真核翻译起始因子5A(eukaryotic translationinitiation factor 5A，eIF5A)是真核生物中广泛存在且目前已知唯一含有羧腐胺赖氨酸残基的一类蛋白质。羧腐胺赖氨酸是由eIF5A翻译后特定位置的赖氨酸经脱氧羧腐胺赖氨酸合酶(deoxyhypusinesynthase，DHS)和脱氧羧腐胺赖氨酸羟化酶(deoxyhypusine hydroxylase，DHH)2步酶促反应催化生成的(Liu et al.，2008)，修饰后的eIF5A才具有生物学功能(Wang et al.，2012)。最初eIF5A被认为在蛋白翻译起始中起重要作用，但最近的研究推测其在蛋白延伸过程中也发挥着重要作用(Dias et al.，2012)。

目前，已有多个eIF5A基因从拟南芥(Arabidopsis thaliana)、烟草(Nicotiana tabacum)、白花柽柳(Tamarix and rossowii)等多种植物中分离出来(Wang et al.，2012)。不同的eIF5A成员具有不同的生物学功能。如AteIF5A1参与了拟南芥木质部形成(Liu et al.，2008);AteIF5A2参与了拟南芥程序化死亡(programmed cell death，PCD)(Hopkins et al.，2008);AteIF5A3参与了植物生长发育过程(Ma et al.，2010)。在烟草中，eIF5A和DHS受到抑制后，转基因植株的抗逆性显著增强(Duguay et al.，2007;Xu et al.，2011)。月季(Rosa chinensis)RceIF5A响应高温、渗透和氧化胁迫，过量表达RceIF5A的转基因拟南芥较野生型更加耐受渗透、过氧化和高温胁迫，而减量表达RceIF5A的转基因拟南芥(拟南芥中3个eIF5A成员表达均下调)较野生型更敏感(Xu et al.，2011)。在白花柽柳中，TaeIF5A1参与了高盐、重金属、 ABA等胁迫响应过程，山新杨(Populus davidiana×P. bolleana)中过表达白花柽柳TaeIF5A1后，转基因植株在山梨醇、CuSO₄、 CdCl₂等非生物胁迫下，表现出明显的抗性(Wang et al.，2012)。现有的研究表明，eIF5A参与了植物的生长发育及响应各种非生物胁迫(Chen et al.，1996;Tome et al.，1996;Wang et al.，2012)，但杨树eIF5A各成员确切的生物学功能还不明晰。

杨树是世界中纬度平原地区栽培最为广泛的树种之一，也是我国主要的用材树种，同时，因其生长速度快、基因组相对较小，已成为林木研究中的模式植物。了解杨树eIF5A基因在不同逆境因子中的作用，对林木抗逆分子辅助育种具有非常重要的意义。本研究利用从毛白杨(Populus tomentosa)中克隆到的PtoeIF5A2，详细分析了其在ABA、低温、干旱和高盐胁迫下不同处理时间的表达情况。同时，通过对其启动子序列的分析，初步阐释了PtoeIF5A2的抗逆功能，为对其生物学功能的进一步研究奠定了坚实的基础。

试验材料为温室生长的塔形毛白杨‘BJHR01’(P. tomentosa cv. ‘BJHR01’)幼苗，本文中未做特殊说明的材料均选自6个月幼苗。植物总RNA提取试剂盒和植物基因组DNA提取试剂盒购自Tiangen公司，反转录试剂盒购自美国Invitrogen公司，Phusion DNA聚合酶购自美国Thermo公司，T4连接酶、 pGEM-T Easy载体和DNA回收试剂盒购自美国Promega公司，SYB Green I荧光定量PCR试剂盒和3'RACE试剂盒购自日本Takara公司。

选取苗龄2个月的毛白杨幼苗的主根、茎和叶片，液氮速冻后，采用Tiangen公司植物总RNA提取试剂盒提取总RNA。按照Invitrogen公司反转录试剂盒合成cDNA。参考毛果杨(Populus trichocarpa)PtreIF5A2的全序列，在5' UTR区设计引物(PtoeIF5A2 outer primer F和PtoeIF5A2 inner primerF，见表 1)进行3' RACE，3' RACE按照Takara公司3'RACE试剂盒操作说明完成。在5'UTR和3'UTR区设计引物，使用巢式PCR扩增编码区，PCR反应体系如下，第1轮:毛白杨cDNA 2.0 μL，10μmol·L-1外侧上下游引物(PtoeIF5A2 outer primerF/R，见表 1)各1 μL，2 U·μL^-1 Phusion DNA聚合酶0.2 μL，2.5 mmol·L^-1 dNTPs 1.6 μL，5×PhusionHF Buffer(Mg²⁺)4.0 μL，ddH₂ O 10.2 μL。反应条件为: 98 ℃ 30 s，98 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃1 min，72 ℃总延伸10 min，30个循环。第1轮PCR结束后，将PCR产物按照DNA回收试剂盒操作要求进行纯化，然后进行第2轮PCR。反应体系为:第1轮PCR纯化产物2.0 μL，10 μmol·L^-1内侧上下游引物(PtoeIF5A2 inner primer F/R，见表 1)各1 μL，2 U·μL^-1 Phusion DNA聚合酶0.2 μL，2.5 mmol·L^-1dNTPs 1.6 μL，5×Phusion HF Buffer(Mg²⁺)4.0 μL，ddH₂ O 10.2 μL。反应条件为98 ℃预变性30 s;98 ℃变性10 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环;72 ℃总延伸10 min。PCR结束后，1%琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的片段并连接到pGEM T-Easy载体上，测序委托上海英骏生物技术公司完成。

