植物体细胞胚胎发生作为一种高效的无性繁殖技术，是利用植物细胞工程手段实现植株再生的重要途径之一。自Hakman等(1985)首次利用欧洲云杉(Picea abies)未成熟合子胚为外植体实现针叶树体胚发生以来，体细胞胚胎发生技术对针叶树种的研究产生了重要影响。传统的针叶树种繁殖方法为种子繁殖和扦插繁殖;种子繁殖具有遗传变异大、性状遗传不稳定等缺点，而扦插繁殖存在繁殖系数低的不足。在针叶树种的育种工作中，通过体细胞胚胎发生和植物细胞超低温保存技术相结合的策略，可以在很大程度上解决这些难题(Nørgaard et al.，1993;Touchell et al.，2002;Gale et al.，2008;Krajňáková et al.，2011)。这种策略具体为:首先获得大量的胚性细胞系，将某一个细胞系的一部分细胞分化成体细胞胚并形成植株，进行田间对比试验，筛选优良细胞系，同一个细胞系的另一部分细胞则进行超低温保存;对于筛选得到的优良细胞系，将遗传信息一致的超低温保存材料，通过体胚发生技术进行大规模繁殖，以实现良种的有效使用。而这种育种策略实现的前提，首先是获得高效的体细胞胚胎发生技术体系。利用体细胞胚胎发生技术，避免了针叶树种结实晚、种子遗传变异大和扦插繁殖系数低的风险，加快了良种的使用进程，同时对推动针叶树种无性系林业的发展也起到了重要作用。

云杉属(Picea)树种全世界约40种，我国云杉属树种资源丰富，有16种9变种(中国植物志编辑委员会，1978)。白云杉(P.glauca)(Lu et al.，1987)、黑云杉(P.mariana)(Tautorus et al.，1990)、红云杉(P.rubens)(Harry et al.，1991)、欧洲云杉(Hakman et al.，1985)、库页云杉(P.glehnii)(Ishii，1995)、西加云杉(P.sitchensis)(Krogstrup et al.，1988)、恩氏云杉(P.engelmannii)(Webster et al.，1990)、塞尔维亚云杉(P.omorika)(Budimir et al.，1992)等云杉属树种的体细胞胚胎发生技术已有报道。然而，尽管欧洲云杉、白云杉和黑云杉等树种的体细胞胚胎发生技术已经用于生产实践，云杉属仍然有很多树种的体胚发生技术不成熟。目前，以欧洲云杉为代表的云杉属树种的体细胞胚胎发生研究，被认为是针叶树体细胞胚胎发生研究的一类模式植物研究;已经开展了从细胞学水平到分子水平的全面探索，尤其是刚刚完成的欧洲云杉(Nystedt et al.，2013)和白云杉(Birol et al.，2013)的全基因组测序图谱，对阐明针叶树种的体细胞胚胎发生机制将发挥巨大作用。从20世纪80年代以来，国内相继对原产我国的云杉属树种的体细胞胚胎发生进行了研究，其中，青杄(P.wilsonii)(李映红等，1990)、白杄(P.meyeri)(杨金玲等，1997)、红皮云杉(P．koraiensis)(刘宝光等，2009)、沙地云杉(P．mongolica)(郭小兵等，2009)、丽江云杉(P．likiangensis)(陈芳等，2010)的体细胞胚胎发生研究已有报道;然而，上述研究通常存在胚性愈伤组织诱导率低、体细胞胚分化差且同步化程度不高等不足。

云杉(Picea asperata)为我国特有种，其生长快、适应性强、材质优良，多分布在海拔2 400～3 600 m的高山丘陵地带(中国植物志编辑委员会，1978);云杉是川西高原、甘肃南部和陕西西南部等亚高山地区的主要造林树种，也是该地区森林演替的顶极群落和地带性植被的建群种(四川省粗枝云杉纸浆材协作组，2001;罗建勋等，2006)。目前，云杉的繁殖以种子繁殖和扦插繁殖为主(罗建勋等，2006;李奇等，2007)。关于云杉的体细胞胚胎发生的研究尚无报道。本文以云杉未成熟合子胚为外植体，研究了球果采集日期、基因型和植物生长调节剂对胚性愈伤组织诱导的影响，对影响体细胞胚分化的多个关键因素进行探讨，建立了稳定且同步化程度较高的云杉体细胞胚胎发生技术体系，为实现体细胞胚的工厂化育苗奠定了理论基础并提供了切实可行的方法。

