雷公藤(Tripterygium wilfordii)不仅是一种药用植物，还是一种有毒植物，在民间作为杀虫植物，有“菜虫药”之称，其主要活性成分雷公藤生物碱和雷公藤甲素既有杀虫活性又有医用活性(李琰等，2012;Brinker et al.，2005;Liu，2011)，临床上常用来治疗风湿性关节炎、肿瘤、免疫抑制性疾病(仲剑等，2009;Johnson et al.，2011;Huang et al.，2012)。雷公藤也是植物源农药的传统来源，根皮在我国民间常用来防治多种蔬菜害虫，提取物对菜青虫(Pieris rape)、小菜蛾(Plutella xylostella)等多种害虫有强烈的胃毒、拒食或麻痹作用(周琳等，2006;罗都强等，2001;Gonzaleza et al.，1997)。雷公藤属于木本植物，因用根皮入药，大量开发使用导致资源大量破坏。因此，从20世纪70年代开始，日本、加拿大等学者就开始通过组织培养途径来生产雷公藤甲素等代谢产物(Kutney et al.，1983;Nakano et al.，1998)。为了满足市场对雷公藤代谢产物的需求，近几年也探索了通过组织培养途径生产雷公藤次生代谢产物的可能性(李琰等，2009;张兴等，2008);并且发现，雷公藤不定根中雷公藤甲素含量为自然生长的根皮粉的4.5倍(李琰等，2009)，在目标产物极低的组织培养生产次生代谢产物研究中实属罕见(Giri et al.，2001)，这也为进一步研究通过不定根培养生产雷公藤次生代谢产物带来了希望。

在培养基成分对雷公藤不定根生长及雷公藤生物碱和雷公藤甲素形成的前期研究发现，NT培养基中较高浓度的大量元素有利于雷公藤不定根的生长，而适合雷公藤生物碱和雷公藤甲素积累的大量元素浓度均较低(李琰等，2013)。为了实现通过雷公藤不定根两步培养法生产雷公藤生物碱和雷公藤甲素，本试验从适合雷公藤不定根培养的NT培养基中的7种微量元素着手，探讨微量元素及其浓度对雷公藤不定根生长和雷公藤生物碱及雷公藤甲素合成的规律，为进一步通过两步培养生产雷公藤生物碱和雷公藤甲素提供参考。

雷公藤不定根为本实验室在NT培养基上经过多代继代培养保存的材料。

试验以NT培养基为标准，将每种微量元素浓度梯度设为不添加该元素、 NT培养基中原有浓度(CK)、原有浓度的2倍、原有浓度的4倍，分别用0，1C，2C，4C表示(C为NT培养基中该物质的原有浓度)4个水平(NT培养基的其余成分及其浓度不变)，按照试验设计在配制培养基时分别添加不同质量浓度的微量元素。

所用培养基，分别添加1.0 mg·L^-1 2，4-D+4.0 mg·L^-1 NAA+0.5 mg·L^-1 KT+30 g·L^-1蔗糖，培养基pH在灭菌前调至5.8。所有试验在250 mL三角瓶中进行，每瓶装液量高压灭菌前均为100 mL，接种量为8～12 g·L^-1新鲜不定根，每个处理接种5瓶，培养结束后剔除污染等因素选取3瓶生长较好的不定根作为供试材料。培养室温度(25±1)℃，摇床转速120 r·min^-1，45～50天后收获。将收获的雷公藤不定根用去离子水冲洗后冷冻干燥至恒质量，计算不定根增长量，并将其粉碎过60目筛，干燥器保存用于提取雷公藤生物碱和雷公藤甲素。

计算方法为:不定根增长量/瓶=收获量-接种量。

雷公藤不定根粉碎过筛后，将每个处理的样品分别称取1 g(每个处理的3瓶样品分别取样)，参照文献(李琰等，2009;2010)的方法进行样品的制备和雷公藤总生物碱及雷公藤甲素含量的测定。每次测定重复3次，取其平均值。

碱及雷公藤甲素含量的影响不同浓度硫酸锰的4个处理结果(表 1)表明:无论是雷公藤不定根的生长还是雷公藤总生物碱及雷公藤甲素的合成，均需较高浓度的硫酸锰，硫酸锰浓度加倍才使雷公藤不定根的增长量达到最大值。而对于次生代谢产物的积累，在试验范围内雷公藤总生物碱及雷公藤甲素的含量随硫酸锰浓度的升高而升高，总生物碱产量在硫酸锰浓度为2倍时达到最大值。

