杉木(Cunninghamia lanceolata)是我国南方最重要的工业用材树种，人工林面积达853.86万hm²，蓄积62 036.45万m³，分别占全国人工乔木林主要树种的21.35%和31.64%(贾治邦，2009)。杉木炭疽病是杉木栽培区的主要病害，几乎有杉木的地区就有炭疽病发生(曾大鹏等，1981；Babu et al.，2007)。病轻时杉木幼苗的针叶或嫩梢变褐枯萎，严重时幼林成片变黄、枯死，导致毁灭性的损害(王军等，1996)。杉木炭疽病的防治方法大多是营林防治和化学防治，然而化学药剂只有预防而无治疗作用(许彦君等，2011)，且长期使用会破坏杉木林生态系统，因此，目前防治杉木炭疽病更加趋向于研制开发一种高效安全的新型杀菌剂(李雪娇，2011)。

路宗岩等(2013)发现一种杉木炭疽病拮抗菌(地衣芽孢杆菌HY32)，该菌对杉木炭疽病的防治效果明显。但炭疽病拮抗菌的培养常存在着发酵周期长、芽孢形成率低、成本高等问题，为此许多学者对地衣芽孢杆菌的发酵条件进行了研究，以提高该菌的产量并降低生产成本(丰贵鹏等，2009；谷春涛等，2003；刘莹等，2006；Anja et al.，2013;Tola et al.，2014)。发酵培养基的营养组成成分和发酵培养条件均直接影响微生物发酵液中的含菌量与代谢产物(谷春涛，2004；唐娟，2008；纪明山等，2011)。一般情况，优化芽孢杆菌液体发酵培养基会采用单因子试验和正交设计的方法，当考察的因素比较多时，使用此方法不仅要求的试验次数多，并且还可能导致不可靠的结论。响应面法可同时对影响生物产量的各因子水平及其交互作用进行优化与评价，可快速有效地确定多因子系统的最佳条件(万芳芳，2012；郝聚喜，2011)。为此，本研究采用响应面试验设计法对菌株HY32的发酵培养基及培养条件进行研究，以期获得能产生较高活菌含量的培养基配方及培养条件。

杉木炭疽病的病原菌由中南林业科技大学经济林培育与保护教育部重点实验室分离，保藏于该实验室的菌种保藏中心，编号为CSUFTCC F0101。经鉴定，该菌为杉木胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)。供试拮抗菌为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)HY32，经分离、筛选及鉴定，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No. M2012273(路宗岩等，2013)。

将保存的HY32菌株移入新鲜的斜面培养基，28 ℃恒温培养1天。

将斜面上生长良好的HY32菌株接种到40 mL NB培养液的三角瓶中(100 mL)，于28 ℃、160 r·min^-1振荡培养24 h后，再按照5%的比例接种到20 mL NB培养液的三角瓶中(100 mL)，于28 ℃、160 r·min^-1，振荡培养24 h后制成种子液。

取HY32菌株发酵液，空白培养液作为对照，在722S可见分光光度计上测600 nm时菌液的 OD(optical density)值，以OD值的大小来表示菌体的浓度(乔军，1996)。

吸取50 μL HY32菌株发酵液滴于PDA平板中央，均匀涂布后，将直径为6 mm的病原菌菌饼放于平板中央，然后于28 ℃恒温培养5天。以不接拮抗菌、只接病原菌的平板为对照。测量菌落直径，计算抑菌率：抑菌率=(对照组直径－处理组直径)/对照组直径×100%。

碳源： 以蔗糖、葡萄糖、乳糖、丙三醇、淀粉各2 g·L^-1，作为原基础发酵培养基中的碳源，在28 ℃、160 r·min^-1条件下发酵培养48 h后，测定样品的OD₆₀₀值及其抑菌活性。

氮源： 用1％的酵母膏、牛肉膏、硝酸钾、硝酸钾+蛋白胨(1:1)，酵母膏+蛋白胨+硫酸铵(2:2:1)，酵母膏+蛋白胨+硝酸钾(2:2:1)替代基础发酵培养基中的氮源，在28 ℃、160 r·min^-1条件下发酵培养48 h后，测定样品的OD₆₀₀值及其抑菌活性。

