序列相关信息 Tab.2 The information of reference sequences from GenBank     真菌种名 Fungal species     寄主名称 Host species 登录号 Accession No. Botryosphaeria dothidea 杨树 Popu/us spp. EU520229 B. dothidea 蓝莓 Vaccinium sp. JX524805 B. dothidea 核桃 Jug/ans regia JN809914 B. dothidea 葡萄 Vitis vinifera JF682849 B. dothidea 葡萄 V. vinifera JF441083 B. dothidea 葡萄 V. vinifera HQ392742 B. dothidea 鳄梨 Persea americana HQ529722 B. dothidea 鳄梨 P. americana HQ529720 B. dothidea 桃树 P. _persica HQ660486 B. dothidea 桃树 P. _persica HQ660483 B. dothidea 石榴 Punica granatum FJ358701 B. ribis 山龙眼科Proteaceae AF452527 B. ribis 紫槭 Syzygium cordatum JF440836 B. ribis 茶蔗子尺ibes sp. AY808170 B. ribis 桉树 Euca/yptus sp. DQ235142 B. parva 百合 Li/ium /ancifo/ium DQ499155 B. parva 巨桉 Euca/yptus grandis AY226848 B. parva 桉树 Euca/yptus sp. AY226850 Fusarium so/ani — GU170638 F. oxysporum 葫芦 Lagenaria siceraria JQ965486 F. proliferatum 鹰嘴豆 Cicer arietinum EU091072

将检测序列和参比序列以FASTA 格式编辑成为一个文本文档，用Clustalx2和BioEdit 软件分别校正比对68个rDNA-ITS 序列、69个β-tubulin 基因序列和70个EF-1α基因序列，并将开始和末尾处长短不同的序列剪切整齐，得到聚类的碱基序列矩阵。用Tajima-Nei 法检测序列中性突变的稳定性。使用MEGA5.05软件中的“Sequence DataExplorer”分析构建系统树所使用序列的统计学特征(赵嘉平，2007)，如序列的保守区、可变区等。分别以Fusarium solani，F.oxysporum和F.proliferatum 3种镰刀菌作为rDNA-ITS，β-tubulin和EF-1α基因序列的外类群(表 2)，采用p-距离对3种基因序列进行NJ 聚类分析，以自展法(bootstrap)检测，重复1 000次(Felsenstein，1985)，构建邻接树(neighborjoiningtree)。

杨树水泡型溃疡病菌在PDA培养基上生长3天时菌落呈污白色绒毛状，气生菌丝发达。培养第4天起出现浅墨绿色色素沉淀，呈散点状或环状分布。多数菌系菌落在生长中后期(7 ～ 10天)呈现灰色、灰黑色至墨黑色，中央菌丝稠密、棉絮状，向上生长呈喷泉状可达培养皿盖，菌丝层较厚，部分倒伏，边缘菌丝灰色、较稀疏，呈辐射状生长。菌系Fhbm和Fzwh3生长中后期菌落呈平伏状，并有明显环状色素沉淀。依据27 ℃下PDA培养基上生长8天的菌落特征将供试菌系划分为2个菌落类群: 类群Ⅰ为典型喷泉状菌落，包括除菌系Fhbm和Fzwh3以外的60个菌系，如菌系Fbky2，Fhqh2等; 类群Ⅱ为平伏状菌落，包括菌系Fhbm和Fzwh3(图 1)。

	图 1 杨树水泡型溃疡病菌在PDA 上的菌落形态特征 Fig. 1 Colonial characteristics of poplar blister canker’s pathogenic fungus isolates on PDA medium 菌落类群ⅠColonial groupⅠ: 菌系Fbky2，Fhqh2 Isolates Fbky2，Fhqh2; 菌落类群Ⅱ Colonial groupⅡ: 菌系Fhbm，Fzwh3 Isolates Fhbm，Fzwh3．

多数供试菌系在PDA培养基上培养15 ～ 45天可产生分生孢子，全壁芽殖型(holoblastic)发育，无色、单胞，纺锤形至不规则纺锤形(近棒状)，基部平截或钝圆，细胞内含颗粒状物; 分生孢子大小为(12.5 ～ 25.0)μm ×(3.5 ～ 7.5)μm，菌系之间并无显著差异(表 1)。此外，多数菌系(如Fbky2，Fyxj，Fchj1等)可同时产生无色、杆状的小分生孢子(microconidia)(图 2)。采自户县白庙乡的菌系Fhbm和杨凌菌系Fyxn在PDA上难以产生分生孢子，经对这2个菌系采用划伤菌丝、近紫外光诱导等处理方法使其在PDA上培养20天左右产生分生孢子，且较大。

