营养贮藏蛋白质(vegetative storage protein，简称VSPs)能维持植物体内相对稳定的内环境，保证植物的正常生长发育，是多数落叶树种越冬期间贮藏氮素的主要形式(彭方仁等，2001)。贮藏蛋白质除了能防止树木养分损失外，还能为其生长发育提供必需的养分(董艳敏等，2007)。银杏(Ginkgo biloba)营养贮藏蛋白质主要存在于枝条的木质部和皮层中，已有研究表明银杏枝条皮层中的含量高于木质部，当年生枝条中含量高于2年生枝条(彭方仁等，2006;郭红彦，2007)。银杏营养贮藏蛋白质的细胞学特性和生化性质的研究已有报道(吴青霞等，2006;彭方仁等，2010)。郭娟等(2002)等对银杏营养贮藏蛋白质进行了准确定位，郭红彦等(2009)确定了银杏营养贮藏蛋白质的分子质量为32 kDa和36kDa。目前对银杏营养贮藏蛋白质结构与功能的关系还未见报道。为揭示银杏营养贮藏蛋白质结构与功能的关系，本文采用DEAE -SepharoseFF离子交换色谱和Sephadex G-75葡聚糖凝胶色谱分离纯化银杏营养贮藏蛋白质，并对获得的蛋白质进行结构初探，揭示其结构与功能的关系。

银杏枝条于2011年12月采集于南京林业大学校园内2年生的雌株银杏健壮枝条。枝条皮层经液氮研磨成粉末、石油醚脱脂备用。

蛋白提取:银杏枝条经液氮研磨，用石油醚以1: 5(m/v)的比例混匀，4 ℃脱脂。脱脂后的粉末用0.25 mol·L^-1，pH 9.0的Tris-HCl缓冲液(TBS)以1: 10(m/v)的比例混匀，4 ℃浸提10 h。浸提液过滤，得到的滤液5 000 r·min^-1、 4 ℃离心30 min，得到的上清液即为蛋白粗提液(蔡金星等，2007;陈振家等，2007)。

粗蛋白干粉制备:参照黄文等(2004)和徐文斌(2011)的方法并加以改进。采用80%的硫酸铵沉淀蛋白，经静止离心后得到的沉淀用少量0.01 mol·L^-1 TBS(pH 8.5)溶解，转移至透析袋透析，最终得到的蛋白溶液经冷冻干燥备用。

FF离子交换层析:将DEAESepharose FF用pH 8.5的0.5 mol·L^-1 TBS洗涤平衡，真空脱气后装柱;银杏营养贮藏粗蛋白质经pH8.5的0.01 mol·L^-1 TBS溶解，配制成10 mg·mL^-1蛋白溶液。离子交换层析上样量为5 mL，洗脱流速为1 mL·min-1，起始缓冲液为pH 8.5的0.01 mol·L^-1 TBS，极限缓冲液为pH 8.5的0.01 mol·L^-1TBS，同时含0.3 mol·L^-1 NaCl。调整流速让洗脱液以恒定速度流过色谱柱，分管收集洗脱液，每管收集6 mL(栾明明等，2007)。分管收集的洗脱液在280 nm测定吸光度。

Sephadex G-75凝胶层析:将预处理好的Sephadex G-75用0.01 mol·L^-1 TBS(pH 8.5)洗涤平衡，真空脱气后装柱;以0.01 mol·L^-1 TBS(pH 8.5)溶解银杏营养贮藏蛋白，上样体积为5 mL;调整流速让洗脱液以恒定速度流过色谱柱，蛋白质上样浓度15 mg·mL^-1，上样量5 mL，洗脱液流速0.3mL·min^-1，分管收集洗脱液，每管收集6 mL(王子佳等，2009)。分管收集的洗脱液在280 nm测定吸光度。

SDS-PAGE凝胶电泳:分离胶15% 、浓缩胶4.4%，上样量20 μL;电泳时，浓缩胶恒定电压60 V30 min，分离胶稳定电压120 V 90 min(郭红彦等，2007)。凝胶采用考马斯亮蓝染色法染色。所得凝胶采用Gel Doc 2000凝胶成像系统及Quantity One分析软件，根据低分子质量标准蛋白Marker分析计算。