表 1 试验中设计的引物 Tab.1 Primers designed in this experiment

表 1 试验中设计的引物 Tab.1 Primers designed in this experiment 引物名称 Primer name 引物碱基序列 Sequences of the primers(5'—3') PtoeIF5A2 outer primer F CAGAGTCATCGTCCTCTTTCAC PtoeIF5A2 outer primer R CATCAGGGAATCAGCATTTCC PtoeIF5A2 inner primer F GAATCGATCCAAGCCTAACTAA PtoeIF5A2 inner primer R CGTTTTGCCATCAGCTACAG PtoeIF5A2 promoter primer F GAGAGGCAAACAACACATC PtoeIF5A2 promoter primer R AGAACAGGTGAAAGAGGACG PtoeIF5A2 qRT-PCR primer F GTAGCTGATGGCAAAACGATTTCT PtoeIF5A2 qRT-PCR primer R GCATTTCCCGGGTCCTTCCCA PtoACT9 qRT-PCR primer F TTGCTGACCGTATGAGCAAG PtoACT9 qRT-PCR primer R AATCCACATCTGCTGGAAGG

选取苗龄2个月的毛白杨幼苗的叶片，液氮速冻后，按照Tiangen公司的植物基因组DNA提取试剂盒操作说明提取DNA，通过毛果杨基因组文库分析，参考预测的毛果杨PtreIF5A2的编码区上游2.0 kb左右的序列，设计引物进行扩增。PCR扩增体系如下:毛白杨基因组DNA 2.0 μL，10 μmol·L^-1上下游引物(PtoeIF5A2 promoter primer F/R，见表 1)各1 μL，2 U·μL^-1 Phusion DNA聚合酶0.2 μL，2.5 mmol·L^-1 dNTPs 1.6 μL，5×PhusionHF Buffer(Mg²⁺)4.0 μL，ddH2 O 10.2 μL。反应条件为98 ℃ 30 s，98 ℃ 10 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，72 ℃总延伸10 min，30个循环。1%琼脂糖凝胶电泳后，将目的片段连接到pGEM T-Easy载体上测序。测序委托上海英骏生物技术公司完成。

用毛果杨基因组文库(http:∥genome.jgi-psf.org/Poptr1_1/)获取毛果杨基因序列。用PLACE在线预测软件(http:∥www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)预测启动子顺式作用元件。用NCBI数据库中的blast软件进行序列比对。用ProtParam程序预测蛋白质的分子质量和等电点。用DNAMAN和ClustalW软件进行同源序列比对，采用MEGA4.0软件中的邻接法(neighbor-joining)构建进化树，根据P-distance参数模型，通过Bootstrap作置信度检验，次数为1 000次。

选取毛白杨的幼根、茎和叶片，分别提取RNA，经反转录cDNA后，Real-Time qRT-PCR检测PtoeIF5A2在毛白杨不同组织中表达水平。取毛白杨分别进行ABA(200 μmol·L^-1)、NaCl(300mmol·L^-1)、低温(4 ℃)和干旱处理(Chen et al.，2009)，每个处理3次重复且每次取5株，分别在0，1，3，6，12，24 h取成熟叶片提取RNA以检测PtoeIF5A2的表达水平。

预测的毛白杨PtoeIF5A家族有4个基因成员，因各成员间编码区高度保守，因此在3'UTR区设计引物(PtoeIF5A2 qRT-PCR primer F/R，见表 1)。分别选取不同组织和胁迫处理的叶片的cDNA为模板，以毛白杨Actin9基因作为内参基因，在ABI公司StepOnePlus^TM荧光定量PCR仪中进行实时定量反应。每个试验设3次重复，反应体系为20 μL，方法参照Takara公司荧光定量试剂盒说明书，PCR反应条件如下: 95 ℃预变性30 s;95 ℃变性5 s，60 ℃退火延伸1 min，共40个循环。根据每个反应得到相应的C_t值，用2^-ΔΔCt法计算该基因表达差异。