云杉未成熟球果采自甘肃省小陇山林业实验局林业科学研究所，球果来源于云杉国家级种质资源库中结实量大、树干通直且生长相对一致的3株母树(即3个基因型)，采集日期分别为2011年07-17，07-27，08-07，08-17，08-27，09-06，09-16和09-26，每个单株每次采集10个球果，及时接种(图 1a，b，c)。

	图 1 云杉体细胞胚胎发生过程 Fig. 1 Somatic embryogenesis of Picea asperata

将未成熟球果在无菌条件下用95%的酒精浸泡15 min，随后用无菌水冲洗3次，即完成消毒过程。在超净工作台上，用解剖刀从灭菌的球果中取出未成熟种子;在解剖镜下将未成熟的合子胚从种子中取出，直接接种在约有35 mL培养基的直径为90 mm的培养皿中，每个处理设置3个重复，一皿一个重复，每个皿中接种10个完整的未成熟胚。

采用1/2LM培养基(Litvay et al.，1985)为基本培养基，2，4-D浓度分别为1.1，2.2，3.3 mg·L^-1，6-BA浓度分别为0.55，1.1，2.2 mg·L^-1，培养基中附加蔗糖10 g·L^-1，凝胶(Sigma #)2 g·L^-1，酶解酪蛋白(Sigma #)1 g·L^-1，谷氨酰胺(过滤灭菌，Sigma #)0.5 g·L^-1，pH5.8。生长调节剂的不同浓度、3个基因型和8个采集日期间采用完全随机区组设计，共计216个处理。(23±1)℃下暗培养，7周后统计诱导结果。

1/2LM+2，4-D 2.2 mg·L^-1+6-BA 1.1 mg·L^-1。蔗糖10 g·L^-1，凝胶2 g·L^-1，酶解酪蛋白1 g·L^-1，谷氨酰胺0.5 g·L^-1，pH5.8。继代转接时挑选最新生长的胚性愈伤组织，每2周转接1次，(23±1)℃下暗培养。

以2333号胚性细胞系为分化材料，1/2LM为基本培养基，设置脱落酸(ABA，过滤灭菌，Gibco#)8，12，16，24 mg·L^-1;聚乙二醇(PEG4000，Merck#)0，25，50，75 g·L^-1;蔗糖10，30，60，90 g·L^-1;活性炭(Sigma#)0，1，3，5 g·L^-1;凝胶2，4，6，8 g·L^-1。附加水解酪蛋白(Sigma#)1 g·L^-1，谷氨酰胺0.5 g·L^-1，pH5.8。试验采用5因素4水平的正交试验设计L16(45)。每个培养皿中放置1张Whatman滤纸，将1 g左右的胚性愈伤组织平铺到滤纸上;每个处理设置4个重复，一皿一个重复，(23±1)℃下暗培养，6周后统计体细胞胚的诱导结果。

1/4LM为基本培养基，不添加激素，附加活性炭1 g·L^-1，蔗糖20 g·L^-1，水解酪蛋白1 g·L^-1，谷氨酰胺0.5 g·L^-1，凝胶4 g·L^-1，pH5.8。将发育正常的体细胞胚水平放置在培养基上，培养皿倾斜45°放置。第1周黑暗培养;第2周20 μmol·m^-2 s^-1光照下培养，并用2层报纸遮盖;之后20 μmol·m^-2 s^-1全光照培养;光周期为16 h光照，8 h黑暗。(23±1)℃下培养。

胚性愈伤组织诱导频率(%)=诱导出胚性愈伤组织的未成熟胚个数/接种的未成熟胚个数×100%;分化接种量=接种胚性愈伤组织后的培养皿质量-接种前的培养皿质量-滤纸质量;成熟体细胞胚的诱导率(胚·g-1)=培养皿中分化的体细胞胚数/分化接种量。百分率数据先进行反正弦转换再进行分析，数据采用SPSS 16.0进行方差分析，最小显著差数法(LSD法)进行多重比较。

