锰过氧化物酶(MnP;EC1. 11. 1. 13)是真菌分泌的胞外过氧化物酶，广泛存在于木材白腐菌中，通常以多种同工酶的形式存在。MnP在生物修复和生物制浆领域具有重要作用，其可以降解土壤和废水中的DDT、多环芳烃、多氯联苯、含有苯环的偶氮与叠氮化合物，以及其他木质素结构。探索MnP基因的高效表达，目的是为提高其产量。大肠埃希菌(Escherichia coli)(Whitwam et al.，1995;1996)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(Gu et al.，2000)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)(Ruiz-Dueńas et al.，1999)等是其异源表达的3种载体。由于在原核生物和酵母中表达时，蛋白翻译后的加工修饰机制不如丝状真菌完善，血红素成为MnP酶活性的主要限制性因素。丝状真菌表达系统还具有较完善的蛋白发酵工艺和加工技术。构巢曲霉的转化方法建立之后(Tilburn et al.，1983)，其转化系统的研究与应用获到了较好的发展(Koukaki et al.，2003)。目前国外已有几种白腐菌的mnp基因在丝状真菌中表达的一些研究(Stewart et al.，1996;Li et al.，2001)，但国内尚缺乏这方面的报道。2001年发现构巢曲霉适合mnp等外源基因的有效表达(Larrondo et al.，2001)。笔者在首先扩增到白腐真菌偏肿革裥菌(Lenzites gibbosa)锰过氧化物酶2基因(Lg-mnp2)的基础上，继续研究Lg-mnp2在构巢曲霉中的表达。

白腐菌偏肿革裥菌菌株CB1由采自于长白山的子实体上自行分离得到。转化菌株:构巢曲霉尿嘧啶尿苷营养缺陷型菌株TN02A7，在YUU试管斜面上保存于4 ℃冰箱。整合型质粒表达载体: pLB01(6 000 bp，Xba Ⅰ、BamH Ⅰ位点，pyr4)。2010年11月南京师范大学陆玲教授赠送菌株TN02A7和质粒pLB01。目的基因载体质粒:自我构建好的质粒pMD ^TM 18-T/Lg-mnp2，携带有偏肿革裥菌菌株的Lg-mnp2基因1 100 bp的完整编码序列(CDS)，该基因两侧分别带有Xba Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位点，保存在-80 ℃冰箱。纤维素酶(cellulase)和蜗牛酶(snailase):华美生物公司;溶壁酶(lywallzyme):广东微生物研究所;其他药品购自德美公司。

丰富培养基YAG、YAGK、 YUU、 YUUK和MM按照胡美美等(2013)的方法制备。

转化用溶液1，2，3，4，5及原生质化溶液按照曹进玲(2011)的方法进行配制和贮存，其中，原生质化溶液使用A，B，C，D 4种酶解处理方法，A，B，C方法为分别加入溶壁酶、纤维素酶和蜗牛酶，D方法为加入按1: 1: 1比例混合的上述3种酶。

用XbaⅠ、 BamH Ⅰ分别对pMD ^TM 18-T/Lg-mnp2质粒和pLB01质粒进行双酶切，回收目的产物，进行连接转化。提取重组质粒pLB01/Lg-mnp2，然后用Lg-mnp2基因表达用双酶切引物(上游引物: 5'-GCTCTAGATCCCCTTCAAAGCCATCTCC-3'，下划线为酶切位点XbaⅠ;下游引物: 5'-CGGGATCCTGGGCATCCGATGCAATG-3'，下划线为酶切位点BamH Ⅰ)进行双酶切验证。酶切体系:重组质粒4 μL，BamHⅠ 0.5 μL，XbaⅠ 0.5 μL，100×BSA 0.2 μL，10×NEB Buffer4 2 μL，ddH₂ O补足至20 μL。进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