银杏贮藏蛋白质含量的测定:在280 nm下测定蛋白溶液的吸光值，检测其浓度的变化趋势。

1)质谱(LC-MS)检测    样品预处理:参考徐文斌等(2011)的方法并加以改进。对1.2.2中获得的银杏VSPs进行SDS-PAGE，获得目标蛋白条带，经胰酶酶解，获得银杏VSPs酶解液，进行LCMS检测。

2)傅里叶红外光谱检测    参考陈静涛等(2008)的方法，测定银杏VSPs的红外特征吸收曲线，记录4 000～400 cm^-1区间背景光谱。

DEAESepharose FF离子交换色谱如图 1所示。银杏VSPs经分离后得到Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ和Ⅳ 4个组分，收集4个组分，浓缩后冷冻干燥，进行SDS-PAGE分析。

	图 1 DEAE-Sepharose FF 离子交换色谱 Fig. 1 DEAE-Sepharose FF ion-exchange chromatograph 图中曲线为银杏营养贮藏蛋白质经 DEAE-Sepharose FF 纯化时的 4 个洗脱峰，直线为线性梯度洗脱时所对应 NaCl 的浓度。 In figure the curve means four elution peaks were obtained on DEAE-Sepharose FF column chromatography of VSPs，the straight line means the concentration of NaCl in gradient elution．

彭方仁等(2010)研究了银杏蛋白含量在1年中的动态变化规律，发现32 kDa和36 kDa蛋白质具有营养贮藏蛋白质的特征，符合营养贮藏蛋白质积累和降解受“源-库关系”调节的标准。本研究对峰Ⅰ～Ⅳ进行SDS电泳分析(图 2)。电泳结果表明:银杏32 kDa和36 kDa蛋白质存在于峰Ⅳ中，但是2种蛋白质分离效果较差，需要进一步分离。

	图 2 SDS-PAGE 电泳 Fig. 2 Result of SDS-PAGE

Sephadex G-75凝胶利用分子筛作用对蛋白质进行分级分离，待分离样品的上样浓度和洗脱液的流速对分离效果影响显著( Tommasi et al.，2006)。经2.1.1得到的银杏VSPs的峰Ⅳ，经Sephadex G-75凝胶色谱分离，结果如图 3所示。银杏营养贮藏蛋白质峰Ⅳ被分为3个组分，其中组分1是穿透峰，不含目标蛋白质，而Sephadex G-75的分子筛范围为3～80 kDa，因此峰2和3需进行SDS-PAGE分析，以明确32 kDa和36 kDa银杏VSPs的分布。

	图 3 SephadexG-75凝胶色谱 Fig. 3 Sephadex G-75 gel chromatograph 图中曲线为经DEAE-Sepharose FF分离得到的峰Ⅳ经Sephadex G- 75凝胶色谱分离所得3个洗脱峰。 In figure the curve means three elutionpeaks were obtained on Sephadex G- 75 column chromatography of peak Ⅳobtained by DEAE-Sepharose FF．

峰2和峰3的电泳结果(图 4)表明:峰2中只存在1条36 kDa的蛋白条带，达到了电泳纯度;而峰3中则含有条带颜色较浅的32 kDa蛋白，同时也存在其他多条杂质蛋白，后续分离较为困难。因此，本研究对峰2中的36 kDa银杏VSPs进行后续质谱分析。

	图 4 Sephadex G-75 色谱结果SDS-PAGE电泳分析 Fig. 4 SDS-PAGE result of ptoteins after Sephadex G- 75 gel chromatograph

将2.1.2中获得的36 kDa银杏VSPs进行一级结构鉴定，通过LC-MS分析获得36 kDa银杏VSPs多条肽段的氨基酸序列。经NCBI数据库中植物贮藏蛋白库中肽质量指纹图谱比对分析发现，36 kDa银杏VSPs的2个肽段氨基酸序列与数据库中大豆(Glycine max)贮藏蛋白质(29 kDa)和薯蓣(Dioscorea opposita)块茎贮藏蛋白质(30 kDa)的部分序列完全吻合，蛋白信息和相应匹配肽段信息如表 1。