表 1 硫酸锰对雷公藤不定根生长和雷公藤总生物碱及雷公藤甲素含量的影响 ^① Tab.1 Effects of MnSO₄ on adventitious root growth and total alkaloids and triptolide content of T. wilfordii

表 1 硫酸锰对雷公藤不定根生长和雷公藤总生物碱及雷公藤甲素含量的影响 ① Tab.1 Effects of MnSO4 on adventitious root growth and total alkaloids and triptolide content of T. wilfordii 硫酸锰浓度 MnSO4 concentration 增长量 Increment (DW) /g 总生物碱含量 Total alkaloids content/ (mg·g-1) 总生物碱产量 Total alkaloids yield /mg 雷公藤甲素含量 Triptolide content / (μg·g-1) 雷公藤甲素产量Triptolide yield/μg ①表中所有数据均为3次重复的平均值,不同字母表示经Duncan氏新复极差测验差异显著(P < 0.05)。下同。Data in the column are the means of three repetitions,different letters in the columns show significant difference at P < 0.05 by Duncan's multiple test.The same below. 0 1.30±0.02 c 2.61±0.06 d 3.39±0.05 d 36.61±2.20 c 47.60±0.73 d 1C( CK) 1.37±0.03 b 3.01±0.07 c 4.13±0.08 c 40.06±0.84 bc 54.88± 1.06 c 2C 1.41±0.01 a 3.43±0.07 b 4.83±0.03 a 44.13± 1.80 b 62.22±0.44 b 4C 1.28±0.02 c 3.60±0.08 a 4.61±0.06 b 63.42±2.71 a 81.18± 1.10 a

碱及雷公藤甲素含量的影响不同浓度硫酸锌对雷公藤不定根的生长和雷公藤总生物碱及雷公藤甲素的积累均有较大的影响(表 2)。NT培养基中原有的硫酸锌浓度即可使雷公藤不定根增长量达到最大值，浓度过高反而抑制不定根的生长。雷公藤总生物碱的积累所需要的硫酸锌浓度较高，总生物碱的含量和产量在试验范围内随着硫酸锌浓度的升高而升高。雷公藤甲素合成所需的硫酸锌浓度为NT培养基中的硫酸锌浓度的2倍，即可使雷公藤甲素含量和产量达到最大值。

表 2 硫酸锌对雷公藤不定根生长和雷公藤总生物碱及雷公藤甲素含量的影响 Tab.2 Effects of ZnSO₄ on adventitious root growth and total alkaloids and triptolide content of T. wilfordii

表 2 硫酸锌对雷公藤不定根生长和雷公藤总生物碱及雷公藤甲素含量的影响 Tab.2 Effects of ZnSO4 on adventitious root growth and total alkaloids and triptolide content of T. wilfordii 硫酸锌浓度 ZnSO4 concentration 增长量 Increment (DW) /g 总生物碱含量 Total alkaloids content/ (mg·g-1) 总生物碱产量 Total alkaloids yield /mg 雷公藤甲素含量 Triptolide content / (μg·g-1) 雷公藤甲素产量Triptolide yield/μg concentration ( DW) /g content/ (mgBg _1 ) yield /mg (沣 g，g-1) yield/ ^g 0C 1.22±0.02 d 2.31±0.06 d 2.82±0.04 d 34.89± 1.19 c 42.56±0.60 d 1 C( CK) 1.37±0.03 a 3.01±0.07 c 4.13±0.08 c 40.06±0.84 b 54.88± 1.06 c 2C 1.32±0.02 b 3.54±0.09 b 4.67±0.06 b 65.51± 1.51 a 86.47± 1.14 a 4C 1.27±0.01 c 3.96±0.07 a 5.02±0.04 a 63.38± 1.03 a 80.49±0.63 b

试验发现(表 3)，无论是对雷公藤不定根的生长还是雷公藤总生物碱合成，所需的硼酸浓度均较低。NT培养基中原有硼酸浓度比较适合雷公藤不定根的生长。培养基中是否添加硼酸，对于总生物碱的积累几乎没有影响;而硼酸的加入对雷公藤甲素的合成起抑制作用，且浓度越高抑制作用越强，培养基中不添加硼酸时，雷公藤甲素的含量和产量最高。

