油茶(Camellia oleifera)是我国重要的食用油料树种之一，现有栽培面积约300万hm²。自20世纪中叶以来，为发展油茶产业、获得高产稳产的优质品种，我国林业工作者选育出油茶良种200多个(林国锋等，2010)，如近年来湖南省林业科学院选育的‘湘林’系列(王湘南等，2008)，中南林业科技大学选育的‘华硕’、‘华金’、‘华鑫’(谭晓风等，2011;2012;袁德义等，2012)。油茶的授粉受精过程和胚胎发育过程与其育种有着密切的联系，其生殖生物学方面的研究已开展了部分工作。何春燕(2009)详细描述了普通油茶的花芽分化、大小孢子和雌雄配子体的发育过程;邹锋(2010)则对攸县油茶(C． yuhsienensis)性细胞的形成和发育进行了研究，并简单地阐述了其受精和胚胎发育过程。目前对于油茶的受精及其胚胎发育过程，仅有少量的文献报道。曹慧娟(1965)就详细地报道了油茶胚胎学的研究，但碍于当时显微技术的落后，未有数码显微拍摄的清晰照片，只有经显微镜观察后的手绘图稿;周良骝等(1991)也对油茶的胚胎发育进行了研究。对山茶科植物的有性生殖过程也有文献报道，其中关于花药和胚珠的发育、大小孢子和雌雄配子体的发育研究较多，而关于受精和胚胎发育的过程研究则较少(梁汉兴等，1986;彭海峰等，1997;江昌俊等，1987;刘祖生等，1987;Hwang et al．，1992;Sethi，1965;Tsou，1995;1997;Kapil et al．，1963)。

双受精是被子植物生殖发育过程的核心，持续有一些关于植物双受精作用的综述及受精作用经历的时间和历程等方面的报道(葛丽丽等，2006; Lord et al.，2002;Weterings et al.，2004;张学英等，2004;丁建庭等，2009;李冉俐等，2009)。本研究所用材料为湖南地区主栽油茶品种‘湘林XLC15’(C． oleifera ‘Xianglin XLC15’)，其树体生长旺盛，果较大，产量高，丰产性能好(王湘南等，2008)，在光镜水平上阐明其授粉受精及早期胚胎发育过程，为油茶胚胎学理论研究和遗传育种工作提供基础资料。

油茶品种‘湘林XLC15’，树高2.2 m，12年生，正常开花结实。授粉品种为油茶品种‘湘林XLJ14’(C． oleifera ‘Xianglin XLJ14’)。所有试材均采集于湖南省株洲市攸县桃水镇桃水村，27° 05' 06″ N，113°13'11″E，海拔152 m，年均气温17.8 ℃，无霜期292天，年降水量1 410 mm左右，降水集中于4—6月，占全年降水量的45%。试验园环境因素良好，水肥管理和立地条件一致，以消除外部环境因素对试验的影响。

自2011年秋季油茶开花起，收集‘湘林XLJ14’的花粉，对‘湘林XLC15’去雄后进行人工控制授粉，用硫酸纸袋套住，并挂牌标记，7天后去袋。

分别采集授粉后2，4，8，12，24，36，48，60，72，84，96，108，120 h的雌蕊，授粉后6～10天每天取样1次，10～30天每2天取样1次，30～50天每5天取样1次，50～210天每10天取样1次，每次取样10个。卡诺液[ 95%乙醇:冰醋酸(V/V)=3 : 1]固定，抽气后转入70%乙醇并保存于4 ℃冰箱中。

对授粉后2～120 h的花柱，以8 mol·L^-1 NaOH软化3～4 h后，蒸馏水冲洗干净，用0.05%水溶性苯胺蓝溶液染色4 h以上，常规压片，观察花粉在柱头和花柱中的萌发生长情况(廖婷等，2012)。对授粉后60 h～25天的子房，进行石蜡切片，切片厚度15 μm;选取部分切片脱蜡复水后，用0.05%苯胺蓝溶液染色1 h，观察花粉管进入子房的情况。对授粉后24 h以后的子房，采用常规石蜡切片法制片(杨弘远，1981)，切片厚度10 μm，铁矾-苏木精染色，观察油茶受精及早期胚胎发育过程。所有材料均在Olympus BX-51型荧光显微镜下观察并拍照。