根据胡美美等(2013)的研究，进行菌株TN02A7原生质体酶解制备方法的摸索。4种原生质溶液中加入的酶量见表 1。按照该方法进行了3次重复制备原生质体，然后采用CaCl₂/PEG介导的方法进行转化。试验前将枪头放置冰箱预冷，分别吸取原生质体100 μL、重组质粒10～20 μL(DNA浓度至少500 ng·μL^-1，即加入5 μg以上的DNA)与50 μL溶液4，加入到离心管中，轻轻混匀;以上操作均在冰上进行。冰浴20 min后。再加入1 mL溶液4，混匀，在26 ℃条件下热激20 min。

表 1 4种原生质化溶液中加入的酶量 Tab.1 The added amount of enzyme in 4 protoplasm solution

表 1 4种原生质化溶液中加入的酶量 Tab.1 The added amount of enzyme in 4 protoplasm solution 酶解处理 Enzymatic treatment 溶壁酶 Lywallzyme / (g.L-1) 纤维素酶Cellulase / (g.L-1) 蜗牛酶 Snailase / (g.L-1) A 0.2 0.0 0.0 B 0.0 0.2 0.0 C 0.0 0.0 0.2 D 0.2 0.2 0.2

将YAGK固体培养基在45 ℃条件下加热，取25 mL加入转化后的原生质体悬液中，马上混匀，倒入无菌的培养皿中，保持30 ℃过夜。次日开始在37 ℃条件下培养5天。挑取菌落，划线接于YAGK上培养5天，进行筛选并计数。然后，继续在YAGK培养基上划线筛选生长性状稳定的转化子。将菌株TN02A7分别接种在YUUK和YAGK培养基上用于生长对照培养。

收集转化子菌株菌丝，提取基因组DNA，然后用扩增基因Lg-mnp2完整编码序列的表达用双酶切引物(见1.3)进行目的基因的PCR验证。通过电泳回收目的片段，将目的片段进行连接转化，测序(上海英俊生物技术有限公司)。

将原营养缺陷体菌株TN02A7与转化子菌株TN02A7-Lg-mnp2分别在YUU和YAGK固体培养基上培养4天，然后用无菌水分别收集孢子并计数，调制成3×10 ⁸个·mL^-1相同浓度的孢子悬液，各取300 μL分别接种于含有50 mL MM液体培养基的三角瓶中，该MM液体培养基添加了1%的甘油及2 g山杨(Populus davidiana)木屑用以诱导Lgmnp2基因的表达，于35 ℃、 200 r·min^-1下培养。另外，对于菌株TN02A7，在MM液体培养基中还添加了130 mg·L^-1的尿嘧啶和120 mg·L^-1的尿苷。分别在培养后0，24，48，72，96，120 h取1 mL培养液，设置3个重复，在6 000 r·min^-1下离心2 min后，吸取上清液，测定MnP活性。酶活性检测方法按照闫洪波(2009)的方法进行。

重组质粒的长度应为7 100bp。进行XbaⅠ、 BamHⅠ双酶切验证，获得2个条带，分别为1 000 bp和6 000 bp的片段(图 1)，说明基因Lg-mnp2已经连接到了pLB01质粒载体上，重组质粒pLB01/Lg-mnp2成功得到。

	图 1 重组质粒pLB01/Lg-mnp2双酶切产物 Fig. 1 Digested product of recombinant plasmid pLB0/Lg-mnp2 1.Marker 15 000;2.样品Sample.

在37 ℃、 250 r·min^-1条件下培养构巢曲霉的分生孢子，镜检观察到孢子萌发达到50%以上，需要7～10 h。在30 ℃、 150 r·min^-1条件下酶解脱壁，大多数孢子形成原生质体时，大约需要3 h。

3次重复制备原生质体并取平均值，结果表明:D组原生质化率最高，3 h时原生质化率能达到80%以上。而单一酶的A，B，C 3组仅在50% ～65%之间(表 2)。采用D组的酶液组合获得原生质体的情况见图 2。

表 2 不同酶解处理3 h后的原生质体产生率 Tab.2 The rate of protoplast production by different enzymatic treatments

表 2 不同酶解处理3 h后的原生质体产生率 Tab.2 The rate of protoplast production by different enzymatic treatments 酶解处理 Enzymatic treatment 生产率 Rate of protoplast production (% ) A 62.02±2.08 B 54.11± 1.59 C 65.58±2.15 D 81.76±3.05