	图 2 杨树水泡型溃疡病菌分生孢子形态 Fig. 2 Conidium morphology of poplar blister canker’s pathogen isolates 分生孢子与小分生孢子Conidia and microconidia: 菌系Fbky2，Fxdh1，Fchj1，Fyrg 和Fyxn isolates Fbky2，Fxdh1， Fchj1，Fyxn and Fyrg; 分生孢子Conidia: 菌系Flxy，Fzwh3，Fxdh2 和Fhbm Flxy，Fzwh3，Fxdh2 and Fhbm．

依据各菌系所产生的分生孢子个体发育及其形态大小，认定均为七叶树壳梭孢(Fusicoccuma esculi)，与Slippers等(2004)及Crous等(1999)所描述的Botryosphaeria dothidea无性型形态相符合。

供试62个杨树溃疡病菌菌系的rDNA-ITS-PCR产物直接测序长度为514 ～ 560 bp，平均GC 含量54% ; β-tubulin 基因PCR产物直接测序长度为417～ 437 bp，平均GC 含量58% ; EF-1α基因PCR产物直接测序长度为265 ～ 280 bp，平均GC 含量57%。将供试菌系的rDNA-ITS，β-tubulin，EF-1α基因序列在GenBank 数据库进行Blast 同源比较，显示所有试验菌系均为葡萄座腔菌，与其相似率在97%以上，该结果与形态学鉴定结果一致。

对供试菌系68个rDNA-ITS 序列、69个β-tubulin序列和70个EF-1α序列进行多重比对分析表明，在rDNA-ITS 序列构成的碱基序列矩阵中，包括空位在内共有469个碱基位点，其中保守位点(conserved sites)328个，可变位点(variable sites)119个，简约信息位点(parsim-Info sites)31个，单一位点(singleton sites)88个。β-tubulin 分析数据包括空位在内共有393个碱基位点，其中保守位点92个，可变位点282个，简约信息位点58个，单一位点224个。EF-1α分析数据包括空位在内共有266个碱基位点，其中保守位点90个，可变位点168个，简约信息位点55个，单一位点102个。

(表 3)显示，rDNA-ITS，β-tubulin和EF-1α基因序列的Tajima-Nei 检验值分别为- 2.764 298，- 2.740 716和- 2.423 210，核苷酸多样性值分别为0.011 945，0.035 355和0.041 348，说明各种基因序列无明显多样性，且进化稳定。rDNA-ITS，β-tubulin和EF-1α序列系统发育树的分支长度值(sum of branch lengths，SBL)或进化距离依次为0.276 304 25，0.891 805 17和0.779 918 73。

表 3 各基因序列中性Tajima's 检验^① Tab.3 Tajima's neutrality test for multiple gene sequence

表 3 各基因序列中性Tajima's 检验① Tab.3 Tajima's neutrality test for multiple gene sequence 基因序列Gene sequence m S Ps Θ n D ① m:序列数Number of sequences，S:分离位点Number of se rDNA-ITS 68 128 0. 286 996 0.059 924 0.011 945 -2. 764 298 β-tubulin 69 293 0.783 422 0.163 075 0.035 355 -2.740 716 EF-1α 70 152 0.666 667 0.138 354 0. 041 348 -2.423 210