表 3 硼酸对雷公藤不定根生长和雷公藤总生物碱及雷公藤甲素含量的影响 Tab.3 Effects of H₃BO₃ on adventitious root growth and total alkaloids and triptolide content of T. wilfordii

表 3 硼酸对雷公藤不定根生长和雷公藤总生物碱及雷公藤甲素含量的影响 Tab.3 Effects of H3BO3 on adventitious root growth and total alkaloids and triptolide content of T. wilfordii 硼酸浓度 H3BO3 concentration 增长量 Increment (DW) /g 总生物碱含量 Total alkaloids content/ (mg·g-1) 总生物碱产量 Total alkaloids yield /mg 雷公藤甲素含量 Triptolide content / (μg·g-1) 雷公藤甲素产量Triptolide yield/μg 0C 1.33±0.01 b 3.02±0.06 a 4.02±0.03 ab 42.99± 1.51 a 57.17±0.43 a 1 C( CK) 1.37±0.03 a 2.96±0.07 a 4.06±0.08 a 40.06±0.84 b 54.88± 1.06 b 2C 1.30±0.02 bc 3.00±0.04 a 3.90±0.05 bc 35.05± 1.06 c 45.56±0.61 c 4C 1.28±0.01 c 2.94±0.05 a 3.77±0.03 c 29.68±0.63 d 37.99±0.30 d

是否添加碘化钾对雷公藤不定根的生长及雷公藤总生物碱的合成并没有太大影响(表 4)，浓度过高反而抑制不定根的生长，培养基中缺乏碘化钾时并不影响雷公藤总生物碱的合成，不论碘化钾浓度高低，雷公藤总生物碱的合成均不受影响。但雷公藤甲素的合成所需要的碘化钾浓度较高，当NT培养基中碘化钾浓度增加至4倍，雷公藤甲素含量为对照的1.3倍。

表 4 碘化钾对雷公藤不定根生长和雷公藤总生物碱及雷公藤甲素含量的影响 Tab.4 Effects of KI on adventitious root growth and total alkaloids and triptolide content of T. wilfordii

表 4 碘化钾对雷公藤不定根生长和雷公藤总生物碱及雷公藤甲素含量的影响 Tab.4 Effects of KI on adventitious root growth and total alkaloids and triptolide content of T. wilfordii 碘化钾浓度 KI concentration 增长量 Increment (DW) /g 总生物碱含量 Total alkaloids content/ (mg·g-1) 总生物碱产量 Total alkaloids yield /mg 雷公藤甲素含量 Triptolide content / (μg·g-1) 雷公藤甲素产量Triptolide yield/μg 0C 1.36±0.01 ab 3.00±0.04 a 4.08±0.03 ab 31.16±0.79 c 42.38±0.31 c 1 C( CK) 1.37±0.03 a 3.01±0.07 a 4.13±0.08 a 40.06±0.84 b 54.88± 1.06 b 2C 1.30±0.04 bc 3.01±0.07 a 3.91±0.11 bc 50.80± 1.29 a 66.03± 1.83 a 4C 1.24±0.02 c 3.02±0.05 a 3.75±0.05 c 53.32±0.98 a 66.12±0.92 a

研究结果(表 5)表明:雷公藤不定根的生长需要较高浓度的钼酸钠，在试验范围内雷公藤不定根的增长量随着钼酸钠浓度的增加而升高，当NT培养基中钼酸钠浓度增加4倍时，雷公藤不定根的增长量为对照的1.1倍。而钼酸钠的加入对雷公藤总生物碱及雷公藤甲素的合成起抑制作用，且浓度越高抑制作用越强，培养基中不添加钼酸钠时，雷公藤总生物碱及雷公藤甲素的含量达到最大值，且雷公藤甲素的含量为对照的1.3倍。

表 5 钼酸钠对雷公藤不定根生长和雷公藤总生物碱及雷公藤甲素含量的影响 Tab.5 Effects of Na₂MoO₄ on adventitious root growth and total alkaloids and triptolide content of T. wilfordii