	图 2 溶壁酶、纤维素酶和蜗牛酶混合酶解制得的原生质体 Fig. 2 Protoplasts produced by mixed enzymes of lywallzyme, cellulase，and snailase

将转化后的原生质体悬液混入到YAGK平板培养基上，置于30 ℃条件下过夜，在37 ℃条件下培养，5天后将生长出来的所有菌落在YAGK培养基上划线，再培养5天后，发现有些菌落能在YAGK培养基上生长良好，能长出绿色的菌体(包括菌丝和孢子)，与TN02A7菌株正常生长时的形态一致，说明成功获得转化子TN02A7-Lg-mnp2(图 3a);而有些菌落生长在YAGK培养基上表现为萎缩状的红褐色小菌落，说明这些为非转化子，它们的生长形态与菌株TN02A7在YAGK培养基上生长的形态一致(图 3b)。试验重复3次。通过统计发现，在5 μg质粒DNA 、 10⁸ mL^-1孢子浓度条件下能获得10～12个转化子，生长特性在进行3代培养后仍很稳定。菌株TN02A7在YUUK和YAGK上生长的形态分别如图 3c，d所示。

图 3 转化子TN02A7-Lg-mnp2和菌株TN02A7的生长状况 Fig. 3 The growth of transformant TN02A7-Lg-mnp2 and TN02A7 strain a．转化子在 YAGK 培养基上正常生长; b．非转化子在 YAGK 培养基上生长受抑制; c． TN02A7 在 YUUK 培养基上正常生长; d． TN02A7 在 YAGK 培养基上生长受抑制; a． A transformant normally grew in YAGK medium; b． Several non-transformants grew suppressed in YAGK medium; c． TN02A7strain normally grew in YUUK medium; d． TN02A7strain non-transformants grew suppressed in YAGK medium．

进行转化子基因组DNA的PCR反应，结果获得一个约1 200 bp的DNA片段(图 4)。测序为1 161 bp的核苷酸序列，经过比对，与偏肿革裥菌的Lg-mnp2基因完整编码序列结果完全一致，说明已经成功获得转化子菌株。

	图 4 转化子MnP完整编码序列的双酶切引物PCR验证 Fig. 4 The PCR identificaion of double digestion primers of transformants 1. Marker 2 000; 2. 样品 Sample．

MM液体培养基中加入2 g山杨木屑和1%的甘油，转化子菌株TN02A7-Lg-mnp2在该培养基中培养，培养条件为200 r·min^-1、 35 ℃、 120 h。培养期间提取的酶液检测到MnP的活性，虽然活性较低，也表明基因Lg-mnp2已经成功地被转化到TN02A7-Lg-mnp2中，并在木质素环境下得到表达。MnP活性在0～72 h上升缓慢，72～96 h迅速上升，96～120 h迅速下降;以96 h酶活性最高，为17U·L^-1。菌株TN02A7在添加了1%的甘油、 2 g山杨木屑及130 mg·L^-1的尿嘧啶和120 mg·L^-1的尿苷的MM液体培养基中培养，培养条件为35 ℃、120 h、200 r·min^-1，期间提取酶液始终未检测到MnP的活性，说明菌株TN02A7没有MnP基因表达。酶活性检测结果见图 5。

	图 5 菌株TN02A7-Lg-mnp2与TN02A7的MnP活性检测 Fig. 5 The MnP activity determination of the strain TN02A7-Lg-mnp2 and TN02A7