聚类分析结果表明:供试菌系在基于rDNA-ITS序列的系统发育树(图 3)中可分为2个类群: GroupⅠ包括了Fyxj，Fzzn，Fymp2，Fhzy，Fymp1，Fchj1，Fsdj，Fzwh1，Fyyh，Fzwh5，Ftqa，Fypa2，Fhqh1，Fymp5，Fnbl2，Fbky1，Ffhn，Fhhs，Fhyx，Ffzl1，Fypa1，Fzwh2，Fzwh6，Fhfs，Flxc，Fchg2，Fhxm2，Fwdl，Fnxh，Ffnw，Fcsh，Fhbm，Fhqh2，Fzwh4，Fchj2，Ffsl，Ffjz，Fsxe，Fymp3，Fldh3，Flnh，Fhmx，Fldh2，Fchg1，Fyrg，Fymp4，Flxh，Fnbl1，Fffz，Ffzl2，Fhsz，Fxfh，Flxj，Fzwh3，Fbky2，Fhxm1，Fyhc，Fhlf，Fyxn，Fxdh2和Fxdh2 共61个Fusicoccum aesculi 菌系，均与GenBank 中报道的3条Botryosphaeria dothidea 序列聚在一起; 而来自宝鸡陇县的菌系Fldh1独立成群。诸菌系与葡萄座腔菌属已知种B.parva，B.ribis关系明显较远。β-tubulin 基因序列的聚类分析结果见图 4。参试的62个菌系按照序列分析形成3个不同的分支类群: GroupⅠ包括Fsxe，Fyhc，Fhsz，Fchg1，Fhfs，Ffhn，Fzwh1，Fhbm，Fsdj，Fldh2，Fymp4，Fzwh2，Fwdl，Fyyh，Fhzy，Fhmx，Fhlf，Fymp5，Fzzn，Ffzl2，Fypa2，Fnxh，Fhqh1，Ftqa，Fzwh6，Fypa1，Fnbl2，Fhxm2，Ffjz，Fhxm1，Fzwh3，Fymp1，Fymp3，Ffnw，Fymp2，Fbky2，Fchj2，Flxh，Fcsh，Flnh，Fchg2，Flxj，Fhqh2，Flxc，Fxdh2，Fxdh2，Fhyx，Fffz，Fxfh，Ffzl1，Fhhs，Fbky1，Fnbl1，Fldh1和Fzwh5共55个菌系序列及来自GenBank中的4条B.dothidea 序列; GroupⅡ包括菌系Fchj1，Ffsl，Fldh3和Fzwh4; GroupⅢ包括采自杨凌的Fyrg，Fyxj和Fyxn 3个菌系。表明参试菌系系统发育与B.ribis 不同。

	图 3 62个供试菌系β-tubulin基因序列的p-距离NJ系统发育树(SBL= 0.891 805 17) Fig. 3 Phylogenetic tree generated by p-distance NJ analysis using the β-tubulin gene sequence data for 62 isolates

	图 4 62个供试菌系β-tubulin基因序列的p-距离NJ系统发育树(SBL=0.891 805 17) Fig. 4 Phylogenetic tree generated by p-distance NJ analysis using the β-tubulin gene sequence data for 62 isolates

EF-1α基因序列系统发育分析结果与β-tubulin基因序列分析大致相似(图 5)，将参试62个F.aesculi菌系分为3个类群: GroupⅠ包括Fhsz，Fnxh，Fldh1，Fhqh2，Fbky2，Ffsl，Ffzl1，Fhxm1，Fzwh3，Fffz，Fhmx，Fymp4，Fzzn，Fzwh6，Fhbm，Fzwh1，Ffnw，Ffzl2，Fldh3，Ftqa，Fhhs，Fzwh2，Fnbl1，Fymp3，Fhfs，Fsdj，Ffjz，Fchj1，Fchj2，Fchg1，Fchg2，Ffhn，Fzwh5，Fnbl2，Fhzy，Fymp2，Fyyh，Fhyx，Fzwh4，Fymp5，Fhxm2，Fldh2，Fcsh，Flnh，Flxh，Fypa1，Fyhc，Fypa2，Fymp1，Fhqh1，Flxc，Fbky1，Fsxe，Fwdl，Fhlf，Flxj共56个菌系序列及GenBank 中报道的4条B.dothidea序列; GroupⅡ包括来自杨凌的Fyrg，Fyxj和Fyxn 3个菌系; GroupⅢ由咸阳的Fxfh，Fxdh2和Fxdh2 3菌系组成，显示与B.dothidea种内其他地域菌系亲缘关系较远。然而，所有参试菌系与B.parva，B.ribis关系仍然明显较远。

	图 5 62个供试菌系EF-1α基因序列的p-距离NJ系统发育树(SBL=0.779 918 73) Fig. 5 Phylogenetic tree generated by p-distance NJ analysis using the EF － 1α gene sequence data for 62 isolates

从不同基因序列构建的3个NJ 系统发育树中可看出，采用p-距离对rDNA-ITS，β-tubulin，EF-1α基因进行测度得到的聚类结果基本一致。3个系统发育树中的GroupⅠ分别包括了61，55和56个供试菌系，占供试菌系总数的比例分别为98.3%，88.7%和90.3%，另外，β-tubulin 系统树GroupⅠ中的55个菌系和EF-1α系统树GroupⅠ中的56菌系均聚在rDNA-ITS系统树GroupⅠ中。来自杨凌的3个菌系Fyrg，Fyxj和Fyxn在β-tubulin，EF-1α基因序列构建的NJ树中均聚在一起，且独立成群，表明Fusicoccum aesculi种内菌系之间存在一定的遗传分化。

