植物茎端分生组织(shoot apical meristem，SAM)发育调控的分子机制一直是研究热点之一，转录因子对SAM内基因的表达调控起着关键作用。GRAS转录因子是植物特有的一类蛋白，在植物侧生器官形成(Greb et al.，2003; Li et al.，2003)、根辐射生长(Pysh et al.，1999; Lee et al.，2008)、光敏信号转导(Bolle et al.，2000; Torres-Galea et al.，2006)、抗逆反应(Fode et al.，2008; Ma et al.，2010)等多个方面发挥着重要作用。GRAS转录因子分为DELLA，SCR，Ls，SCL4/7，HAM(Hairy meristem)，PAT1，SHR以及SCL9共8个亚家族(Bolle，2004)，其中HAM亚家族对维持SAM的未分化状态发挥着重要作用(Engstrom et al.，2011)。研究发现，矮牵牛(Petunia hybrida)HAM 基因缺失突变体ham中，SAM发生分化形成一层毛簇状的皮层组织，并出现开花提前、花数量减少以及花器官部分缺失等症状(Stuurman et al.，2002)； 拟南芥(Arabidopsis thaliana)3个HAM同源基因SCL6(Scarecrow like 6)、SCL22和SCL27缺失也表现出类似症状(Schulze et al.，2010; Wang et al.，2010)，表明这些基因对于维持SAM的状态是不可缺少的。

竹子具有速生的特点，长期处于营养生长，一旦开花后多数死亡，一般认为与SAM的状态有着必然联系，然而其调控分子机制尚未可知。为此，人们分离了多个与竹茎节间伸长相关的基因(He et al.，2013)、EST(Zhou et al.，2011)以及开花相关的基因(田波等，2005； Hisamoto et al.，2008； 高志民等，2010； 崔丽莉等，2010)，并进行了初步功能研究，但有关HAM亚家族竹子转录因子的研究却鲜有报道。麻竹(Dendrocalamus latiflorus)是我国南方广泛栽培的重要笋材两用经济竹种之一，出笋盛期的笋量占全期的57.48%，高生长盛期生长量占全高的81.12%(周本智，1999)，随着麻竹林面积的迅速扩大，竹林开花也大大增加，且尚无有效的对策(邱尔发等，2002)。本研究以麻竹为对象，分离HAM亚家族SCL6基因，在分析其分子特征的基础上，通过转化模式植物拟南芥初步研究其功能，以期为揭示麻竹笋发育、开花调控的分子机制提供基础材料。

2年生麻竹扦插苗，培养条件： 光照200 μmol·m^-2s^-1，光/暗为16 h /8 h，温度25 ℃。

麻竹叶片总RNA的提取采用Trizol法(Gao et al.，2006)，cDNA和RACE cDNA的合成分别使用Promega公司的反转录试剂盒和Clontech的SMART RACE试剂盒，操作参考试剂盒说明书进行。

根据玉米(Zea may)SCL6基因(EU974370)保守区序列设计引物：DlSCL6-F： 5′-TCGCCGACCGTCCAGTTC-3′和DlSCL6-R： 5′-AGCTCCGATTCCTGCCACC-3′。以麻竹叶片cDNA为模板，进行PCR扩增。电泳检测PCR产物，回收目的片段并连接到pGEM-T easy载体(Promega公司)，阳性克隆送华大基因公司测序。

根据获得的保守区序列设计3′RACE引物，3-1： 5′-AAGCCGTCGCCGTTCATCTC-3′和3-2： 5′-CTCCGTCCCGCCATTGTCGTGT-3′；5′RACE引物5-1： 5′-AGGCTGAGGGCGTGATGCGGGA-3′和5-2： 5′-CAGCGACACCAATGCCGTCACCTT-3′。PCR扩增操作参考SMART RACE试剂盒说明书。