表 1 6 kDa银杏VSPs的LC-MS质谱鉴定 ^① Tab.1 Identification of 36 kDa VSPs by LC-MS

表 1 6 kDa银杏VSPs的LC-MS质谱鉴定 ① Tab.1 Identification of 36 kDa VSPs by LC-MS gi Number 134145 46917481 ①表中gi Number表示蛋白在NCBI数据库中的编号;MW表示蛋白的分子质量;Sequence表示匹配蛋白质的完整序列，其中带下划线的氨基酸序列为36 kDa银杏VSPs的匹配肽段。In table gi Number means the number of protein in NCBI database;MW means the molecular weight ofprotein;Sequence means the complete sequence of matched protein in which the underlined amino acid sequences are the matched peptides of 36 kDaVSPs of G． biloba． MW 29 064. 86 30 406. 1 Sequence MKMKVLVFFVATILVAWQCHAYDMFPLRMNTGYGAR TPEVKCASWRLAVEAHNIFGFETIPEECVEATKEYIHGE QYRSDSKTVNQQAYFYARDLEVHPKDTFVFSIDGTVLSN IPYYKKHGYGVEKFNSTLYDEWVNKGNAPALPETLKNY NKLVSLGFKIIFLSGRTLDKQAVTEANLKKAGYHTWEKL ILKDPQDPSTPNAVSYKTAAREKLIRQGYNIVGIIGDQW SDLLGGHRGESRTFKLPNPLYYIQ MSSSTLLHLLLLSSLLFSCLANVEDEFSYIEGNPNGPENWGNLKPE WETCGKGMEQSPIQLRDNRVIFDQTLGRLRRNYRAVDARLRNSG HDVLVEFKGNAGSLSINRVAYQLKRIHFHSPSEHEMNGERFDL EAQLVHESQDQKRAVVSILFIFGRADPFLSDLEDFIKQFSSSQKNEI NAGVVDPNQLQIDDSAYYRYMGSFTAPPCTEGISWTVMRKVATV SPRQVLLLKQAVNENAINNARPLQPTNFRSVFYFEQLKSKVCAI

36 kDa银杏VSPs中匹配率较高的2个肽段序列氨基酸丰度见图 5，6。根据LC-MS分析结果发现，NCBI数据库中没有与36 kDa银杏VSPs完全匹配的蛋白质，但可以通过相似氨基酸序列来判断该蛋白质的部分功能特性。参考肽指纹图谱比对结果，结合NCBI网站上有关蛋白质的功能信息和结构域表明，银杏VSPs肽段KGNAGSLSINRVAYQLKRI与薯蓣块茎贮藏蛋白质部分肽段匹配部分，属于蛋白质碳酸酐酶活性结构域;而肽段RMNTGYGART- PEVKC与大豆营养贮藏蛋白质部分肽段匹配，属于酸性磷酸酶结构域。

	图 5 肽段 KGNAGSLSINRVAYQLKRI 相对丰度 Fig. 5 Relative abundance of peptide KGNAGSLSINRVAYQLKRI