Botryosphaeria dothidea是一种能引起杨树等树木溃疡病的重要葡萄座腔菌科真菌，长期以来国内外对其无性型的分类存在很大争议。1979年关于我国杨树水泡型溃疡病的病原菌鉴定报道以后，首次确认杨树水泡性溃疡病由真菌聚生小穴壳孢Dothiorella gregaria引起，其有性型为葡萄座腔菌B.dothidea，同物异名为B.ribis(向玉英等，1979;Arx et al.，1954; Witcher et al.，1963)。由于该病菌无性型较为常见，所以国内几乎所有的研究报道都以Dothiorella gregaria 作为病原菌(景耀等，1987;向玉英，1979; 向玉英等，1987; 杨旺，1996; 张星耀等，1999; 2003)。但Sutton(1980)，Pennycook等(1985)和王金利等(2007)认为B.dothidea的无性型应为Fusicoccum aesculi，而不是D.gregaria。因为Dothiorella属真菌可在分生孢子器内产生暗色、双胞的分生孢子(Phillips et al.，2005; Crous et al.，2006)。本研究根据供试菌系在PDA培养基上的形态学特征、分生孢子特征并结合相关基因序列分析结果，将引起陕西、甘肃等地的杨树水泡型溃疡病的病原菌鉴定为七叶树壳梭孢( Fusicoccum aesculi)，与有性型B.dothidea 相对应，此鉴定与国内外学者近年来的研究结果相符合。

本试验依据菌落特征将供试菌系划分为2个菌落类群: 类群Ⅰ为典型喷泉状菌落，类群Ⅱ为平伏状菌落。但从rDNA-ITS，β-tubulin和EF-1α基因序列系统进化树分类来看，不同菌落特征菌系之间并未表现明显差异。具有平伏状菌落特征的Fhbm，Fzwh3 2菌系均与大多数典型喷泉状菌落特征的菌系一起被聚在同一分子系统类群中(GroupⅠ)，显示它们之间的亲缘关系很近，序列无差异。虽然培养性状与分生孢子形态特征为该病原真菌分类鉴定提供了基本依据，但试验菌系的培养性状易受培养基成分、培养温度和培养时间等因素影响，不同菌系之间、甚至同一菌系不同重复之间的形态特征都有一定差异，仅仅依靠培养特征并不足以对Botryosphaeria属真菌做出符合其亲缘关系的分类(赵嘉平等，2007)，因此需要用分子系统学方法来验证形态学鉴定结果，此为Botryosphaeria spp.分类学研究趋势(Slippers et al.，2004)。

本研究中杨树水泡型溃疡病菌诸菌系3个基因位点的系统分析结果大致相似。所有供试菌系均与GenBank 中报道的Botryosphaeria dothidea序列聚在一起，而与B.parva和B.ribis亲缘关系远，该结果证实本研究根据培养学特征对杨树水泡型溃疡病菌种的鉴定结论是正确的。从rDNA-ITS 序列系统发育树来看，宝鸡陇县菌系Fldh1独立成群，与B.dothidea种内其他地域菌系的亲缘关系明显较远，但该菌系在β-tubulin和EF-1α系统树中均被划归GroupⅠ中，且在培养性状和分生孢子形态特征上与其他菌系并无差异。来自杨凌的3个菌系Fyrg，Fyxj和Fyxn 在β-tubulin，EF-1α基因序列构建的NJ树中均聚在一起，且独立成群; 咸阳的Fxfh，Fxdh2 和Fxdh23菌系也在EF-1α基因序列系统树中独立成群，表明Fusicoccum aesculi种内诸菌系间存在一定的遗传分化。杨凌揉谷菌系Fyrg和户县白庙菌系Fhbm 的培养性状表现特殊，即在PDA培养基上很难产生无性繁殖体; 接种证明周至菌系Fzwh、凤县菌系Ffhn及城固菌系Fcsh表现出较其他地域菌系强的致病性。这些表明F.aesculi在陕西存在一定的生理分化现象。但总的来看，供试菌系之间在培养性状、分生孢子形态及致病性等方面的差异与其分子系统发育类群分化并不存在明显对应关系，其机制还需进一步研究。