林业科学  2014, Vol. 50 Issue (11): 30-35   PDF    
DOI: 10.11707/j.1001-7488.20141104
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文章信息

张金尧, 刘俊祥, 巨关升, 韩蕾, 孙振元
Zhang Jinyao, Liu Junxiang, Jü Guansheng, Han Lei, Sun Zhenyuan
旱柳非叶光合组织(皮层)叶绿体光合特性
Chloroplast Photosynthetic Characteristics of Non-Leaf Photosynthetic Tissues (Cortex) of Salix matsudana
林业科学, 2014, 50(11): 30-35
Scientia Silvae Sinicae, 2014, 50(11): 30-35.
DOI: 10.11707/j.1001-7488.20141104

文章历史

收稿日期:2014-03-07
修回日期:2014-07-28

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张金尧
刘俊祥
巨关升
韩蕾
孙振元

旱柳非叶光合组织(皮层)叶绿体光合特性
张金尧, 刘俊祥, 巨关升, 韩蕾 , 孙振元    
中国林业科学研究院林业研究所 国家林业局林木培育重点实验室 北京 100091
摘要:测定人工气候室中培养的旱柳当年生枝条和完全展开叶片的光合色素含量,并应用蔗糖密度梯度离心法提取枝条皮层和完全展开叶片叶绿体,测定其完整性,比较分析二者光响应特性和叶绿素荧光特性的差异。结果表明:旱柳皮层叶绿素含量约是叶片的10.0%,类胡萝卜素含量约是叶片的13.7%,叶绿素a/b比值小于叶片,叶绿素/类胡萝卜素比值大于叶片;应用蔗糖密度梯度离心法可获得被膜完整率超过80%的离体叶绿体,能够满足叶绿体光合生理特性研究的需要;100,200,300,500,800 μmol·m-2s-1光强下,旱柳皮层叶绿体的光合放氧速率均低于叶片,光饱和点出现在300 μmol·m-2s-1,最大光合放氧速率为35.58 μmolO2·mg-1Chl h-1,而叶片的光饱和点在500 μmol·m-2s-1,最大光合放氧速率为42.78 μmolO2·mg-1Chl h-1;皮层叶绿体的PSⅡ最大光化学效率(Fv/Fm)平均高出叶片30.2%,PSⅡ潜在光化学活性(Fv/Fo)平均高出叶片36.1%。旱柳皮层叶绿体的光合速率和光饱和点低于叶片,皮层叶绿体表现出较高的光能转化效率、较低的叶绿素a/b比值等适应枝条内光环境的特点。
关键词旱柳    皮层    叶绿体    光合特性    
Chloroplast Photosynthetic Characteristics of Non-Leaf Photosynthetic Tissues (Cortex) of Salix matsudana
Zhang Jinyao, Liu Junxiang, Jü Guansheng, Han Lei, Sun Zhenyuan    
Key Laboratory of Tree Breeding and Cultivation of State Forestry Administration Research Institute of Forestry, CAF Beijing 100091
Abstract: In order to investigate the photosynthetic characteristics of cortex of Salix matsudana branches, this study measured the photosynthetic pigment content of current year branches and fully expanded leaves of S. matsudana cultured in artificial climate chamber. The two kinds of chloroplasts were isolated by sucrose density gradient centrifugation, and their intact rate was measured and their differences between light response characteristics and chlorophyll fluorescence characteristics were analyzed comparatively. The result showed that the chlorophyll content and carotenoid content of the cortex were approximately 10.0% and 13.7% of that from the leaf, respectively. The ratio of chlorophyll-a to chlorophyll-b in the cortex was lower than that of the leaf, and the ratio of chlorophyll to carotenoid was conversely. The intact rate of acquired chloroplasts was more than 80%, which was able to meet the needs of research on photosynthetic physiological characteristics of chloroplasts. The rate of photosynthetic oxygen evolution of cortical chloroplasts was lower than that of leaf chloroplasts all the way under the light intensity of 100, 200, 300, 500, 800 μmol·m-2s-1, respectively. The light saturation point of cortical chloroplasts was at 300 μmol·m-2s-1 with the maximum rate of photosynthetic oxygen evolution of 35.58 μmol·mg-1 Chl h-1 while the leaf was at 500 μmol·m-2s-1 with the maximum rate of photosynthetic oxygen evolution of 42.78 μmol·mg-1Chl h-1, respectively. The maximum photochemical efficiency of PSⅡ(Fv/Fm) of cortical chloroplasts was greater than that of leaf chloroplasts by 30.2% averagely, and the potential photochemical activity of PSⅡ(Fv/Fo) was greater than the leaf chloroplasts by 36.1% averagely. In summary, the photosynthetic rate and light saturation point of cortical chloroplasts of S. matsudana were lower than those of the leaves, however the cortical chloroplast had characteristics such as higher light energy conversion efficiency and lower chlorophyll a/b ratio which was adapted to the light environment within the branches.
Key words: Salix matsudana    cortex    chloroplast    photosynthetic characteristics    