表 5 钼酸钠对雷公藤不定根生长和雷公藤总生物碱及雷公藤甲素含量的影响 Tab.5 Effects of Na2MoO4 on adventitious root growth and total alkaloids and triptolide content of T. wilfordii 钼酸钠浓度 Na2MoO4 concentration 增长量 Increment (DW) /g 总生物碱含量 Total alkaloids content/ (mg·g-1) 总生物碱产量 Total alkaloids yield /mg 雷公藤甲素含量 Triptolide content / (μg·g-1) 雷公藤甲素产量Triptolide yield/μg 0C 1.36±0.02 b 3.13±0.03 a 4.25±0.05 a 50.12±1.46 a 68.16±0.87 a 1 C( CK) 1.37±0.03 b 3.01±0.07 b 4.13±0.08 a 40.06±0.84 b 54.88± 1.06 b 2C 1.40±0.03 ab 2.61±0.07 c 3.65±0.07 b 31.85±0.74 c 44.60±0.84 c 4C 1.44±0.02 a 2.28±0.03 d 3.29±0.05 c 24.42±0.41 d 35.16±0.49 d

当NT培养基中缺乏硫酸铜时，不仅影响雷公藤不定根的生长，而且雷公藤总生物碱和雷公藤甲素的积累也受到明显的抑制(表 6)。雷公藤不定根的生长所需的硫酸铜浓度较低，NT培养基中的硫酸铜浓度即可适合雷公藤不定根的生长，浓度过高反而抑制不定根的生长。但雷公藤总生物碱和雷公藤甲素的积累所需要的硫酸铜浓度较高，不定根中NT培养基中的硫酸铜浓度的2倍可使雷公藤总生物碱和雷公藤甲素的积累达到最大值。

表 6 硫酸铜对雷公藤不定根生长和雷公藤总生物碱及雷公藤甲素含量的影响 Tab.6 Effects of CuSO₄ on adventitious root growth and total alkaloids and triptolide content of T. wilfordii

表 6 硫酸铜对雷公藤不定根生长和雷公藤总生物碱及雷公藤甲素含量的影响 Tab.6 Effects of CuSO4 on adventitious root growth and total alkaloids and triptolide content of T. wilfordii 硫酸铜浓度 CuSO4concentration 增长量 Increment (DW) /g 总生物碱含量 Total alkaloids content/ (mg·g-1) 总生物碱产量 Total alkaloids yield /mg 雷公藤甲素含量 Triptolide content / (μg·g-1) 雷公藤甲素产量Triptolide yield/μg 0C 1.32±0.02ab 2.20±0.03 d 2.90±0.04 d 34.54±0.61 c 45.60±69d 1C( CK) 1.37±0.03a 3.01±0.07 c 4.13±0.08 c 40.06±0.84 b 54.88± 1.06 b 2C 1.34±0.02ab 3.54±0.05 a 4.74±0.07 a 51.07± 1.01 a 68.43±1.02 a 4C 1.30±0.02b 3.33±0.03 b 4.33±0.07 b 38.17±0.72 b 49.62±0.76 c

研究发现(表 7)，氯化钴浓度对雷公藤不定根的生长并不敏感，培养基中缺乏氯化钴不仅不影响雷公藤不定根的生长，反而提高了不定根中雷公藤甲素的含量。培养基中缺乏氯化钴时雷公藤总生物碱的合成受阻。可见，雷公藤总生物碱的合成还需要一定浓度的氯化钴参与，当NT培养基中氯化钴浓度为正常标准的2倍时，雷公藤总生物碱的含量及产量达到最大值。

表 7 氯化钴对雷公藤不定根生长和雷公藤总生物碱及雷公藤甲素含量的影响 Tab.7 Effects of CoCl₂ on adventitious root growth and total alkaloids and triptolide content of T. wilfordii

表 7 氯化钴对雷公藤不定根生长和雷公藤总生物碱及雷公藤甲素含量的影响 Tab.7 Effects of CoCl2 on adventitious root growth and total alkaloids and triptolide content of T. wilfordii 氯化钴浓度 CoCl2 concentration 增长量 Increment (DW) /g 总生物碱含量 Total alkaloids content/ (mg·g-1) 总生物碱产量 Total alkaloids yield /mg 雷公藤甲素含量 Triptolide content / (μg·g-1) 雷公藤甲素产量Triptolide yield/μg 0C 1.35±0.01 ab 2.73± 0.08c 3.69±0.03 c 42.23±0.82 a 57.01±0.42 a 1 C( CK) 1.37±0.03 a 3.01±0.07 b 4.13±0.08 b 40.06±0.84 b 54.88± 1.06 b 2C 1.35±0.02 ab 3.29±0.04 a 4.44±0.07 a 40.20±0.72 ab 54.27±0.80 b 4C 1.30±0.02 b 2.91±0.04 b 3.79±0.05 c 39.85±0.65 b 51.81±0.69 c