	图 6 肽段 RMNTGYGARTPEVKC 相对丰度 Fig. 6 Relative abundance of peptide RMNTGYGARTPEVKC

36 kDa银杏VSPs的傅里叶红外光谱分析如图 7所示。36 kDa银杏VSPs在氢键区(4 000～2 500 cm^-1)存在2个峰，其吸收频率分别为3 420.25和2 925.69 cm^-1，前者是由游离的N—H键伸缩振动引起的波长吸收，后者是由—CH2结构不对称伸缩振动引起的。这也进一步说明36 kDa银杏VSPs中存在N—H和—CH2官能团，而且这些官能团是蛋白质固有的，在多种蛋白质中均能检测到。36 kDa银杏VSPs在三键和累积双键区(2 500～2 000 cm^-1)出现1个峰，其吸收频率为2 141.13 cm^-1，主要由伸缩振动的C≡C键所引起的波长吸收，但是该峰的透过率不高，说明36kDa银杏VSPs结构中三键所占比例不高。36 kDa银杏VSPs在双键区(2 000～1 500 cm^-1)也出现2个峰，分别是由C =C键(1 635.49 cm^-1)和—NO₂(1 540.77 cm^-1)基团的伸缩引起的波长吸收。36 kDa银杏VSPs在C—H键弯曲伸缩区(1 500 ～1 300 cm^-1)存在2个峰，分别由—CH₂(1 461.09cm^-1)和—CH₃(1 389.47 cm^-1)的弯曲伸缩引起。此外，36 kDa银杏VSPs在指纹区(1 300～400cm^-1)也存在2个峰(1 046.48和554.15 cm^-1)，前者透过率较大，是由羧基中的C =O的伸缩振动形成，后者则是由C—Br的伸缩引起的特征峰，这2个峰可以作为36 kDa银杏VSPs的特征吸收峰。

	图 7 36 kDa银杏VSPs红外光谱分析 Fig. 7 FT-IR spectra of 36 kDa ginkgo VSPs

此外，在红外光谱中沿着多肽骨架的1 700 ～1 600 cm^-1之间，酰胺I带与羰基(C =O键)的拉伸振动相关结果可以预测蛋白质的二级结构。36 kDa银杏VSPs在此范围内仅有1个明显的峰，其峰值(1 635.49 cm^-1)与β-折叠构象的特征曲线(1 640～1 630 cm^-1)相吻合，因此可推测36 kDa银杏VSPs的二级结构以β-折叠构象为主。

在蛋白质纯化工艺中，离子交换色谱的使用率占75%以上。本文采用离子交换剂DEAESepharose FF对银杏贮藏蛋白质进行分离纯化，但是没有获得高纯度的银杏贮藏蛋白质。张允允等(2011)采用2次葡聚糖Sephadex G-100层析，得到了高纯度的藻蓝蛋白质。本试验参考目标蛋白的分子质量后选用Sephadex G-75作为填料，对含银杏VSPs的组分Ⅳ进行了进一步分离，得到峰2和峰3，经电泳分析结果表明:峰2中仅有36 kDa 1条蛋白带，已经达到了电泳纯度;而峰3中除了32 kDa目标蛋白，还存在较多杂蛋白，需要进一步分离纯化。

由于木本植物的VSPs结构信息在蛋白质库中很少被采集，本研究获得的36 kDa银杏VSPs在蛋白质库中也没有完全匹配的蛋白质。但是，与不同来源的贮藏蛋白质相似的序列比较后发现，36 kDa的银杏VSPs具有碳酸酐酶(carbonic anhydrase，CA)和酸性磷酸酶(acid phosphatase，ACP)相似的氨基酸序列。碳酸酐酶能催化碳酸分解为二氧化碳和水，在植物体中参与CO₂传导而进入羧化位点，其活性高低显著影响光合作用(黄瑾等，2010)。已有研究表明光合作用与CA活性呈正相关，据此推测，银杏VSPs可能具有光合作用酶的作用，为银杏芽萌发提供能量。酸性磷酸酶作为植物中重要的水解酶，与碳水化合物的转化、蛋白质的合成和有机磷的分解均有着密切的关系。银杏VSPs的肽段KGNAGSLSINRVAYQLKRI与大豆贮藏蛋白质结构中ACP功能域的氨基酸序列相，可能也具有ACP活性，因而可参与秋冬季银杏有机磷元素的富集。

傅里叶红外光谱结果表明:银杏VSPs中除了共有的—CH₂，N—H，C =C，C≡ C等官能团之外，还发现了溴离子和硝基等特殊官能团，但是鉴于试验条件所限，未能对这些官能团作进一步的功能研究。蛋白质二级结构预测认为36 kDa银杏VSPs以β-折叠为主要的二级构象，且未发现明显的α-螺旋的特征波峰，这有待进一步分析。