光合作用为植物生长发育提供物质和能量,是植物生长发育的基础。所有暴露在光下的植物绿色组织都能进行一定的光合作用(Nilsen,1995;Aschan et al.,2003),包括叶柄、树皮、根及一些绿色的繁殖器官。许多乔木和灌木的茎枝内部含有叶绿体,发生在树木茎(枝)中的光合作用称之为树皮光合,树皮中的叶绿体主要分布在皮层中,因此又称为皮层光合(Pfanz et al.,2002)。由于茎枝中缺少气体交换的气孔,木质部运输的CO2及茎枝内部薄壁组织线粒体呼吸产生的CO2不能快速扩散,导致皮层内积累高浓度的CO2(1%~26%),为大气CO2浓度的30~750倍(Pfanz et al.,2001),造成较低的pH环境(Spicer et al.,2005)。研究发现几种树木边材的O2浓度平均为10%,而最低为3%~5%;王文杰等(2007)综合不同树种的透光率数据,70%的研究结果认为透光率在5%~15%之间,超过85%的研究结果认为透光率在0~20%之间。因此,皮层叶绿体处于高浓度CO2、低pH、低浓度O2、低强度光照的光合微环境中,其光合作用的生理机制可能与叶片叶绿体存在很大差异。旱柳(Salix matsudana)作为杨柳科(Salicaceae)柳属(Salix)植物,是我国北方平原地区重要的速生用材、农田防护及水土保持树种,生态适应性广泛,在干瘠沙地、低湿河滩、废弃矿山和盐碱地等不同立地环境均有分布。旱柳幼枝表面光滑,树皮呈绿色,且大多暴露在光下,是研究皮层光合的适宜材料。本研究以旱柳当年生枝条为材料,利用蔗糖密度梯度离心提取皮层完整叶绿体,探明其光响应、光合色素组成、叶绿素荧光等光合特性,并通过与叶片叶绿体比较,揭示皮层叶绿体对其特殊微环境的光合适应机制。

1 材料与方法 1.1 试验材料

以中国林业科学研究院种子楼东侧10年生雌性旱柳植株为母株,2013年10月15日剪取生长良好的当年生枝条作为叶片取样试材,于中国林业科学研究院科研温室内扦插培养。2013年12月25日从母株上选取已完全落叶的当年生枝条作为皮层取样试材,与温室培养的扦插苗一同置于人工气候室中,均在1/2 Hoagl and ′s营养液中培养3周,条件为:温度25 ℃,湿度50%,14 h光照/10 h黑暗,光照强度100 μmol·m-2s-1

1.2 完整叶绿体提取及完整度测定 1.2.1 完整叶绿体的提取

参考张年辉(2010)的方法取人工气候室培养的扦插苗叶片和当年生枝条树皮各15 g,分别置于400 mL含有0.3 mol·L-1Sorbitol,50 mmol·L-1Tris-HCl pH8.0,5 mmol·L-1EDTA pH8.0,0.1%BSA的等渗分离缓冲液中,匀浆,匀浆液用2层尼龙纱布过滤。采用BECKMAN低温超速离心机将滤液于4 ℃、700×g离心10 min,取上清液于4 ℃、2 000×g离心10 min,将所得沉淀悬浮于细胞器分离缓冲液中备用。用20 mL针管+12 cm穿刺针向50 mL离心管底部依次贴壁缓慢匀速注射5 mL叶绿体粗提物悬浮液;7 mL含30%蔗糖、50 mmol·L-1Tris-HCl pH8.0,25 mmol·L-1EDTA pH8.0的混合液;18 mL含52%的蔗糖、50 mmol·L-1Tris-HCl pH8.8,25 mmol·L-1EDTA pH8.8的混合液。静置分层后在4 ℃、45 000×g离心30 min,用加样枪小心吸出中间绿色条带,重新悬浮于分离缓冲液中,于4 ℃、2 000×g离心15 min,将沉淀悬浮于少量缓冲液中置于黑暗冰浴中保存。整个过程保持低温避光。