经过水溶性苯胺蓝染色后，能够正常萌发的花粉管呈现强烈的蓝色荧光反应。授粉后2 h，大量花粉开始在柱头上萌发，从萌发孔中长出的花粉管朝中空花柱道生长(图 1-1);授粉后24 h，部分花粉管到达花柱中部位置(图 1-2，8);授粉后36 h，花粉管到达花柱2/3位置(图 1-9);48 h，大量花粉管到达花柱基部，开始进入子房(图 1-3，10)。

图 1 油茶花粉萌发及花粉管生长 Fig. 1 Pollen germination and pollen tube growth of C． oleifera 标尺Bars:1,4,5,6,7=200 μm;2,3=40 μm;8,9,10=2 000 μm. PT:pollen tube花粉管. 1.授粉后2 h,大量花粉在柱头上萌发生长;2.授粉后24 h,花粉管在花柱中生长;3.授粉后48 h,花粉管到达花柱基部;4,5.连续切片,示授粉后60 h,花粉管(箭头)穿过珠心组织,经珠孔进入胚囊;6.授粉后120 h,花粉管(箭头)到达珠孔;7.授粉后144 h,花粉管 (箭头)进入胚囊;8.授粉后24 h,花粉管(箭头)约生长至花柱1/2位置;9.授粉后36 h,花粉管(箭头)约生长至花柱2/3位置;10. 授粉后48 h,花粉管(箭头)生长至花柱基部。 1.A lot of pollen germination on the stigma after pollination 2 h;2.Pollen tube grows in the style after pollination 24 h;3.Pollen tube arrives at the base of the style after pollination 48 h;4,5.The sequential sections show that the pollen tube (shown by arrow) passes through the nucellus,entering the embryo sac through micropyle after pollination 60 h;6.The pollen tube (shown by arrow) arrives at the micropyle after pollination 120 h;7.The pollen tube (shown by arrow) enters into the embryo sac after pollination 144 h;8.The pollen tube (shown by arrow) grows to about 1/2 of the style after pollination 24 h;9.The pollen tube (shown by arrow) grows to about 2/3 of the style after pollination 36 h; 10.The pollen tube (shown by arrow) grows to the base of the style after pollination 48 h.

2张连续切片显示:油茶授粉后60 h，萌发的花粉管穿过花柱进入子房，经珠孔进入胚囊中(图 1-4)，为珠孔受精;花粉管穿过珠心组织，到达胚囊，穿过珠孔进入一个助细胞中，释放其内含物(图 1-5)。花粉管进入胚囊的情况在授粉后120，144 h等时间段中亦可观察到(图 1-6，7)。

通过对授粉后不同时间段的15个子房339个胚珠进行统计，发现花粉管进入胚囊的胚珠有78个，进入的比例为23%。在授粉后60 h～20天这段时间都有发现花粉管进入胚囊的现象，但集中于授粉后60 h～7天这段时间。

受精之前，可见卵器3个细胞在横切面上呈典型‘品字’结构排列，2个助细胞大小形态极为相似，助细胞中内含物质较多，染色呈较深的红色，卵细胞的细胞核较助细胞核稍小，3个细胞均可清楚地看见核仁(图 2-1)。随后，1个助细胞在精细胞进入之前退化解体，另1个助细胞正常，合点端可见2个反足细胞(图 2-2)。授粉后72 h，观察到1个精细胞与2极核正相互进行融合(图 2-3)。授粉后6天，在珠孔端观察到另1个精细胞正向卵细胞靠近，其细胞质正进行融合(图 2-4)。油茶配子的融合过程是从彼此的质膜融合开始，再进行核的融合，精细胞横切面圆形，其细胞核比卵细胞和中央细胞的核均要小。授粉后10天，在胚囊中同时观察到合子与初生胚乳细胞，其中初生胚乳核比受精卵的核大，合子靠近珠孔端，初生胚乳核位于胚囊中心(图 2-5)。根据胡适宜(1982)划分的受精方式的类型，油茶配子融合过程属有丝分裂前类型。值得一提的是，配子融合的时间段相对较长，但融合的时间很短，根据观察，在授粉后60 h～20天这段时间中都发现了配子相互融合的情况，但精细胞与极核的融合过程主要发生于授粉后3～10天，而精卵细胞的融合主要发生于授粉后5～16天。