诱导试验采用对球果直接灭菌、然后剥取未成熟胚进行诱导的方法。该方法避免了对外植体的伤害，可使污染率控制在1%以内。未成熟胚接种到愈伤组织诱导培养基中3天后，合子胚开始启动，具体表现为胚膨大，胚轴基部有褐色突起出现，子叶分化出“点状突起”;1周后整个合子胚转变为愈伤组织，2周后胚性愈伤组织开始出现，随后胚性愈伤组织增殖连同非胚性愈伤组织逐渐长大，6～7周后即可将胚性愈伤组织单独分开增殖。非胚性愈伤组织多由胚轴分化而来，生长快速，多数为褐色颗粒状，分化时不能够产生正常的体细胞胚;胚性愈伤组织多数由子叶分化的“点状突起”转化而来，具体表现为白色、透明、黏稠、丝状，且具备分化出发育正常的体细胞胚的能力(图 1d，e)。所有诱导处理中，愈伤组织诱导率近乎100%，胚性愈伤组织诱导率差异显著。

球果采集日期对云杉胚性愈伤组织诱导率有极显著(P＜0.01)影响，多重比较见表 1。其中，7月17日采集的球果获得的胚性愈伤组织诱导率和其他采集日期相比提高显著，平均诱导率为35.25%，最高可达到65%以上;到7月27日时，胚性愈伤组织诱导率开始极显著降低;9月16日开始，诱导率极显著地降低到1%以下甚至不能诱导出胚性愈伤组织。由此可知，云杉胚性愈伤组织诱导的最佳球果采集日期应该为7月17日，即7月中旬，最迟不能超过7月27日，否则会极显著降低胚性愈伤组织的诱导效果。

表 1 球果采集日期对胚性愈伤组织诱导的影响^① Tab.1 Effect of cone collection dates on the induction of embryogenic callus

表 1 球果采集日期对胚性愈伤组织诱导的影响① Tab.1 Effect of cone collection dates on the induction of embryogenic callus 球果采集日期Cone collection date 外植体数Number of explants 诱导率Induction frequency(±SD)(%) 07-17 810 35.25±23.71 A 07 -27 810 25.64±17.62 B 08-07 810 12.19±9.46 C 08-17 810 13.01±12.68 C 08-27 810 15.46±14.84 C 09-06 810 15.09±14.80 C 09-16 810 0.25±1.56 D 09-26 810 0D

基因型对云杉胚性愈伤组织诱导率有极显著(P＜0.01)影响，多重比较见表 2。以基因型2的胚性愈伤组织诱导率最高，平均达到21.78%。在胚性愈伤组织诱导能力方面，基因型1号和3号无显著性差异，且二者均比2号基因型低10%左右。说明开展云杉体细胞胚胎发生研究时，应当加大基因型的选择范围，以筛选得到较高胚性愈伤组织诱导能力的基因型，进而加快体胚繁育进程。

表 2 基因型对胚性愈伤组织诱导的影响 Tab.2 Effect of genotypes on the induction of embryogenic callus

表 2 基因型对胚性愈伤组织诱导的影响 Tab.2 Effect of genotypes on the induction of embryogenic callus 基因型Genotype 外植体数Number of explants 诱导率Induction frequency (±SD) (%) 1 2 160 15.60±14.08 A 2 2 160 21.78±21.32 B 3 2 160 10.90±14.20 A

2，4-D对云杉胚性愈伤组织诱导率有极显著(P＜0.01)影响，多重比较见表 3。2.2 mg·L^-1 2，4-D处理下的胚性愈伤组织诱导率最高，平均为17.14%;2，4-D浓度为2.2 mg·L^-1处理和3.3 mg·L^-1处理间无显著性差异，但是二者与1.1 mg·L^-1处理下的胚性愈伤组织诱导率相比均有极显著升高。高浓度的植物生长素不利于胚性愈伤组织的增殖和分化，本试验选择2.2 mg·L^-1作为植物生长素2，4-D的最佳浓度。

表 3 2，4-D 对胚性愈伤组织诱导的影响 Tab.3 Effect of 2,4-D on the induction of embryogenic callus

表 3 2，4-D 对胚性愈伤组织诱导的影响 Tab.3 Effect of 2,4-D on the induction of embryogenic callus 2,4-0浓度 2,4-D concentration/(mg•L -1) 外植体数Number of explants 诱导率Induction frequency (±SD)(%) 1.1 2 160 10.70 ± 14.20 A 2. 2 2 160 17.14 ± 20.43 B 3.3 2 160 16.0 ± 17.53 B