1.2.2 叶绿体被膜完整度的测定

应用Hill反应检测叶绿体被膜完整率(叶济宇等,1982),1)未胀破叶绿体的放氧速率。以1∶1体积比将含有50 mmol·L-1Tris-HCl pH7.6,5 mmol·L-1MgCl2,10 mmol·L-1NaCl,10 mmol·L-1 K3[Fe(CN)6],10 mmol·L-1NH4Cl的Hill反应液与0.8 mol·L-1Sorbitol溶液混合;加入提取的叶绿体,用液相氧电极Chllab2(Hansatech Oxygraph)测定放氧速率。2)胀破叶绿体的放氧速率。将叶绿体悬浮液与Hill反应液混合使叶绿体被膜在低渗介质下胀破,再以1∶1体积比与0.8 mol·L-1山梨醇溶液混合,在相同条件下测定放氧速率。叶绿体被膜完整率的计算公式为:

叶绿体被膜完整率(%)=(胀破叶绿体的放氧速率-未胀破叶绿体的放氧速率)/胀破叶绿体的放氧速率×100%

1.3 光合色素含量测定

取旱柳成熟叶片和当年生枝条中段树皮各0.1 g,重复3次,采用80%丙酮浸提-紫外分光光度计法(高俊凤,2006)测定,并以Arnon法(1949)计算叶绿素a、叶绿素b及类胡萝卜素含量等。

1.4 叶绿体光合活性测定

参考叶济宇等(1982)的方法,在叶绿体提取完成后立即取0.3 mL叶绿体悬浮液和1.2 mL含有50 mmol·L-1Tris-HCl pH7.6,1 mmol·L-1MgCl2,1 mmol·L-1MnCl2,2 mmol·L-1EDTA,5 mmol·L-1Na4P2O7,10 mmol·L-1NaHCO3,0.4 mol·L-1Sorbitol的放氧活力反应液混合。取0.5 mL利用1.3方法测定混合液叶绿素含量,1 mL混合液使用薄膜液相氧电极法测定光强分别为100,200,300,500,800 μmol·m-2s-1时的叶绿体光合放氧速率。叶绿体光合放氧速率计算公式为:

光合放氧速率(μmolO2·mg-1Chl h-1)=放氧速率(μmolO2·mL-1min-1)×60(min·h-1)×1 000(mL· L-1)/(叶绿素浓度(mg·L-1)

1.5 叶绿体叶绿素荧光测定

参考Pilarski(1989)的方法测定叶绿体PSⅡ叶绿素荧光。叶绿体提取完成后即取0.1 mL叶绿体提取液与0.4 mL放氧活力反应液混合,置于96孔黑色PCR板,重复3次,用Imagine-PAM调制叶绿素荧光仪(Walz,德国,Max探头),获取叶绿体叶绿素暗适应下初始荧光(Fo),最大荧光(Fm)。根据测得的参数计算可变荧光(Fv,Fv=Fm-Fo)、 PSⅡ最大光化学效率(Fv/Fm)、PSⅡ潜在光化学活性(Fv/Fo)。

1.6 数据分析

采用SPSS18.0对所得数据进行One-way ANOVA分析,采用Excel 2007进行数据整理和图表绘制。

2 结果与分析 2.1 旱柳皮层和叶片完整叶绿体提取及其完整率测定

经镜检可知处于52%蔗糖和30%蔗糖界面上的绿色条带即为完整叶绿体条带,而上方呈弧形的 条带是线粒体及破碎叶绿体的混合物,在管底还有一些细胞壁、细胞核等粗颗粒(图 1)。其中提取的旱柳叶片完整叶绿体条带较宽,颜色较深(图 1A),右侧荧光显微镜检图显示分离的叶绿体数量较多;提取的旱柳皮层完整叶绿体条带较窄,颜色较浅,右侧荧光显微镜检图显示分离的叶绿体数量较少(图 1B)。通过Hill反应测定叶片和皮层的叶绿体被膜完整率均在80%以上(表 1),能够满足叶绿体光合生理研究对样品的需求。