利用DNAStar软件对获得的序列进行拼接和初步分析，利用ProtScale(Kyte et al.，1982)、SOMPA(Deléage et al.，1997)、Motif Scan等在线软件分析编码蛋白的亲水性/疏水性、二级结构和功能域等。利用Mega 4.0软件的邻接法(Neighbor-Joining，NJ)构建基于SCL6同源蛋白序列的系统进化树。

根据原核表达载体(pET-30a)的多克隆位点和目的基因编码区序列酶切位点特征，设计添加酶切位点(NdeⅠ和NotⅠ)的引物(YF： 5′- AAcatatgTCCTGCGATCTCCACCCCA -3′和YR： 5′- TgcggccgcGCACCGCCAGGCTGACACC -3′)，以麻竹叶片cDNA为模板进行扩增，产物经测序正确后，采用双酶切直接克隆到pET-30a的多克隆位点，形成基因的原核表达载体。应用电转化法将载体质粒转入表达菌株BL21(DE3)感受态细胞，挑取阳性单克隆用于继续培养、诱导表达(陈东亮等，2013)。按照试剂盒(MERCK公司，Cat.No.70239-3)操作说明纯化目的蛋白。

根据DlSCL6基因序列和表达载体pCAMBIA1301的多克隆位点特征，设计添加酶切位点XbaⅠ和KpnⅠ的引物，正义引物(SCL6Fs： 5′- ggtaccATGTCCTGCGATCTCCACCCCA-3′；SCL6Rs： 5′-tctagaGCACCGCCAGGCTGACACC-3′)和反义引物(SCL6Fa： 5′-tctagaATGTCCTGCGATCTCCACCCCA-3′；SCL6Ra： 5′-ggtaccGCACCGCCAGGCTGACACC-3′)，采用高保真酶进行扩增，产物回收后末端加A，连接到pGEM-T easy载体后转化大肠杆菌DH5α。用XbaⅠ和KpnⅠ双酶切测序正确的克隆质粒和pCAMBIA1301载体质粒，回收目的片段并进行连接，对构建的载体质粒酶切检测。

采用农杆菌介导法转化拟南芥(Arabidopsis thaliana)(徐芳等，2005)。获得的种子经连续的潮霉素(50 mg·L^-1)抗性筛选，T3代不再分离的株系视为纯合系，并对其进行RT-PCR检测后，用于下一步试验。以拟南芥Ubiquitin基因(NM180850)为内参(引物为AtUbi-F： 5′- ATGGAAAATCCCACCTA CTAAATT-3′和AtUbi-R： 5′-TTGAACAACTCGTA GCAACTCATC -3′)，采用半定量PCR的方法，检测目的基因在转基因植株中的相对表达量(引物为DlSCL6Q-F： 5′- GCTCACCATGTCCTGCGATC -3′和DlSCL6Q-R： 5′- AGTCCTCGGCGCTGATGG -3′)，同时以野生型拟南芥作对照。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后用凝胶成像仪拍照，并用软件(AlphaImage 2200 analysis system)获取目的条带的积分光密度值(Integrated Density Value，IDV)，用目的基因与内参基因扩增条带IDV的比值来计算相对表达量(Gao et al.，2012)。定期观察转基因株系表型，拍照记录。

以麻竹叶片cDNA为模板，用引物DlSCL6-F和DlSCL6-R进行PCR扩增，测序得到一个806 bp的序列。NCBI blast分析表明，该序列与水稻(Oryza sativa)、玉米、高粱(Sorghum bicolor)等单子叶植物的SCL6基因有着较高的同源性，表明该序列为麻竹中SCL6同源基因的一部分。根据该序列设计的RACE引物，分别得到基因的3′和5′端序列，与保守区序列拼接后获得基因cDNA全长2 006 bp，其中包括129 bp的5′UTR，266 bp的3′UTR和1 611 bp的ORF，该基因命名为DlSCL6(GenBank注册号： KC182562)。