6-BA对云杉胚性愈伤组织诱导率有极显著(P＜0.01)影响，多重比较见表 4。其中，6-BA浓度为0.55 mg·L^-1处理和2.2 mg·L^-1处理间无显著性差异，但是二者与1.1 mg·L^-1处理下的胚性愈伤组织诱导率相比均极显著降低。以1.1 mg·L^-1 6-BA处理下的胚性愈伤组织诱导率最高，平均为16.58%。

表 4 6-BA 对胚性愈伤组织诱导的影响 Tab.4 Effect of 6-BA on the induction of embryogenic callus

表 4 6-BA 对胚性愈伤组织诱导的影响 Tab.4 Effect of 6-BA on the induction of embryogenic callus 6-BA 浓度6-BA concentration/(mg·L-1) 外植体数Number of explants 诱导率Induction frequency (±SD)(%) 0.55 2 160 13.87±17.60 A 1.1 2 160 16.58±19.13 B 2.2 2 160 13.39±16.39 A

合子胚在诱导培养基中诱导7周左右后，胚性愈伤组织和非胚性愈伤组织可以明显区分。此时，将胚性愈伤组织单独挑出增殖，增殖培养基为最佳的诱导培养基，即1/2LM基本培养基+2，4-D 2.2mg·L^-1+6-BA 1.1 mg·L^-1。每次转接时，1个培养皿中增殖7～8块直径0.5 cm的胚性愈伤组织，2周转接1次，2个月后即可形成一定规模的胚性细胞系(图 1f，g)。

胚性愈伤组织接种在分化培养基中2天后，球形胚开始出现，随后球形胚数量增多;7天以后部分球形胚转变为鱼雷形胚，随后鱼雷形胚数量继续增多;3周以后部分球形胚开始进入子叶胚状态，5周以后，子叶胚明显，进入成熟状态;整个体细胞胚分化过程中未见到心形胚。成熟的体细胞胚健壮，胚轴明显，整个体细胞胚呈淡黄色(图 1h)。正交试验中，以处理15和16获得的体细胞胚数量最多，平均每克胚性愈伤组织分化的体细胞胚分别为261个和287个。方差分析见表 5，分化结果见图 2。

表 5 不同分化处理方差分析 Tab.5 Variance analysis of different differentiation treatments

表 5 不同分化处理方差分析 Tab.5 Variance analysis of different differentiation treatments 来源Source 自由度df 均方MS F Sig． 脱落酸aba 3 22 455.306 7.301 0.000 聚乙二醇PEG4000 3 32 850.423 10.681 0.000 蔗糖 Sucrose 3 98 822.804 32.131 0.000 活性炭 Activated carbon (AC) 3 9 133.503 2.970 0.046 凝胶 Gellan gum 3 11 084.414 3.604 0.024 误差Error 32 3 075.575

	图 2 不同分化因素处理下体细胞胚的分化结果 Fig. 2 Somatic embryos maturation results under different factors treatments

ABA被广泛用于针叶树体细胞胚的诱导和成熟。ABA对云杉体细胞胚的分化具有极显著影响，其中以24mg·L^-1的ABA处理获得的发育正常的体细胞胚数量最多，每克平均有138个。

作为一种重要的渗透调节剂物质，适当的聚乙二醇处理可以调节分化细胞的渗透压，对体细胞胚的分化有显著促进作用。PEG4000对云杉体细胞胚的分化具有极显著影响，其中以50 g·L^-1的PEG4000处理获得的体细胞胚最多，每克平均有122个。

蔗糖作为重要的碳源和渗透调节剂物质，在体细胞胚分化过程中发挥着重要作用。蔗糖对云杉体细胞胚的分化具有极显著影响。60 g·L^-1和90 g·L^-12个蔗糖浓度处理下几乎无成熟体细胞胚产生，推测可能是因为渗透压过高，抑制了体细胞胚的产生。10 g·L^-1和30 g·L^-12个蔗糖浓度处理下获得的体细胞胚数量较多;尽管二者的处理获得的体细胞胚数量差异不显著，但是，低浓度蔗糖处理下获得的体细胞胚多细小，萌发率较低，推测可能是碳源不足、体细胞胚发育不正常所致;而30 g·L^-1蔗糖处理下获得体细胞胚健壮，萌发率高。因此，本试验中最佳的蔗糖处理浓度为30 g·L^-1，每克平均有168个。