图 1 蔗糖密度梯度离心获得的叶片和皮层完整叶绿体层及其荧光显微镜检结果 Fig. 1 The intact layer and fluorescence microscopy results of leaf and cortical chloroplasts got by sucrose density gradient centrifugation
表 1 叶绿体完整率测定 Tab.1 Complete chloroplast for determination
2.2 旱柳皮层和叶片叶绿素含量比较

表 2可见,旱柳叶片中总叶绿素、叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量均比皮层要高且差异显著,其中皮层总叶绿素含量约为叶片的10.0%,达到0.35 mg·g-1FW;类胡萝卜素含量皮层约为叶片的13.7%,达到0.07 mg·g-1FW。叶绿素a/b值叶片稍高于皮层,两者仍呈现显著性差异,而类胡萝卜素/总叶绿素值皮层>叶片且差异显著。

表 2 叶片和皮层光合色素含量及其组成比较 Tab.2 Comparison of photosynthetic pigment content and composition between leaf and cortex
2.3 旱柳皮层和叶片完整叶绿体光响应特性比较

图 2可知,在打开光源一定时间内叶绿体放氧速率为0,处于“惰性”状态,经过光适应后叶绿体开始进行光合作用释放氧气,使得测量室氧气浓度逐渐升高,在一段时间内(图中红线标识)皮层和叶片叶绿体放氧速率均呈稳定状态。

图 2 不同光强下皮层和叶片叶绿体放氧速率比较 Fig. 2 Comparison of oxygen evolution rate between cortex and leaf chloroplasts under different light intensity A:叶片叶绿体放氧速率; B:皮层叶绿体放氧速率. 100,200,300,500,800系列数字表示光照强度 (μmol·m-2s-1),k表示所得曲线斜率即叶绿体放氧速率(μmolO2·mL-1min-1),c表示每次测试取样的叶绿素含量(mg·L-1); 蓝线表示氧电极反应室中氧气浓度随时间进行的变化轨迹,红线表示稳定的氧气浓度变化轨迹.
A: Oxygen evolution rate of leaf chloroplasts; B: Oxygen evolution rate of cortical chloroplasts. Series number 100,200,300,500,800 represent light intensity(μmol·m-2s-1); k represents the slope of the resulting curve which is chloroplast oxygen evolution rate(μmolO2·mL-1min-1); c presents chlorophyll content of each test sample(mg·L-1); the blue line shows the change track of the oxygen concentration with time in the chamber of oxygen electrode, and the red line indicates the stable track of the oxygen concentration.

根据1.4中的放氧速率计算公式由图 2推导出不同光强下旱柳皮层和叶片叶绿体光合放氧速率(图 3)。在不同光照强度下旱柳叶片叶绿体的光合放氧速率均高于皮层叶绿体,随着光照强度的增加,旱柳叶片和皮层叶绿体光合放氧速率呈先升高后降低的趋势,其中旱柳叶片叶绿体光合放氧速率在光强为500 μmol·m-2s-1时达到最大,为42.78 μmolO2·mg-1Chl h-1,皮层叶绿体在达到最大光合放氧速率35.58 μmolO2·mg-1Chl h-1时的光照强度为300 μmol·m-2s-1,皮层叶绿体光饱和点低于叶片。

图 3 旱柳皮层、叶片叶绿体的光合活性 Fig. 3 The photosynthetic activity of chloroplasts in cortex and leaf of S. matsudana
2.4 旱柳皮层和叶片完整叶绿体叶绿素荧光特性比较

旱柳皮层和叶片叶绿体光系统Ⅱ(PSⅡ)最大光化学效率(Fv/Fm)均随时间呈下降趋势,并最终趋于稳定(图 4),皮层PSⅡ的Fv/Fm始终显著高于叶片,最终稳定于0.2左右,叶片的Fv/Fm则最终稳定于0.14左右,皮层PSⅡ的Fv/Fm平均高出叶片30.2%。

图 4 皮层和叶片叶绿体PSⅡ最大光化学效率比较 Fig. 4 Comparison of PSⅡ maximum photochemical efficiency between cortex and leaf chloroplasts