NCBI blastp分析显示，公共蛋白数据库中与DlSCL6一致性在40%以上的物种就有31个，其中与水稻的一致性最高(75%)，与拟南芥的一致性达到了43%。构建基于不同物种SCL6同源蛋白的系统进化树，结果显示单子叶植物和双子叶植物分别聚集成2个大的分支(图 1)。在单子叶分支中，亲缘关系较近的玉米和高粱聚在一起，麻竹则与水稻聚集在一个分支，而与二穗短柄草(Brachypodium distachyon)、节节麦(Aegilops tauschii)的分支距离较远，这与NCBI blastp比对的结果一致。

	图 1 基于SCL6同源蛋白序列的系统进化树分析 Fig. 1 Phylogenetic tree analysis based on SCL6 proteins 每个分支上的数字表示1 000次重复搜索的靴带值。 Numbers on major branches indicate bootstrap estimates for 1 000 replicate analyses.

DlSCL6编码536个氨基酸的蛋白，蛋白总体略微呈疏水性。预测蛋白分子量为56.9 kDa，等电点为5.886。结构域分析表明，该蛋白具有LHRⅠ，VHIID，LHRⅡ，PFYRE，SAM 5个保守域(图 2)，符合GRAS家族蛋白特征(Pysh et al.，1999; Bolle，2004)。折叠结构分析显示，DlSCL6主要含有无规则卷曲、β折叠、延伸链和α螺旋4种结构，其中α螺旋比例最高，覆盖了43.84%的氨基酸残基。蛋白折叠状态分析显示DlSCL6蛋白高度折叠化，表明该蛋白具有比较稳定的三级结构，作为一个重要转录因子在麻竹中可能具有重要功能。

	图 2 DlSCL6蛋白结构分析 Fig. 2 Protein structure analysis of DlSCL6

将DlSCL6的原核表达载体质粒电击转入表达菌株，阳性克隆经过菌落PCR检测(图略)后进行诱导表达。SDS-PAGE电泳结果显示，重组蛋白主要存在包涵体蛋白中，而可溶性蛋白含量较低 (图 3A)。虽然采用了不同IPTG浓度、不同诱导温度、不同诱导时间等因子的优化，但仍没能得到高表达的可溶蛋白，其原因有待进一步研究。按照蛋白纯化试剂盒说明操作，在变性条件下纯化目的蛋白，进行SDS-PAGE电泳，有1条分子量约为60 kDa的清晰条带(图 3B)，与预期的DlSCL6重组蛋白(预测蛋白分子量为56.9 kDa，His·Tag重组标签约为3 kDa)大小相一致。

	图 3 SDS-PAGE重组蛋白检测 Fig. 3 SDS-PAGE analysis of recombinant proteins A：粗蛋白(1：沉淀；2：上清)；B：纯化蛋白； M: 蛋白分子量标记。 A: Crude protein (1: Precipitation; 2: Supernatant); B: Purified protein; M: Protein molecular marker.

测序结果表明，正义引物(SCL6Fs和SCL6Rs)与反义引物 (SCL6Fa和SCL6Fa)扩增获得的序列均包含添加的酶切位点(XbaⅠ和KpnⅠ)及对应的编码区序列(正义、反义)。构建正反义表达载体，并用XbaⅠ和KpnⅠ双酶切验证。结果表明，酶切得到的条带大小与预期的相符(图略)，证明表达载体是正确的，分别命名为DlSCL6-sense和DlSCL6-antisense。通过电击法将DlSCL6-sense和DlSCL6-antisense质粒分别转入农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)GV3101感受态细胞中，转化拟南芥，收取种子。

利用含有潮霉素的1/2MS培养基平板进行筛选，分别得到转基因正、反义不分离的T3抗性株系6个。RT-PCR检测显示： 转正、反义植株均在预期位置得到清晰条带，而野生型拟南芥没有此条带(图 4)，表明DlSCL6基因已经成功转入到这些拟南芥植株中，并正常转录。

	图 4 转DlSCL6基因植株的RT-PCR检测 Fig. 4 RT-PCR analysis of DlSCL6 transgenic plants A：正义(1：野生型；2-7：正义转基因植株)； B：反义(1：野生型；2-7：反义转基因植株)； M: DNA分子量标记。 A: Sense (1: Wild type; 2-7: Sense transgenics); B: Antisense (1: Wild type; 2-7: Antisense transgenics); M: DNA molecular marker.