活性炭对云杉体细胞胚的分化具有显著影响。添加活性炭能够有效促进体细胞胚的分化，添加不同浓度活性炭的处理间体细胞胚的分化没有显著性差异，以1 g·L^-1的活性炭处理获得的体细胞胚数量最多，每克平均有105个。

凝胶作为一种固化剂，在成熟培养基中适当提高凝胶浓度能够促进体细胞胚的分化。凝胶对云杉体细胞胚的分化具有显著影响。随着凝胶浓度的提高，体细胞胚的分化数量呈现先增加后降低的现象，即在分化培养基中凝胶浓度过高或者过低都会显著抑制体细胞胚的分化。最佳的凝胶浓度为4 g·L^-1，每克平均有126个。

分化的云杉体细胞胚成熟以后，挑选发育正常、生长健壮、子叶4枚以上的体细胞胚进行萌发，不添加激素。先黑暗培养1周，黑暗培养第3天时，体细胞胚开始明显萌动，整个体胚开始膨大;第7天时，子叶变绿，胚轴伸长，胚根生长点明显。转到光下第1周时，子叶展开，胚轴继续伸长，胚根开始伸长。待子叶正常伸展且白色胚根伸长大于0.5 cm时，即可移栽到营养土块中生长(图 1i，j)。

选择合适的外植体对针叶树胚性愈伤组织的诱导来说至关重要(Claudio et al.，2003);事实上，同一树种的不同外植体类型，同一类型的外植体发育的不同阶段对离体培养条件的响应都存在显著差异(Ramarosandratana et al.，2003;Roberts et al.，1989)。针叶树体细胞胚胎发生过程中，合子胚是最常用的外植体;使用成熟合子胚为诱导外植体在黑云杉(Tautorus et al.，1990)、红云杉(Harry et al.，1991)、杉木(Cunninghamia lanceolata)(席梦利等，2006)、北美云杉(Picea pungens)(孙敬爽等，2010)等树种体胚的研究上已有报道。尽管成熟的合子胚具有种子量大、诱导过程操作简单且试验不受时间限制的特点，但是上述研究表明，以成熟的合子胚为外植体获得的胚性愈伤组织诱导率普遍不高。

大量研究证实，以未成熟的合子胚为材料可以显著提高胚性愈伤组织的诱导率。Tautorus等(1990)采用相同的诱导条件，使用黑云杉未成熟合子胚为外植体，胚性愈伤组织的诱导率比贮藏13年的成熟合子胚高57%;在对冷杉(Abies fraseri)进行胚性愈伤组织诱导时发现，最佳的合子胚诱导日期是6月下旬至7月上旬，随着合子胚成熟程度的不断增加，胚性愈伤组织的诱导能力显著降低(Kim et al.，2009);吕守芳等(2005)以日本落叶松(Larixkaempferi)未成熟胚、成熟胚、胚根和胚轴等为外植体进行体胚研究时发现，只有未成熟合子胚能够诱导出胚性愈伤组织;赵晓敏等(2007)以兴安落叶松(Larix gmelinii)不同发育时期的合子胚为诱导材料，表明处在子叶初期的合子胚诱导胚性愈伤组织的能力最强;吴丽君等(2008)认为发育在第2，3，4阶段的火炬松(Pinus taeda)合子胚为胚性愈伤组织诱导的最佳外植体。本试验中，以未成熟的合子胚为材料，随着种子成熟程度的增加，胚性愈伤组织的诱导率呈现急剧下降的趋势，说明未成熟的合子胚较适合云杉的胚性愈伤组织的诱导;7月中旬时胚性愈伤组织的诱导能力最强，此时，合子胚发育处于早期子叶胚阶段，这与前人的研究结果相似。