响应面试验设计： 采用Box-Behnken(B-B)法，每个因素取3个水平，以(-1，0，l)编码，根据相应的试验设计表进行试验后，通过对试验数据进行二次回归拟合，得到拟合因素与响应值之间的二次方程(包括一次项、平方项和交互项)，分析各因素的主效应及交互效应，最后在一定水平范围内求取最佳值。

培养温度： 将HY32菌株按2%的比例接种于20 mL(100 mL三角瓶)筛出的最适培养基(初始pH7.0±0.2)中，分别在 26，28，30，32，34 ℃ 5种培养温度下，于160 r·min^-1培养48 h后，测定样品的OD₆₀₀值及其抑菌活性。

初始pH： 在筛选确定的最适培养基中，分别用1 mol·L^-1 NaOH和4 mol·L^-1 HCl 溶液将其pH 值调至 5.0，6.0，7.0，8.0，9.0。按照接种量为2%、装液量为20 mL/100 mL，将HY32菌株接种于筛出的最适培养基中，按照得到的培养温度、160 r·min^-1培养48 h后，测样品的OD₆₀₀值及其抑菌活性。

接种量： 在筛选确定的最适培养基中，将配制好的种子悬液分别按 2％，4％，6％，8％，10％比例接种至装液量为20 mL/100 mL的最适培养基，按照筛选得到的培养条件、160 r·min^-1培养48 h后，测样品的OD₆₀₀值及其抑菌活性。

摇床转速： 在筛选确定的最适培养基中，按照装液量为20 mL/100 mL，将HY32菌株接种于筛出的最适培养基中，按照筛选得到的培养条件，于120，160，180，200，240 r·min^-1培养48 h后，测样品OD₆₀₀值及其抑菌活性。

培养时间： 在筛选确定的最适培养基中，按照装液量为20 mL/100 mL，将HY32菌株接种于筛出的最适培养基中，按照筛选得到的培养条件，于培养12，24，36，48，60 h，按1.2.3和1.2.4所示方法测样品OD₆₀₀值及其抑菌活性。

响应面试验设计： 通过上述单因素试验法得到重要影响因素，然后以600 nm时菌液的 OD值作为响应目标，利用响应面方法(RSM)中的Box-Behnken(B-B)法，对单因素试验设计筛出的主要影响因素进行响应面试验，以期获得最优发酵培养条件。将得到的数据进行拟合，得到拟合因素与响应值之间的函数方程，通过对回归方程的分析来得到适宜的发酵工艺条件，最终确定最优发酵培养条件，并进行验证。

采用Design-expert V8.0软件对试验数据进行回归拟合，并对拟合方程做显著性检验和方差分析。

碳源是微生物或细胞正常生长、分裂的物质基础。从表 1可知，以葡萄糖、蔗糖为碳源的抑菌率和OD值要显著优于乳糖和淀粉，而以乳糖和淀粉为碳源的抑菌率和OD值又显著优于丙三醇。5种碳源以葡萄糖为最佳碳源，其产生的抑菌物质和活菌数最多，抑菌效果最好。

表 1 不同碳源对菌株HY32活菌数及抑菌率影响^① Tab.1 Effect of different carbon sources on viable count and bacteriostatic rate of HY32

表 1 不同碳源对菌株HY32活菌数及抑菌率影响① Tab.1 Effect of different carbon sources on viable count and bacteriostatic rate of HY32 指标Index 乳糖Lactose 蔗糖Sucrose 葡萄糖Glucose 可溶性淀粉Soluble starch 丙三醇Glycerol OD600 1.12±0.73b 1.62±0.68d 1.64±0.46d 1.43±0.05c 0.58±0.42a 抑菌率Bacteriostatic rate(%) 50.58±0.02b 66.72±0.12d 72.00±0.24e 61.50±0.09c 56.65±0.14a ① 表中数据为均值±标准差, 同行数值后标注的不同字母表示经方差分析处理间有显著性差异(P<0.05)，下同。 Data are mean±SD. Different alphabets mean significant difference in the same row (P<0.05). The same below.