转基因植株表型分析表明：与野生型(图 5A)相比，转正义DlSCL6基因植株营养期延长，莲座叶数量明显增加(图 5B)，植株粗壮，开花延迟；而转入反义基因的株系表型恰好相反，莲座叶数量明显减少(图 5C)，植株瘦弱，开花提前。在转反义DlSCL6基因株系中，1个侧生点并排生出2个侧枝(图 5D)、双荚果的现象比较常见(图 5E)，个别株系也会有在发育正常的侧枝下部长出第二侧枝的现象(图 5F)，但这个侧枝往往败育，不能形成种子。

	图 5 转基因植株表型分析 Fig. 5 Phenotypic analysis of transgenic plants A：野生型；B：正义；C：反义；D：两侧枝； E：双果荚；F：第二侧枝。 A: Wild type; B: Sense; C: Antisense; D: Dual side shoots; E: Dual pods; F: The second collateral.

选取具有表型变化的正义转基因植株(S-1)和反义转基因植株(A-1，A-3，A-4)，进行半定量RT-PCR检测DlSCL6的表达情况。结果表明，在转基因植株中DlSCL6呈现了不同程度的表达，而野生型对照中没有表达(图 6)。3个反义转基因植株中，A-4中DlSCL6的表达量最高，约是内参基因的1.67倍，A-3、A-1分别是内参基因的0.96和0.64倍； 正义转基因植株S-1中DlSCL6的表达量约是内参基因的0.61倍。

	图 6 转基因植株中DlSCL6表达的半定量RT-PCR检测 Fig. 6 Semi-quantitative RT-PCR analysis of DlSCL6 transgenic plants WT：野生型；A-1，A-3，A-4：反义；S-1：正义。 WT: Wild type; A-1, A-3, A-4: Antisense; S-1: Sense.

在GRAS家族的8个亚家族中，HAM亚家族与其他亚家族基因明显不同，都具有一个高度匹配的miR171位点，其基因表达也受到miR171的抑制调控。对拟南芥3个HAM亚家族基因SCL6-Ⅱ，SCL6-Ⅲ和 SCL6-Ⅳ研究表明，它们的突变体表现出侧芽数量较少，叶绿素积累，初生根变短，以及叶和花的不正常等症状，与miR171c过量表达的症状一致，表明这3个基因是miR171c的靶基因(Lee et al.，2008; Wang et al.，2010)。本研究克隆的DlSCL6基因中部具有一个高度保守的miR171匹配位点(GATATTGGCGCGGCTCAATCA)，进一步表明了DlSCL6属于GRAS家族HAM亚家族，但其受miR171调控的机制有待深入研究。

HAM基因是维持矮牵牛和拟南芥茎端分生细胞未分化状态的关键基因之一。拟南芥ham基因发生缺失突变时，会导致开花提前、莲座叶数量较少等性状的变异(Engstrom et al.，2011)。本研究中，转正义基因DlSCL6的拟南芥植株表现出开花延迟、莲座叶增多、植物健壮等表型，显示出与拟南芥突变株相反的表型。用半定量RT-PCR检测，3个反义转基因植株中的DlSCL6的表达量都有不同程度的提高(0.64～1.67倍)，作者推测这是由于DlSCL6的超量表达所致。另外在矮牵牛中ham缺失突变体株系会发生侧生器官的缺失，并在缺失器官部位形成了一个环痕结构(Engstrom et al.，2011)。本研究中转反义基因的拟南芥植株中不但没有发现器官缺失现象，反而有在一个侧生点并排出现2个侧枝或荚果的表型，究其原因可能是由于超量表达反义DlSCL6导致顶端分生组织发生异化，促进了侧生器官的形成。然而，DlSCL6在麻竹中的作用尚有待于进一步证实。