通过组织培养生产次生代谢产物时，如何提高培养物的增长量和目的产物的产量是首要解决的问题，而培养基的组成是解决这一问题的关键。在解决这一问题时，大多数人关注大量元素的组成而忽略了微量元素。虽然微量元素在培养基中含量较低，但它们是植物生长发育过程中必不可少的营养成分，缺乏时植物不能正常生长，稍有过量，反而对植物有害，甚至导致死亡(贺学礼，2009)。研究表明:微量元素对雷公藤不定根生长、雷公藤总生物碱及雷公藤甲素的含量有显著影响，培养基中缺乏硫酸锰、硫酸锌、硼酸明显影响雷公藤不定根的生长，另外，硫酸锰、硫酸锌、硫酸铜、碘化钾均需一定的浓度才能促进不定根中雷公藤甲素及总生物碱的合成。尚富德等(2003)在Cu²⁺对银杏(Ginkgobiloba)培养组织中黄酮产量的影响研究中发现，随着Cu²⁺浓度的增加，银杏细胞中黄酮含量也逐渐增加，但细胞生长会受到抑制。Perotti等(2010)报道，在MS培养基中，Cu²⁺浓度为正常标准的1.75倍时，离体培养的空心莲子草(Alternanthera philoxeroides)中花青素产量比对照提高了60%，Cu²⁺浓度超过正常标准的2倍时，花青素产量明显下降，并且对空心莲子草的生长表现出明显的中毒症状。这与本试验所得到的结论基本一致，在培养基中适当增加硫酸铜的浓度，对雷公藤总生物碱及雷公藤甲素的合成有明显的促进作用，但添加浓度过大则明显抑制其合成。分析原因可能是Cu²⁺作为超氧化物歧化酶、抗坏血酸氧化酶以及多酚氧化酶的关键成分，在氧化还原过程中起重要作用(贺学礼，2009)。

锰作为植物正常生长所必需的微量元素，尽管植物对其需求量很小，但它参与氮的代谢，是硝酸还原酶的活化剂，缺锰降低了硝酸还原酶的活性，从而影响植物对氮的利用，锰也影响生长素吲哚乙酸的代谢(施益华等，2003)。因此在细胞的初级代谢和次级代谢中起着至关重要的作用。试验发现，雷公藤不定根的生长、雷公藤总生物碱及雷公藤甲素的积累均需要较高浓度的锰，但浓度过高反而抑制不定根的生长、雷公藤甲素的合成。培养基中硫酸锌是雷公藤不定根生长、雷公藤甲素及总生物碱的合成所必需的。Zn²⁺不仅是多种酶的活化剂，还可通过RNA代谢影响蛋白质的生成，同时，也是生长素前身色氨酸合成所必需的，缺乏时不仅影响不定根的生长，而且对雷公藤生物碱及雷公藤甲素的合成也有明显的抑制作用。高柳青等(1999)报道，较高或较低浓度Zn²⁺和Mn²⁺限制了棉花(Gossypium sp.)对氮、磷养分的吸收。刘铮(1994)报道，当硅元素供给正常时，植物体内锰的分布均匀，减轻锰中毒症状，缓解铁中毒。可见，培养基中矿质营养元素的丰缺与平衡影响着初生代谢和次生代谢途径，从而影响了培养物中次生代谢产物的含量。本试验中，适合雷公藤不定根生长的微量元素浓度明显高于形成雷公藤生物碱及雷公藤甲素的合成培养基，结合大量元素试验结果(李琰等，2013)，在对雷公藤不定根进行组织培养时，需设计出适合雷公藤不定根生长的增殖培养基和雷公藤生物碱及雷公藤甲素的合成培养基，这2种培养基中不同成分之间的相互制约而导致成分之间的改变，还需进一步进行多因子交互试验。

李雪飞等(2010)在研究微量元素喷施对紫叶桃(Prunus persica f. atropurpurea)叶片花色苷含量及其合成酶活性的影响时发现，微量元素可以调控相关酶的活性，进而影响花色苷的合成和积累。李春雷等(2009)研究表明:外部因素如光照、 Ca2+和蔗糖等影响花色苷的积累大都是通过诱导相关转录因子的表达，然后通过这些转录因子调控花色苷途径结构基因的表达，进而影响花色苷的合成和积累。本试验中微量元素的添加是否也影响到雷公藤生物碱和雷公藤甲素合成基因的表达有待进一步研究。