图 5可见,旱柳皮层和叶片叶绿体光系统Ⅱ(PSⅡ)潜在光化学活性(Fv/Fo)均随时间呈下降趋势,并最终趋于稳定,其中皮层PSⅡ的Fv/Fo始终显著高于叶片,最终稳定于0.25左右,叶片最终稳定于0.17左右,皮层PSⅡ的Fv/Fm平均高出叶片36.1%。

图 5 皮层和叶片叶绿体PSⅡ潜在光化学活性比较 Fig. 5 Comparison of PSⅡ potential photochemical activity between cortex and leaf chloroplasts
3 结论与讨论

木本植物枝条中的叶绿体主要分布在皮层中,能利用内部呼吸释放的CO2进行光合作用(张宪省等,2003)。采用蔗糖密度梯度离心提取旱柳叶片和皮层叶绿体成本较低,避免使用昂贵的试剂和专用的设备。同时,本方法重复性好,得到的叶绿体结构完整性较高,可用于对叶绿体生理活性和功能的研究。

旱柳皮层叶绿素含量及类胡萝卜素含量远小于完全成熟展开叶片,仅为叶片的10.0%~13.7%,这与在山毛榉(Fagus sylvatica)(Damesin,2003Wittmann et al.,2001)、欧洲山杨(Populus tremula)(Aschan et al.,2001)、美洲黑杨(Populus deltoides)(Levizou et al.,2004)、大红栎(Quercus coccifera)(Levizou et al.,2004)、欧洲酸樱桃(Prunus cerasus)(Levizou et al.,2004)、草莓(Arbutus unedo)(Levizou et al.,2004)等植物中进行的研究结果一致。叶片叶绿素含量远高于皮层,说明经过对不同光合环境长期的适应,叶片相较于非叶光合组织吸收光能的能力更强,而考虑到皮层内部光照很弱,作为淬灭多余能量、保护光合系统的类胡萝卜素类物质含量少于叶片,是一种适应阴生生境的表现(Wittmann et al.,2001)。从色素组成比例来看,皮层叶绿素a/b比值低于叶片,低叶绿素a/b比值被认为是阴生适应的指标(Anderson,1986;Pearcy,1998),有利于吸收环境中的有限光能,因此皮层叶绿素a/b比值低是对非叶光合组织内光照环境的一种适应。皮层类胡萝卜素/总叶绿素比值高于叶片,后者约为前者的71.4%,可能是在高浓度CO2条件下叶绿体片层结构酸化导致光合过程中光化学猝灭能力低下,需要以叶黄素循环为主导能量猝灭光合过程,保证其功能正常(Levizou et al.,2004)。

皮层叶绿体光合放氧速率均较叶片低,叶片叶绿体相较于皮层叶绿体具有更高的实际光能转化能力。皮层叶绿体光饱和点为300 μmol·m-2s-1,低于叶片叶绿体的500 μmol·m-2s-1,可见皮层叶绿体适应了内部低光环境,在低光强下即达到光饱和。植物叶绿素荧光与植物光合作用的整个过程紧密相关,能够探测许多有关植物光合作用的信息,是光合作用研究的有效探针之一(Olaf van Kootenm et al.,1990)。本研究中叶片离体叶绿体PSⅡ最大光化学效率稳定于0.14左右,远小于正常活体检测值的0.8,可能是由于在离体叶绿体荧光测定环境中所处环境的溶剂性质、温度、pH值与叶绿体原细胞环境发生变化进而引起荧光猝灭造成的(Genty et al.,1989)。叶绿素荧光测定显示暗适应下相比叶片旱柳皮层离体叶绿体具有较高的PSⅡ最大光化学效率和PSⅡ潜在活性,分别高出叶片叶绿体30.2%和36.1%,说明皮层叶绿体PSⅡ反应中心原初光能转化效率高于叶片,这与其所处低光微环境相适应。

综上,相比于叶片,旱柳皮层叶绿体具有较低的光饱和点、光合速率、叶绿素a/b比值,较高的类胡萝卜素/叶绿素比值、PSⅡ最大光化学效率和PSⅡ潜在光化学活性,相关分析表明这些光合特性是其对所处的低光、高CO2浓度、低pH、低O2环境的适应性表现。

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