图 2 油茶受精及早期胚胎发育过程 Fig. 2 Fertilization and early embryonic development of C． oleifera 标尺Bars:1,2,4,5,6,7,8,9,10,12,13,14:100 μm;3:50 μm;11,15:200 μm. AC:反足细胞Antipodal cell;EC:卵细胞Egg cell;ES:胚囊Embryo sac;FCP:四细胞原胚Four-celled pro-embryo;FEN:游离胚乳核Free endosperm nucleus;GE:球形胚Globular embryo;MP:多细胞原胚Multicellular pro-embryo;PEN:初生胚乳核Primary endosperm nucleus;PN:极核Polar nucleus; S:助细胞Synergid;SC:精细胞Sperm cell;SS:胚柄Suspensor;TCP:二细胞原胚Two-celled pro-embryo;Z:合子Zygote. 1.授粉后36 h,示卵器;2.授粉后48 h,示助细胞、卵细胞和2个反足细胞;3.授粉后72 h,极核受精;4.授粉后6天,精卵细胞融合;5.授粉后10天, 示受精卵及初生胚乳核;6.授粉后140天,有丝分裂前期的合子;7.授粉后150天,二细胞原胚;8.授粉后160天,四细胞原胚;9.授粉后180天,多细胞原胚,有的正在分裂;10.授粉后180天,示胚柄;11.授粉后200天,示球形胚;12.授粉后12天,示休眠的合子及有丝分裂中期的初生胚乳核; 13.授粉后14天,示休眠的合子及有丝分裂后期的初生胚乳核;14.授粉后22天,示游离胚乳核;15.授粉后120天,示胚囊。 1.Egg apparatus,after pollination 36 h;2.The synergid,egg cell and two antipodal cells,after pollination 48 h;3.Polar nucleus fertilization,after pollination 72 h;4.The sperm cell and egg cell are fusing after pollination 6 days;5.Zygote and primary endosperm nucleus,after pollination 10 days;6.Zygote in mitosis prophase,after pollination 140 days;7.Two-celled pro-embryo,after pollination 150 days;8.Four-celled pro-embryo,after pollination 160 days;9. Multicellular pro-embryo,after pollination 180 days;10.The suspensor,after pollination 180 days;11.The globular embryo,after pollination 200 days;12. The dormant zygote and the primary endosperm nucleus in mitosis metaphase,after pollination 12 days;13.The dormant zygote and the primary endosperm nucleus in mitosis anaphase,after pollination 14 days;14.The free endosperm nucleus,after pollination 22 days;15.The embryo sac,after pollination 120 days.

油茶双受精完成之后，合子历经很长一段时间的休眠(4个月左右)，翌年3月底，授粉后140天，处于有丝分裂前期的合子其核仁着色较深，染色质稠密(图 2-6);随后，合子进行有丝分裂，横向分裂为二细胞原胚，近合点端的为顶细胞，近珠孔端的为基细胞，外形上看顶细胞体积较小，基细胞体积稍大(图 2-7)。接着顶细胞又经过2次横向分裂形成四细胞原胚(图 2-8)，由顶细胞分裂而来的细胞经过多次有丝分裂形成胚体(图 2-9)，基细胞分裂形成胚柄(图 2-10)。授粉后200天，在形成的球形胚中可以看见明显的胚柄(图 2-11)。根据Maheshwari(1950)的专著中介绍的Johansen(1950)系统，本试验观察可以认定油茶胚的发育类型为茄型(胡适宜，2005)。

授粉后12天，初生胚乳核和合子刚形成不久，初生胚乳核便开始分裂，此时合子尚处于休眠时期(图 2-12)。授粉后14天，初生胚乳核处于有丝分裂后期，处于休眠的合子往珠孔端移动(图 2-13)。初生胚乳核分裂的过程中未见有细胞板的形成，分裂的初生胚乳核往胚囊的边缘分布，开始游离于胚囊中，形成游离胚乳核，后逐渐形成不太明显的细胞壁(图 2-14)，可见油茶胚乳的发育类型为核型胚乳。但是油茶的胚乳核极不发达，当年11月至翌年3月这段过程中，合子处于休眠状态，胚乳逐渐增多，胚囊变大(图 2-15);胚囊中胚乳细胞数目并不多，单个胚乳细胞较大，细胞之间形成膜状的隔(图 2-14，15)。