氮源是构成生物体的蛋白质、核酸及其他氮素化合物的材料。由表 2可知，不同的氮源对拮抗菌拮抗活性的影响比较大，在供试的几种不同氮源组合中，硝酸钾+蛋白胨与硫酸铵+蛋白胨2种组合OD₆₀₀值及抑菌率均显著低于其他组合，表明有机氮源要明显比无机氮源效果好，当以蛋白胨与酵母膏作为氮源时，HY32菌株对病原菌的抑制率最高，达74.93%以上。因此，蛋白胨和酵母膏可选为最佳氮源组合。

表 2 不同氮源对菌株HY32活菌数及抑菌率影响^① Tab.2 Effect of different nitrogen sources on viable count and bacteriostatic rate of HY32

表 2 不同氮源对菌株HY32活菌数及抑菌率影响① Tab.2 Effect of different nitrogen sources on viable count and bacteriostatic rate of HY32 指标Index a b c d e f OD600 1.43±0.09a 1.75±0.06b 1.64±0.11b 1.63±0.90b 1.64±0.75b 1.44±0.11a 抑菌率Bacteriostatic rate(%) 50.65±0.03b 74.93±0.03c 67.03±0.02c 71.65±0.03d 71.00±0.04cd 44.33±0.03a ① a:硝酸钾+蛋白胨Potassium nitrate+peptone; b:酵母膏+蛋白胨Yeast extract+peptone； c:牛肉膏+蛋白胨Beef extract+ peptone； d:酵母膏+蛋白胨+硫酸铵Yeast extract+peptone+ ammonium sulphate； e:酵母膏+蛋白胨+硝酸钾Yeast extract+peptone+ potassium nitrate； f:硫酸铵+蛋白胨Ammonium sulphate+ peptone.

发酵培养基试验因素水平设计以及统计结果见表 3，4。以菌体发酵液的OD₆₀₀ 值为指标，葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、NaCl 4因素与OD₆₀₀值(R₁)之间的回归方程为：

表 3 发酵培养基Box-Behnken试验因素水平 Tab.3 Box-Behnken design of fermentation medium

表 3 发酵培养基Box-Behnken 试验因素水平 Tab.3 Box-Behnken design of fermentation medium g·L-1 因素Factor 水平 Level -1 0 1 A(葡萄糖Glucose) 15 20 25 B(酵母膏Yeast extract) 10 15 20 C(蛋白胨Peptone) 3 5 7 D(NaCl) 9 12 15

表 4 发酵培养基响应面试验设计及结果 Tab.4 Experimental design and results of response surface analysis on fermentation medium

表 4 发酵培养基响 应面试验设计及结果 Tab.4 Experimental design and results of response surface analysis on fermentation medium 试验号No. A B C D R1(OD600) 1 1 0 -1 0 1.461 2 1 0 0 1 1.602 3 1 0 1 0 1.514 4 -1 -1 0 0 1.638 5 0 0 -1 1 1.653 6 0 -1 0 -1 1.572 7 0 0 0 0 1.744 8 -1 1 0 0 1.591 9 -1 0 0 1 1.617 10 0 0 1 -1 1.510 11 0 -1 -1 0 1.645 12 1 0 0 -1 1.375 13 0 0 0 0 1.741 14 0 0 1 1 1.528 15 0 1 -1 0 1.432 16 -1 0 0 -1 1.447 17 0 -1 0 1 1.648 18 -1 0 -1 0 1.582 19 -1 0 1 0 1.536 20 0 -1 1 0 1.544 21 0 0 0 0 1.745 22 0 0 0 0 1.723 23 1 1 0 0 1.539 24 0 1 1 0 1.612 25 0 0 -1 -1 1.375 26 0 1 0 1 1.661 27 0 1 0 -1 1.367 28 0 0 0 0 1.711 29 1 -1 0 0 1.558