以2个月的毛白杨幼苗总RNA反转录cDNA为模板，3' RACE和巢式PCR扩增后，1%琼脂糖凝胶电泳检测，分别在800 bp和500 bp处出现1条特异的条带(图 1)，与预期的目标条带大小一致。测序结果显示:该基因包含483 bp开放读码框，编码160个氨基酸(图 2)。预测蛋白分子质量为18kDa，等电点为5.76。同毛果杨PtreIF5A2序列编码区相比，在核苷酸水平上相似性为99.59%，氨基酸水平上相似性为100%。3'端非翻译区为终止密码子后240 bp。

图 1 毛白杨 PtoeIF5A2 基因的扩增 Fig. 1 Amplification of PtoeIF5A2 gene A: 毛白杨 PtoeIF5A2 基因 3'端非翻译区扩增 1． DNA 标准; 2. 3' RACE 扩增 PtoeIF5A2 基因 3' 端非翻译区。B: 毛白杨 PtoeIF5A2 基因的扩增 1． DNA 标准; 2． PCR 扩增 PtoeIF5A2 基因编码区。 A: Amplification of 3' non-coding region of PtoeIF5A2 gene 1. DNA standard marker; 2. Amplification of 3' non-coding region of PtoeIF5A2 gene by 3' RACE． B: Amplification of PtoeIF5A2 gene 1. DNA standard marker; 2. Amplification of the coding region of PtoeIF5A2 gene by PCR．

	图 2 PtoeIF5A2 cDNA 核苷酸序列和由此推测的氨基酸序列 Fig. 2 Nucleotide and deduced amino acid sequence of the PtoeIF5A2 cDNA

为研究PtoeIF5A2与其他物种eIF5A的同源性关系，从NCBI网站上获取已注册的其他物种22个eIF5A氨基酸序列，利用软件MEGA4.0软件中的邻接法(neighbor-joining)构建系统发育树(图 3)。系统发育树分析表明:单子叶植物的不同物种间eIF5A具有较高同源性，如玉米(Zea mays)和水稻(Oryza sativa);双子叶植物中也有类似的现象，如番茄(Solanum lycopersicum)、拟南芥和月季等。同一属各eIF5A成员具有高度同源性，如杨属毛白杨与美洲黑杨(Populus deltoides)的eIF5A家族内各成员具有高度同源性。

图 3 植物 eIF5A 蛋白的系统发育树 Fig. 3 Phylogenetic tree of eIF5A protein in various plants 美洲黑杨 Populus deltoides: PdeIF5A1 ( FJ032302 )， PdeIF5A2 ( FJ032303)，PdeIF5A3 ( FJ032304 )，PdeIF5A4 ( FJ032305 ); 毛白杨 Populus tomentosa: PtoeIF5A1 ( HQ529479 )， PtoeIF5A2 ( HQ529480)，PtoeIF5A3( HQ529481)，PtoeIF5A4( HQ529482); 水稻 Oryza sativa: OseIF5A1( AF094773)，OseIF5A2( AJ312906); 玉米 Zea mays: ZmeIF5A ( NM _ 001112080 ); 白花柽柳 Tamarix androssowii: TaeIF5A1 ( AY587771 )， TaeIF5A2 ( JQ040803 )， TaeIF5A3 ( JQ040804 )， TaeIF5A4 ( JQ040805 ); 番茄 Solanum lycopersicum: SleIF5A1 ( AF296083 )， SleIF5A2 ( AF296084 )， SleIF5A3( AF296085)，SleIF5A4 ( AF29608); 月季 Rosa chinensis: RceIF5A( EF177192); 拟南芥 Arabidopsis thaliana: AteIF5A1( NM_ 101261)，AteIF5A2( NM_102425)，AteIF5A3( NM_105608) ．

以毛白杨叶片基因组DNA为模板，扩增PtoeIF5A2基因启动子。1%琼脂糖凝胶电泳检测，在2.0 kb左右出现特异条带，与预测的序列大小一致。测序结果显示，克隆得到PtoeIF5A2基因编码区上游长度为1 850 bp序列。利用PLACE在线预测软件分析其启动子中顺式作用元件，结果表明，启动子序列中有核心启动子(TATA-box)、防御与胁迫响应元件(DOFCOREZM)和病原体与高盐响应元件(GT-1 box)(图 4)。

	图 4 PtoeIF5A2 基因启动子顺式作用元件预测 Fig. 4 Prediction of cis-acting elements of the PtoeIF5A2 gene promoter :核心启动子Core promoter (TATA-box);:防御与胁迫响应元件cis-acting element involved in defense and stress responsiveness (DOFCOREZM);:病原体与高盐响应元件Pathogen and salt response elements (GT-1 box).