花粉管在花柱中的生长时间和速度受品种特性、自身营养条件、温度、光照等内外因素的影响(Stephenson et al．，1992;Jóhansson et al．，1998)。关于油茶花粉管的生长情况，目前已有文献对不同品种进行了报道，但生长至基部的时间都不尽相同(廖婷等，2012;梁汉兴等，1986;王郁等，2008;何春燕，2009;邹锋，2010)。也有的在杂交时发生败育，杨志玲等(2005)研究发现，攸县油茶在与浙江红山茶(C． chekiangoleosa)杂交时发生败育，花粉管生长到花柱的1/3位置时开始明显减慢，并观察到大量的胼胝质堵塞柱头间、花粉管呈现弯曲等现象，只有很少的花粉管能够到达花柱基部。本试验观察发现，授粉后48 h，油茶‘湘林XLC15’的花粉管到达其花柱基部，与油茶‘华硕’相比，时间更短，这可能与品种特性和授粉后的气温有关(廖婷等，2012)。

油茶受精方式为珠孔受精，本研究观察到的花粉管进入胚囊的胚珠中，均是通过珠孔进入胚囊，这与曹慧娟(1965)的研究结果类似。但刘祖生等(1987)在对茶树(C． sinensis)的研究中观察到，‘祁门长叶’茶树的花粉管进入胚囊过程中，除了通过退化的助细胞外，还可由助细胞和胚囊壁之间进入。本研究对授粉后不同时间段的180个子房3 736个胚珠进行了石蜡切片，仅在43个胚珠中发现精细胞与极核细胞正进行融合的情况，而精卵融合过程仅在14个胚珠中观察到，可见配子的融合过程很短，不易观察到。在发现的极核融合的情况中，均为2极核与精细胞同时融合，并未发现2游离极核融合为次生极核后再与精细胞融合的情况。而周良骝等(1991)对油茶的研究发现，油茶受精过程中，先是2极核融合为次生极核，精细胞再与次生核融合进行受精。据曹慧娟(1965)报道，油茶受精之前，卵器中1个细胞消失，配子的融合过程多样而复杂，卵细胞和助细胞受精的现象及多精入卵的现象普遍存在，有的胚珠内观察到2套卵器。本研究中未观察到助细胞受精和多精入卵的现象，这可能与配子融合过程较短有关，胚囊中2套卵器的情况在众多材料中仅发现1例，至于多套卵器的胚珠后期的发育情况还有待深入研究。

多数学者认为，植物胚囊在移动过程中发生双受精，受精前后精细胞、极核和卵细胞位置都发生变化(Weterings et al.，2004)。对玉米(Zea mays)、大豆(Glycine max)、水稻(Oryza sativa)、高粱(Sorghumbicolor)等植物双受精过程的研究表明，通常精核与极核的融合要早于精卵融合(申家恒等，1987;申家恒，1983;丁建庭等，2009;李冉俐等，2009)。在水稻中，精细胞释放于卵细胞和中央细胞之间，后1个精核追赶移动的极核并与其融合(丁建庭等，2009);而高粱在受精前，2个极核相靠，位于卵器的合点端，受精前后位置没有发生变化(李冉俐等，2009)。本研究中，整体来说精核与极核融合的主要时间段早于精卵融合的时间，极核的受精一般发生于胚囊的正中央，精卵融合多发生于珠孔端。双受精前后，极核和卵核的位置是否发生变化，因观察到的受精的数目较少，目前还无法判定。

油茶合子约休眠4个月后进行胚胎发育，胚胎发育过程中形成胚柄，胚柄由一列细胞组成，在种子形成后消失。江昌俊等(1987)对福鼎大白茶(C．sinensis‘Fuding’)的研究指出，茶树胚胎发育过程中没有明显的胚柄。Hwang等(1992)对山茶(C．japonica)×金花茶(C． chrysantha)研究发现，种内杂交后胚胎发育正常进行，且授粉后150天胚胎能够将胚珠填满。李天庆等(1986)对金花茶的胚胎学研究发现，合子至少在受精后4个月才开始分裂，胚乳极少，合子分裂时仅有数个胚乳核，这与本研究类似。

油茶在生产中落花落果现象严重，据周良骝等(1991)报道，油茶传粉受精作用不充分，合子发育成原胚期间未能从胚乳细胞中获取足够的营养，使原胚的发育停滞，合子不能正常地形成幼胚，诸如此类发育过程中胚胎学的内在因素引起的落花落果可达50%以上。因此，在翌年3月油茶胚胎开始发育前应加强树体营养和土肥水管理，保证胚胎发育所需的养分要求。本试验观察了油茶授粉受精和早期胚胎发育过程，可为油茶在杂交育种、胚培养、人工离体受精操作以及分子育种等方面提供理论依据。