R₁=-1.968 05+0.127 36A-0.022 062B+

     0.252 52C+0.314 15D+(2.800 00E-004)AB+

     (2.475 00E-003)AC+(9.500 00E-004)AD+

    (7.025 00E-003)BC+(3.633 33E-003)BD-

     0.010 833CD-(4.034 33 E-003)A²-

    (2.299 33E-003)B²-0.027 340C²-

     0.012 665D²。

式中，R₁为OD₆₀₀值，A，B，C，D分别为葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、NaCl的编码值。二次多项式方程拟合的方差分析结果见表 5。回归模型达到显著水平(P<0.000 1)，且回归方程的相关系数R²=0.981 3。另外失拟项在α=0.05水平上不显著(P=0.203 7>0.05)，误差项不显著，说明实际情况和回归方程之间的吻合度比较好，试验的误差小，用该回归方程代替试验真实点对试验结果进行分析是可行的。另外，该回归模型各项的方差分析结果还表明，1次项、2次项都有较显著影响，因此响应值的变化十分复杂，与各具体试验因素之间不是简单的线性关系。回归模型中，1次项A，B，D对样品OD值的曲面效应显著，2次项A²，B²，C²，D²的效应均极显著，交互项AB和AD的交互效应不显著。因此，在一定范围内可变动葡萄糖、酵母膏、蛋白胨及NaCl之间的关系，使发酵液中的活菌数(即样品OD值)达到最高水平。

表 5 发酵培养基方差分析 Tab.5 Analysis of variance on fermentation medium

表 5 发酵培养基方差分析 Tab.5 Analysis of variance on fermentation medium 数据源 Source SS DF MS F Sig. 模型 Model 0.34 14 0.024 52.40 <0.000 1 A 0.011 1 0.011 23.69 0.000 2 B 0.014 1 0.014 29.37 <0.000 1 C 7.680E-004 1 7.680E-004 1.67 0.217 7 D 0.094 1 0.094 204.31 <0.000 1 AB 1.960E-004 1 1.960E-004 0.43 0.524 9 AC 2.450E-003 1 2.450E-003 5.32 0.036 9 AD 8.123E-004 1 8.123E-004 1.76 0.205 6 BC 0.020 1 0.020 42.83 <0.000 1 BD 0.012 1 0.012 25.78 0.000 2 CD 0.017 1 0.017 36.67 <0.000 1 A2 0.066 1 0.066 143.17 <0.000 1 B2 0.021 1 0.021 46.51 <0.000 1 C2 0.078 1 0.078 168.31 <0.000 1 D2 0.084 1 0.084 182.85 <0.000 1 误差Error 9.128E-004 4 2.282E-004 总和Total 0.34 28

利用 Design-expert 8.0软件对表 2中的数据进行分析，可得到发酵液的最大OD₆₀₀值为1.745。各试验因素的最佳取值分别为： 葡萄糖19.80 g·L^-1，酵母膏12.16 g·L^-1，蛋白胨4.22 g·L^-1，NaCl13.13 g·L^-1。为了验证本次分析结果的准确性，通过3次重复试验，所得发酵液的实际OD₆₀₀值的平均值为1.743，可见实际结果与Design-expert 8.0软件的预测结果符合良好，说明采用响应面法优化菌株HY32的发酵培养基配方是可行的。

温度对微生物生长及其代谢物质的合成有很大的影响，合适的温度可以促进菌体生长和代谢产物的合成。由表 6可知，温度较高或较低情况下拮抗菌的抑菌活性均比较低，其中，30 ℃时的菌株的OD₆₀₀值及抑菌率均显著高于其他温度，故菌株HY32最适培养温度为30 ℃。

表 6 不同培养温度对菌株HY32活菌数及抑菌率的影响 Tab.6 Effect of different culture temperatures on viable count and bacteriostatic rate of HY32