建立真菌遗传转化系统主要从受体菌株、遗传转化法和选择性标记等方面考虑。转化的方法主要有基因枪转化法、电击转化法、农杆菌介导转化法、PEG/CaCl₂转化法等(黄卫等，2000;李娟等，2006)。基因枪法不用原生质体，操作简单、快速，但需要昂贵的设备，转化率低，在实践应用中受到一定的限制(王金良等，2010);Herzog等(1996)采用基因枪法和原生质体法进行构巢曲霉的转化，发现基因枪法转化率低于传统的PEG介导的原生质体转化方法，但其转化子的稳定性却较高。电击法操作简便，但转化率不高。根癌农杆菌(Agrobacterium)既可以介导原生质体的转化，也可以介导生长和发育中的菌丝体、孢子的转化，但根癌农杆菌对同一菌株各种受体材料的侵染力不尽相同，转化效率存在较大差别;有的菌株只有萌发的孢子才能实现转化(Abuodeh et al.，2000)，有的菌株如根霉则需要制备原生质体才能实现转化(Michielse et al.，2004)，而有的菌株如核盘菌目前还未能利用根癌农杆菌实现转化(钱科等，2012)。原生质体制备虽然较繁琐，但是其中的PEG/CaCl2法仍是最为常用的制备方法，具有操作简便、纯合性转化子易获得、原生质体作为受体细胞具有群体数量大等优点(王金良等，2010)，是通过在培养物中加入PEG等多聚物协助基因转移，以促使原生质体融合的方法(陈凤，2012)。

通常采用酶解法消化细胞壁以制备原生质体，制备原生质体的材料一般是幼嫩的菌丝、正在萌发中的新鲜分生孢子和担孢子。本试验即采用了刚出现芽管时的构巢曲霉分生孢子来制备原生质体，这时的孢子细胞壁薄，细胞壁容易被酶解。原生质体制备过程中当观察到孢子细胞内有空泡时，表明已获得原生质体。由于原生质体容易破裂，在后续试验中均要温和操作，离心转速不能超过3 000 r·min^-1。

Koukaki等(2003)用构巢曲霉萌发中的分生孢子和不同生长阶段的幼嫩菌丝体细胞来制备原生质体，采用100 mg·mL^-1的Glucanex酶解60～90 min，获得了50%的最高原生质化率，并发现当分生孢子刚出现芽管时(自接种培养4 h 30 min后)制备原生质体其转化效率最高，当孢子形成幼嫩菌丝体后(自接种培养5 h 15 min后)转化率开始下降。酵母的细胞壁成分比较简单，A. nidulans的细胞壁成分比较复杂，单一的细胞壁裂解酶脱壁作用也较单一，为了达到理想的效果，需要使用多种酶共同发挥协同作用。本试验摸索了构巢曲霉分生孢子原生质体制备的酶解方法，即使用溶壁酶、纤维素酶和蜗牛酶3种酶并以1: 1: 1的比例混合，在30 ℃、 150 r·min^-1下进行酶解脱壁处理3 h时，获得了高达81.76%的原生质化率。

丝状真菌原生质体的转化一般是在一定浓度CaCl2、 PEG等溶液中，加入制备好的原生质体细胞和目的质粒DNA，进行转化。转化过程需要在一定的高渗透压下进行，CaCl₂是维持渗透压的稳定剂;而高浓度的PEG能促进细胞间彼此聚合，从而有利于DNA的转化。因此，CaCl2、 PEG都是原生质体转化不可缺少的成分。Herzog等(1996)在制备原生质体时加入了50 mmol·L^-1 CaCl₂、 60% PEG 4000，结果在10 6·mL^-1孢子浓度、 10 μg质粒DNA条件下得到16～24个转化子，本试验原生质转化效果良好，在10 8·mL^-1孢子浓度、 5 μg质粒DNA条件下，在原生质转化溶液中加入了100 mmol·L^-1 CaCl₂、25%的PEG6000，得到10～12个转化子，对转化子连续传3代培养，它们的生长特性均十分稳定。这与Herzog等(1996)的研究结果相一致。

本试验运用异源表达的策略，通过构建重组质粒pLB01/Lg-mnp2，对菌株TN02A7的分生孢子进行了溶壁酶、纤维素酶和蜗牛酶3种酶解原生质体化的摸索，将白腐菌偏肿革裥菌的Lg-mnp2基因以PEG/CaCl₂介导的原生质体转化方法转入到了构巢曲霉中，获得了携带有偏肿革裥菌Lg-mnp2基因的构巢曲霉转化子菌株TN02A7-Lg-mnp2，实现了白腐菌mnp基因在丝状真菌构巢曲霉中的诱导表达，其在96 h时检测到酶活性达到最高为17 U·L^-1，为生产MnP和提高MnP产量提供了新的途径。