体细胞胚胎发生过程中，基因型间由于存在遗传基础的差异，胚性愈伤组织的诱导能力常差异显著。以北美乔松(Pinus strobus)14个基因型的未成熟合子胚为外植体进行诱导时发现，不同基因型间胚性愈伤组织的诱导能力存在极显著差异，并且基因型和采集日期的交互效应及基因型与培养基的交互效应对胚性愈伤组织的诱导均有显著性影响(Klimaszewska et al.，2001)。Lelu-Walter等(2006)以海岸松(Pinus pinaster)控制授粉的8个基因型未成熟合子胚为外植体，发现胚性愈伤组织的诱导能力与杂交亲本双方及特定的基因型关系密切。本试验中，云杉不同基因型之间胚性愈伤组织的诱导能力存在极显著差异。因此，在开展云杉体细胞胚胎发生研究时，为获得诱导能力较强的单株，应该扩大优良基因型的筛选力度。植物生长调节剂是诱导合子胚产生胚性愈伤组织的关键外源激素，在细胞保持增殖过程中同样发挥着重要作用。其中，以植物生长素2，4-D和细胞分裂素6-BA最为常用。在云杉胚性愈伤组织的诱导中，2，4-D和6-BA对胚性愈伤组织的诱导产生了极显著影响。增殖过程中，在2，4-D和6-BA的作用下，随着蛋白和淀粉等贮藏物质的积累，胚性细胞团不断增大(Silveira et al.，2004)。

诱导针叶树胚性愈伤组织分化产生体细胞胚的因素很多，脱落酸(ABA)是最为关键的因素。ABA不仅能够促使增殖的胚性愈伤组织进入分化状态，促进体细胞胚的成熟，而且对提高体细胞胚的质量，抑制体细胞胚的提前萌发也有重要作用(Pullman et al.，2003;Rai et al.，2011)。本文中，不同ABA浓度下云杉胚性愈伤组织的分化能力具有极显著差异。大量研究表明，在分化过程中，ABA和聚乙二醇(PEG)联合使用，可以显著促进针叶树体细胞胚的成熟(Nørgaard，1997;Stasolla et al.，2002)。PEG作为一种重要的渗透调节物质，能够调节培养基的渗透压，使待分化细胞处在一个相对适中渗透环境，从而有利于体细胞胚的分化。研究表明，PEG4000对云杉体细胞胚的产生和成熟具有极显著促进作用。蔗糖除作为碳源外，也是一种重要的渗透调节物质，有利于体细胞胚干物质的积累，能够促进体细胞胚的正常发育尤其是子叶胚的形成(Krajňáková et al.，2009)。本试验中，蔗糖能够极显著促进云杉体细胞胚的成熟。活性炭具有改变培养基的理化性质、吸附或者抑制有毒物质、降低组织内的激素水平等多重作用，尤其在分化阶段，能够促进细胞发育(von Aderkas et al.，2002)。云杉体胚分化过程中，适量的活性炭能够有效提高胚性愈伤组织的分化能力。合适的凝胶浓度对植物体细胞胚的产生同样有重要作用，凝胶浓度过低会使待分化细胞水分含量增多，抑制体细胞胚的产生;而凝胶浓度过高，又会使待分化细胞失水严重，同样不利于体胚的分化和成熟;研究(Ramarosandratana et al.，2001)表明，较高浓度的凝胶能够促进植物体细胞胚的成熟。本文中，与增殖培养基相比，凝胶浓度加倍能够显著促进云杉体细胞胚的分化和成熟。

植物体细胞胚胎发生是个极为复杂的发育过程，从外植体的选择到胚性愈伤组织的诱导，由胚性愈伤组织的增殖和分化到体细胞胚的萌发，其间涉及非常多的因素，而每一步的顺利实施与否，又影响着下一步的进行。本文成功建立了稳定且同步化程度较高的云杉体细胞胚胎发生技术体系，为云杉的工厂化育苗开辟了一条新途径;同时，获得了发育各阶段丰富的研究材料，为开展遗传转化研究建立了良好的试验体系，也为开展云杉的遗传改良研究提供了科学依据。为了获得更高的胚性愈伤组织诱导率和高度胚性的细胞系，今后应适当提早球果的采集日期，并进一步扩大基因型的筛选力度，以筛选出更为理想的球果成熟状态和一大批高胚性愈伤组织诱导能力的单株。同时，在实验室水平，通过构建液体悬浮增殖体系和液体中体细胞胚发生技术体系，模拟生物反应器实现云杉体细胞胚胎发生的研究有待进一步深入。