表 6 不同培养温度对菌株HY32活菌数及抑菌率的影响 Tab.6 Effect of different culture temperatures on viable count and bacteriostatic rate of HY32 指标Index 26 ℃ 28 ℃ 30 ℃ 32 ℃ 34 ℃ OD600 1.59±0.04b 1.75±0.57c 1.83±0.57d 1.72±0.02c 1.53±0.02a 抑菌率Bacteriostatic rate(%) 57.73±0.02a 71.95±0.01c 78.60±0.01d 66.85±0.02d 70.75±0.08b

pH能够引起细胞膜电荷变化及营养物的离子化，进而影响细胞的生长和繁殖，影响抗菌物质的产生。摇瓶发酵时，培养基的pH 一直在变化，难以人为控制，故本试验仅考虑培养基初始pH对活菌数及抑菌活性的影响。由表 7可知，不同的初始pH对活菌数及抑菌活性 影响显著，且pH8较适宜菌株生长，当pH低于6.0或大于9.0时，活菌数及抑菌活性均显著下降。

表 7 不同初始pH对菌株HY32活菌数及抑菌率的影响 Tab.7 Effect of different initial pH values on viable count and bacteriostatic rate of HY32

表 7 不同初始pH对菌株HY32活菌数及抑菌率的影响 Tab.7 Effect of different initial pH values on viable count and bacteriostatic rate of HY32 指标Index pH5.0 pH6.0 pH7.0 pH8.0 pH9.0 OD600 1.23±0.09a 1.44±0.08b 1.63±0.07c 1.64±0.08c 1.55±0.06c 抑菌率Bacteriostatic rate(%) 44.95±0.03a 65.90±0.03c 76.10±0.02d 76.70±0.03d 61.75±0.02b

由表 8可知，在一定范围内，活菌数和抑菌活性随接种量的增加而增加，当接种量在6%以上时抑菌率显著降低，故 6%接种量为最优。

表 8 不同接种量对菌株HY32活菌数及抑菌率的影响 Tab.8 Effect of different inoculums on viable count and bacteriostatic rate of HY32

表 8 不同接种量对菌株HY32活菌数及抑菌率的影响 Tab.8 Effect of different inoculums on viable count and bacteriostatic rate of HY32 指标Index 2% 4% 6% 8% 10% OD600 1.61±0.05a 1.71±0.05b 1.74±0.04b 1.72±0.03b 1.64±0.04a 抑菌率Bacteriostatic rate(%) 60.83±0.03a 72.10±0.03bc 82.80±0.04d 73.96±0.02c 67.23±0.03b

摇床转速的高低会影响发酵液的溶氧，转速高则溶氧高，反之则低。溶氧对菌体的生长繁殖非常重要，菌体在溶氧量不足时就会死亡。但转速过高时会产生较大的剪切力，对菌体造成伤害，从而影响菌体的生长繁殖及其代谢产物的合成。由表 9可知，摇瓶转速为 180 r·min^-1时，HY32菌株发酵液的活菌数及抑菌活性达到最高且显著优于其他处理，当转速达到 200 r·min^-1时，活菌数及抑菌率下降。

表 9 不同摇床转速对菌株HY32活菌数及抑菌率的影响 Tab.9 Effect of different rotation speed on viable count and bacteriostatic rate of HY32

表 9 不同摇床转速对菌株HY32活菌数及抑菌率的影响 Tab.9 Effect of different rotation speed on viable count and bacteriostatic rate of HY32 指标Index 120 r·min-1 140 r·min-1 160 r·min-1 180 r·min-1 200 r·min-1 OD600 1.35±0.10a 1.61±0.09b 1.67±0.08b 1.72±0.09b 1.58±0.14b 抑菌率Bacteriostatic rate(%) 45.65±0.02a 68.45±0.02b 78.35±0.03d 82.75±0.02e 66.18±0.04b