利用Real-Time qRT-PCR技术检测PtoeIF5A2在不同组织中的表达模式并进行分析。结果显示，在毛白杨中，PtoeIF5A2在幼根、茎和叶中均有表达，其在叶中表达最高，约为茎的3.2倍、幼根的5倍(图 5)。

	图 5 PtoeIF5A2 组织特异性表达分析 Fig. 5 Quantitative real-time PCR analysis of PtoeIF5A2 gene expression in various organs

为研究毛白杨PtoeIF5A2是否与逆境胁迫响应有关，通过对毛白杨幼苗进行各种胁迫处理，用Real-Time qRT-PCR技术检测PtoeIF5A2在叶片中转录水平上的变化情况。在ABA处理3 h后，PtoeIF5A2表达出现下调，随后又出现上升趋势，在12 h出现最高峰，为未处理时2倍(图 6A)。在低温下，1～3 h，PtoeIF5A2表达处于下调状态，随后出现上调趋势，在6 h后达到高峰，为未处理时的2倍，在12 h又出现下降(图 6B)。干旱处理后，在1 h这个时间点上，PtoeIF5A2表达量轻微上调，但随后出现下降，在3，6，12，24 h的表达量基本持平(图 6C)。经NaCl处理后，PtoeIF5A2出现明显上调趋势，处理1 h后该基因的表达量达到了处理前的5倍，PtoeIF5A2表达量随时间变化出现明显上调，在处理24 h后，PtoeIF5A2表达量为未处理时的25倍(图 6D)。结果表明:在不同胁迫条件下，PtoeIF5A2表达量出现不同程度的变化，尤其是NaCl处理后，PtoeIF5A2表达量随时间变化出现明显上调且最高值为未处理时的25倍，推测该基因响应了干旱、ABA、低温胁迫，尤其是高盐胁迫。

	图 6 PtoeIF5A2 基因在不同胁迫条件下的表达分析 Fig. 6 Quantitative real-time PCR analysis of PtoeIF5A2 gene expression under different stresses

eIF5A在动、植物体内普遍存在且高度保守。研究表明其可能通过调节蛋白合成参与生物体各项生理活动(靳宝锋等，2004;Byers et al.，1994;Cano et al.，2008;Lee et al.，2002;Thompson et al.，2004)。基因组序列分析表明:不同植物中，eIF5A家族成员数目各有不同，如拟南芥3个、美洲黑杨4个、白花柽柳4个。系统发育树分析表明:同一物种的各eIF5A成员间具有高度同源性，例如毛白杨、美洲黑杨、拟南芥等。具有高度同源性的同一或相近物种的eIF5A成员却有着不同的生物学功能，以研究较为深入的拟南芥为例，拟南芥AteIF5A1主要在衰老组织和维管系统中表达，参与次生木质部的形成(Liu et al.，2008);AteIF5A2主要在受机械损伤的组织中高水平表达，参与了拟南芥的PCD过程(Hopkins et al.，2008);而AteIF5A3主要在细胞分裂活跃的种子中表达，参与了拟南芥的生长和发育(Ma et al.，2010)。具有相同或相近生物学功能的eIF5A异形体同源关系较远，如: OseIF5A1，OseIF5A2与TaeIF5A1均参与高盐和重金属胁迫(Chou et al.，2004;Wang et al.，2012)，但它们在进化关系上同源性较低。结合系统发育树分析结果推测，亲缘关系较远的物种中具有相同或相似生物学功能的eIF5A的同源性低于同种或亲缘关系较近的物种中eIF5A成员间的同源性。

在高盐胁迫下，白花柽柳TaeIF5A1在叶片中的表达量出现明显上调，处理12 h后其表达量上调了6倍，过量表达TaeIF5A1的转基因杨树的株高和底面直径均高于野生型(Wang et al.，2012)。本研究检测PtoeIF5A2在高盐胁迫下的表达量随时间变化出现明显上调的趋势，在24 h时达到处理前的25倍(图 6)。结果揭示PtoeIF5A2参与高盐胁迫。Park等(2004)对SCaM-4启动子研究表明，GT-1顺式作用元件在响应高盐胁迫过程中具有重要作用。拟南芥AtWRKY25响应高盐胁迫，其启动子中含有5个GT-1元件(付乾堂等，2010)。本研究克隆的PtoeIF5A2的启动子含有6个GT-1 box元件，结合其在高盐胁迫时的表达特性，表明PtoeIF5A2在杨树应答高盐胁迫中的重要性。因此通过转基因对PtoeIF5A2进行过量和减量表达，检测不同转基因植株在高盐胁迫下生长状态才能最终明确其在高盐胁迫中的作用。