由表 10可知，HY32菌株在培养24 h内，菌量呈对数增长，到36 h左右生物产量达最大值，OD₆₀₀值出现最高峰，为1.783 6。而培养72 h的发酵液的抑菌率最大为84.7%，72 h后开始显著下降。由此可见，与菌体的对数增长期相比，抑菌活性物质的产生相对滞后。在培养36 h后，HY32菌株的生长呈现衰退趋势，菌体逐渐死亡，但是抑菌活性物质的产量仍处在积累的过程中。菌体繁殖数量与抑菌物质活性强弱的关系表明，拮抗物质应是细菌繁殖达到高峰后在衰亡过程中释放到体外的代谢物质，因此，菌株HY32发酵产生抑菌活性物质的最适培养时间为72 h。

表 10 不同培养时间对菌株HY32活菌数及抑菌率的影响 Tab.10 Effect of different culture times on viable count and bacteriostatic rate of HY32

表 10 不同培养时间对菌株HY32活菌数及抑菌率的影响 Tab.10 Effect of different culture times on viable count and bacteriostatic rate of HY32 指标Index 6 h 12 h 24 h 36 h 48 h 60 h 72 h 84 h OD600 0.30±0.05a 1.11±0.08b 1.41±0.07d 1.75±0.08f 1.71±0.02f 1.61±0.08e 1.44±0.05d 1.26±0.03c 抑菌率Bacteriostatic rate(%) 20.63±0.02a 37.43±0.02b 56.00±0.01d 71.60±0.01e 71.85±0.01e 74.48±0.01f 80.20±0.02g 41.20±0.02c

在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken中心设计原理，对影响HY32菌株的活菌数及抑菌活性的重要因素，即培养温度、初始pH和摇床转速，采用Design-expert V8.0软件进行3因素3水平(表 11)的中心组合设计(表 12)。

表 11 发酵培养条件Box-Behnken试验因素水平 Tab.11 Box-Behnken design of culture conditions

表 11 发酵培养条件Box-Behnken试验因素水平 Tab.11 Box-Behnken design of culture conditions 因素Factor ( X) 水平Level -1 0 1 A(培养温度Temperature)/℃ 28 30 32 B(初始pH Original pH) 7.0 8.0 9.0 C(摇床转速Rotation speed)/(r·min -1) 160 180 200

表 12 响应面试验设计及结果 Tab.12 Experimental design and results of response surface analysis on culture conditions

表 12 响应面试验设计及结果 Tab.12 Experimental design and results of response surface analysis on culture conditions 试验号 No. A B C R2(OD600) 1 0 -1 -1 1.552 3 2 -1 -1 0 1.618 4 3 0 0 0 1.863 2 4 0 -1 1 1.714 4 5 0 0 0 1.853 1 6 0 1 -1 1.604 5 7 -1 0 1 1.610 2 8 -1 0 -1 1.524 1 9 1 0 -1 1.641 1 10 0 0 0 1.864 2 11 0 1 1 1.711 4 12 1 0 0 1.731 5 13 -1 1 0 1.601 2 14 0 0 0 1.835 6 15 1 1 0 1.740 6 16 0 0 0 1.832 2 17 1 -1 0 1.667 4

为考察各因素对HY32菌株活菌数的影响，以菌体发酵液的OD₆₀₀值为指标，对表 5中的试验结果进行分析，得到3因素与OD₆₀₀值(R₂)之间的回归方程：

R₂＝-36.555 04+1.519 07A+1.189 03B+0.112 88C+0.011 300AB+ (2.687 50E-005)AC- (6.900 00E- 004)BC- (0.026 461E-003)A²-0.086 918B²- (2.927 31E-004)C²。

二次多项式方程拟合的方差分析结果见表 13。回归模型达到显著水平(P<0.000 1)，且回归方程的相关系数R²=0.988 9，说明回归显著；另外，失拟项在α=0.05水平上不显著(P=0.251 8>0.05)，误差项不显著，说明实际情况和回归方程之间的吻合度比较好，试验的误差小，用该回归方程代替试验真实点对试验结果进行分析是可行的。该回归模型各项的方差分析结果还表明，1次项、2次项都有较显著影响，因此响应值的变化十分复杂，与各具体试验因素之间不是简单的线性关系，故在一定范围内可变动培养温度、初始pH和摇床转速之间的关系，使发酵液中的活菌数达到最高水平。

表 13 方差分析 Tab.13 Analysis of variance on culture conditions

表 13 方差分析 Tab.13 Analysis of variance on culture conditions 数据源Source SS DF MS F Sig. 模型Model 0.20 9 0.023 69.19 <0.000 1 A 0.023 1 0.023 69.40 <0.000 1 B 1.383E-003 1 1.383E-003 4.22 0.079 1 C 0.025 1 0.025 75.65 <0.000 1 AB 2.043E-003 1 2.043E-003 6.23 0.041 2 AC 4.622E-006 1 4.622E-006 0.014 0.908 8 BC 7.618E-004 1 7.618E-004 2.32 0.171 3 A2 0.047 1 0.047 143.83 <0.000 1 B2 0.032 1 0.032 96.99 <0.000 1 C2 0.058 1 0.058 176.03 <0.000 1 总和Total 0.210 16

利用 Design-expert 8.0软件对表 11，12中的数据进行分析后，可得到发酵液的最大OD₆₀₀值为1.864。各试验因素的最佳取值分别为培养温度30.52 ℃，初始pH8.09，摇床转速184.67 r·min^-1。为了验证本次分析结果的准确性，结合实际情况，将菌株HY32发酵培养条件的最佳条件修正为培养温度30.5 ℃，初始pH8，摇床转速185 r·min^-1。通过3次重复试验，所得发酵液的实际OD₆₀₀值的平均值为1.861，可见实际结果与软件的预测结果吻合良好，说明采用响应面法优化菌株HY32的发酵培养条件是可行的。

采用单因素试验法和响应面法，对地衣芽孢杆菌菌株HY32的发酵培养基及发酵条件进行了优化。结果表明：拮抗菌株HY32最佳发酵培养基的最适碳源为葡萄糖，最适氮源为酵母膏和蛋白胨；在单因素试验的基础上，采用响应面法分析得到拮抗菌HY32的最佳培养基配方为葡萄糖19.80 g·L^-1、酵母膏12.16 g·L^-1、蛋白胨4.22 g·L^-1、NaCl 13.13 g·L^-1。经过单因素试验及响应面法优化得到菌株HY32的最佳发酵培养条件为：培养温度30.52 ℃，初始pH8.09，摇床转速184.67 r·min^-1。对优化培养基及发酵培养条件进行了验证，验证结果表明采用响应面法优化菌株HY32的发酵培养基及发酵条件是可行的。与针对芒果(Mangifera indica)(任建国等，2010)、苹果(Malus pumila)(王亮，2012)、胡萝卜(Davucus sp.)(Tola et al.，2014)等植物炭疽病筛选拮抗菌地衣芽孢杆菌的培养研究相比，杉木拮抗菌株HY32同样表现为有机氮源优于无机氮源，蔗糖、葡萄糖优于乳糖，但适宜培养温度、pH具有较大区别，这可能是炭疽病发生对象不同以及该菌菌株遗传异质性所致。

以杉木炭疽病病原菌作为指示菌，本试验研究了菌株HY32 的最佳发酵培养基优化和发酵培养条件，明确了其在发酵代谢过程中的一些规律。但是在试验过程中存在一些问题，即能够产生最大菌体数量的发酵条件和能够产生最高拮抗活性的发酵条件通常不会完全吻合，因而在试验中对菌体发酵条件进行优化时，往往不能同时兼顾以上2项指标，这可能是由于细菌的生长繁殖和其代谢物质的产生并不是同步进行，或者菌体和抗菌物质的性状有差异，这还有待于进一步的研究。此外，大规模的工业化发酵条件与实验室内试验水平不同，各参数数据会有一定变化，但总体趋势一般不会有太大差异，实验室内研究结果仍能为拮抗菌HY32 作为生防菌进行大规模的发酵提供理论依据。